基因工程知识点总结归纳(更新版)
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基因工程
绪论
1、克隆(clone):作名词:含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。作动词:基因的分离和重组的过程。
2、基因工程(gene engineering):体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中,构成遗传物质的新组合,并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内,且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。
3、基因工程诞生的基础
三大理论基础:40年代发现了生物的遗传物质是DNA;50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理;60年代确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。
三大技术基础:限制性内切酶的发现;DNA连接酶的发现;载体的发现
3、基因工程的技术路线:切:DNA片段的获得;接:DNA片段与载体的连接;转:外源DNA片段进出受体细胞;选:选择基因;表达:目的基因的表达;基因工程的工具酶
1、限制性内切酶(restriction enzymes):主要是从原核生物中分离纯化出来的,是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列,并由此切割DNA双链的核酸内切酶。
2、限制酶的命名:属名(斜体)+种名+株系+序数
3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割
4、同裂酶:来源不同,其识别位点与切割位点均相同的限制酶。
5、同尾酶:来源不同,识别的靶序列不同,但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。
6、限制性内切酶的活性:在适当反应条件下,1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物,所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。
7、星号活性:改变反应条件,导致限制酶的专一性和酶活力的改变。
8、DNA连接酶的特点:具有双链特异性,不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA,连接反应是吸能反应,最适反应温度是4至15度,最常用的是T4连接酶。
9、S1核酸酶:特异性降解单链DNA或RNA。
10、RNAH降解与DNA杂交的RNA,用于cDNA文库建立时除去RNA以进行第二链的合成。
11、DNA聚合酶:
(1)、DNA聚合酶I:5’—3’外切酶活性、3’—5’外切酶活性,5’—3’聚合酶活性,用途:除去3’端突起。补齐5’端突起。合成cDNA第二链。切口移位探针的制备。
(2)、Klenow大片段:没有5’→3’外切酶活性,而保留了5’→3’DNA聚合酶活性和3’→5’外切酶活性。用途:用同位素标记具5’端突起的DNA片段末端。补平5’粘性末端。DNA序列测定。合成cDNA第二链。
(3)、Taq酶:75度为最适反应温度,95度仍具有稳定性,不具有外切酶活性,主要用于PCR。
12、主要修饰酶:
(1)碱性磷酸酶:除去核酸分子3’和5’端的磷酸基团。
(2)T4多聚核苷酸磷酸激酶:催化ATP中的γ位的磷酸基转移5’-OH上
(3)末端脱氧核苷酸转移酶:在3’端高效添加脱氧核苷酸。
分子克隆载体
1、分子克隆载体:是一类可供外源DNA片段插入并携带重组分子进入宿主细胞进行扩增或表达的DNA分子。
2、分子克隆载体的功能:
(1)为外源基因提供进入受体细胞的转移能力
(2)为外源基因提供在受体细胞中复制或整合的能力
(3)为外源基因提供在受体细胞中扩增和表达的能力
3、载体的分类:
(1)按用途分:克隆载体、表达载体、整合载体
(2)按来源分:原核生物载体:质粒载体、λ噬菌体载体、M13噬菌体载体、cosmid 载体、phagemid载体;真核病毒载体
4、载体的特点:
(1)至少有一个复制起点,因而至少可在一个生物体中自主复制
(2)至少有一个克隆位点,可供外源DNA插入
(3)至少有一个标记基因,以知识载体或重组DNA分子是否进入受体细胞
(4)具有较小的分子量和较高的拷贝数
5、标记基因的作用:外源基因是否插入载体分子形成重组子;外源载体是否进入宿主细胞
6、标记基因的种类:抗性标记基因;营养标记基因;生化标记基因;噬菌斑
7、常用的遗传标记基因:四环素抗性基因(Tc);氨苄青霉素抗性基因(Ap);氯霉素抗性基因(Cm);卡那霉素(Kan);新霉素(Neo);β—半乳糖甘酶基因(LacZ);葡萄糖苷酸酶基因(Gus);荧光素酶基因;发光蛋白质基因。
8、按复制起点划分克隆载体:
1)质粒复制型—复制起点来自质粒或线粒体和叶绿体(有低拷贝和高拷贝)2)ARS复制型—染色体复制型(一般拷贝数比较高)
3)病毒复制型—复制起点来自病毒,若为RNA必须反转录为cDNA(高拷贝)4)混合复制型:不同种生物复制起点混合(穿梭载体)
9、根据载体的分子生物学特性划分:质粒载体、病毒型载体、混合型载体
10、根据载体功能分类:
1)普通型载体:至少有一个以上的克隆位点和两个标记基因。如PBR322和pUC载体
2)表达型载体:3类:Ⅰ型:转录起始区(调控序列+启动子)+终止子;Ⅱ型:转录起始区+翻译起始区(核糖体结合序列和起始密码子)+终止子;Ⅲ型: 转录起始区+ 翻译起始区+ 信号肽链编码区+ 终止子(常称之为表达分泌型载体)
3)失控型质粒载体(Run-away plasmid vector):是一些低拷贝质粒,其复制控制是温度敏感型或药物敏感型,在不同温度或不同药物浓度下,质粒拷贝数会显著变化。
4)探针型载体:该类载体主要特点是含有一些特殊的DNA序列,用于特定的研究目的,如分离基因启动子、终止子、DNA复制起点等。
5)定序型载体:主要用于核苷酸的序列测定
6)整合型载体:主要用于基因治疗,稳定表达外源基因。
9、标记基因与拷贝的关系:若标记基因的表达效率较高,宿主细胞可能不大量