人乳头瘤病毒及相关治疗性疫苗研究进展

ｏｆ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｓｈａｎｇｈａｉ
Ｊｕｅｒｅｎ，Ｅｍａｉｌ：ｊｕｅｒｅｎｌｏｖ｜＠ｇｍａｉｌ．ＣＯｉｎ
ａ
［Ａｂｓｔｒａｃｔｌ
ｉｎ
Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｒｎａｖｉｒｕｓ（ＨＰＶ）ｉｓ
ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ
ｏｎ
ｌｅａｄｉｎｇ
ｃａｕｓｅ
ｏｆ ｃｅｒｖｉｃａｌ
ｃａｎｃｅｒ
重组载体疫苗是将ＨＰＶ抗原基因整合到载体 病毒ＤＮＡ中，制成重组病毒载体疫苗。这类疫苗 进入机体后，表达的内源性肿瘤抗原可以激发较强 的体液和细胞免疫应答。痘苗病毒属于痘病毒家 族，具有感染效率高和重组基因表达水平高等特性， 所以成为较早使用的病毒载体。１９９６年， Ｂｏｒｙｓｉｅｗｉｃｚ等［１２］将ＨＰＶｌ６和ＨＰＶｌ８互＇６一互７融合 基因与Ｗｙｅｔｈ病毒株重组，构建了重组痘苗病毒疫 苗（ＴＡ￣ＨＰＶ），并通过临床试验初步确定了这种疫 苗的效果。法国Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ公司的ＴＧ４００１疫苗设 计思路与此类似，但加入了ＩＬ－２作为佐剂以增强免 疫应答。临床试验表明，这种疫苗能有效激发特异 性细胞毒性免疫应答，有效性和安全性都有保 障‘１３］。 Ｅ２蛋白涉及病毒生命周期各个阶段，表达于所 有癌前病变。早期感染中，增加Ｅ２的表达可增强 其抗原性，晚期感染中Ｅ２的表达又可诱导细胞凋 亡，所以Ｅ２也成为治疗性疫苗的理想靶点，相关疫 苗报道最多的是牛乳头瘤病毒（ｂｏｖｉｎｅ
ＨＰＶｌ６和ＨＰＶｌ８ Ｅ６、Ｅ７的质粒ＤＮＡ包裹到可
生物降解颗粒中，输人体内时，颗粒可增强免疫原 性。临床试验表明，该疫苗对于年轻ＣＩＮ患者有明 显的治疗效果，７０％的患者病变都有所消退，并且此 疫苗覆盖了ＨＰＶｌ６和ＨＰＶｌ８ ２个高危亚型［２７１。
２．４．２
苗，以Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ－５１为佐剂对晚期宫颈癌患者 进行治疗，结果显示该疫苗有很好的耐受性，并诱导 ＩＦＮ－７相关的Ｔ细胞应答。 ２．３．２蛋白疫苗蛋白疫苗是将体外表达的抗原 蛋白（如Ｅ６、Ｅ７）直接接种机体，诱生特异性免疫应 答。蛋白疫苗克服了多肽疫苗的ＭＨＣ限制性问 题，安全性比活载体疫苗高，所以有关增强免疫原性 的疫苗设计方法也较多。 ＴＡ－ＧＷ是ＨＰＶ６ Ｅ７与Ｌ２的融合蛋白， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等胁］对２７例男性生殖器疣患者免疫 后，绝大部分患者体内产生了Ｔ细胞应答，少数患 者症状完全消失。ＴＡ－ＣＩＮ是ＨＰＶｌ６ Ｅ６、Ｅ７、Ｌ２ 三者的融合蛋白∞］，ＴＡ－ＣＩＮ在４０名健康志愿者 中显示了很好的免疫原性，没有诱发不良反应。但 是在同一临床试验中接种者体内则会产生针对Ｌ２ 的免疫应答，大部分接种者产生抗ＨＰＶｌ６ 的Ｔ细胞免疫应答。
答也较弱。
ＨＰＶ的致病机制 目前认为ＨＰＶ的致病机制是Ｅ６、Ｅ７蛋白分别
与相应的抑癌蛋白结合，使细胞周期滞留在Ｓ期，而 病毒基因组因酶解断裂，部分ＤＮＡ片段随机插入 细胞基因组中，残余的ＨＰＶ基因组中Ｅ２基因失 活，失去对Ｅ６、Ｅ７基因的转录调控，使Ｅ６、Ｅ７蛋白 持续表达，维持细胞的恶性表型［１ ０｜，造成癌变。
１．４
ＨＰＶ的基础研究新进展 继ＨＰＶｌ６和ＨＰＶ３１的转录图谱被构建后，
Ｗａｎｇ等［１１１于２０１０年用ＨＰＶｌ８感染的大鼠组织， 构建出ＨＰＶｌ８的全转录图谱，鉴定出在ＨＰＶｌ８ Ｅ 蛋白ＯＲＦ的启动子Ｐ５５，以及在Ｅ７ ＯＲＦ区域的Ｌ 蛋白启动子，这项新突破将会为研究ＨＰＶｌ８这一 仅次于ＨＰＶｌ６的高危亚型的分子生物学和病理学 提供坚实的基础，对ＨＰＶｌ８相关疾病的预防及治 疗都有重要意义。 ２治疗性ＩＩＰＶ疫苗 ２．１重组病毒载体疫苗 万方数据
・７７・
・综述・ 人乳头瘤病毒及相关治疗性疫苗研究进展
邝林林综述楼觉人审校
【摘要】人乳头瘤病毒（ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ）；Ｉ叠诱发宫颈癌、导致女性死亡的主要原因。 随着对ＨＰＶ的基因结构、主要表达蛋白及致病机制的深入研究，多种不同类型的相关疫苗已进行了动 物实验或临床试验。此文对ＨＰＶ相关疫苗的设计思路和研究进展做一综述。 【关键词】乳头状瘤病毒疫苗；人乳头瘤病毒１６；人乳头瘤病毒１８；宫颈肿瘤 Ｒｅｒ黝ａ－ｄａ
ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ

ｈｍ ｌｍｐｉｌｉｏｍａｖｉｒ憾ａｎｄ
ｔｈｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｅｓ
Ｋｕａｎｇ Ｌｉｎｌｉｎ，Ｌｏｕ
Ｊｕｅｒｅｎ．Ｎｏ．２ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
２０００５２，Ｃｈｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：Ｌｏｕ
ｏｒ
ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒａｉｌｓ．Ｔｈｉｓ ｒｅｖｉｅｗ
ｓｕｍｍａｒｉｚｅｓ ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ
ｐｒｏｇｒｅｓｓ
ｏｆ ＨＰＶ
ｄｅｓｉｇｎ ｉｄｅａ ｏｆ ｔｈｅ
ｒｅｌａｔｅｄ
ｖａｃｃｉｎｅｓ．
［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓｌ
Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅｓ；Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ １６；Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｒｎａｖｉｒｕｓ １８；
ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｄｅａｔｈ
ｗｏｍｅｎ．Ｗｉｔｈ
ｇｅｎｅ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｒｉｍａｒｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ
ＨＰＶ。ｓｅｖｅｒａｌ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ
ｓｔｕｄｉｅｄ ａｎｄ
ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
用ＨＰＶｌ６ Ｅ６和Ｅ７蛋白的全序列长肽制成多肽疫
利用位点突变，降低曰的活性，提高ＤＮＡ疫苗的
安全性；（２）在下游引入Ｈ－２Ｄｂ和ＨＩＡ－Ａ＋０２０１表 位，同时Ｅ７基因分为３段，每段２个重复串联起 来，明显增强了疫苗的免疫原性。ＨＰＶ阳性小鼠实 验表明，其能够显著增强ＣＴＬ溶解靶细胞的作用。 ＺＹＣｌ０１ａ（现称为Ａｍｏｌｉｍｏｇｅｎｅ）疫苗是将编码
１．３
ｖｉｒｕｓ，ＢＰＶ）Ｅ２基因插入修饰的Ａｎｋａｒａ株痘苗病 毒（ＭＶＡ）得到的重组病毒株ＥＶＡ
Ｅ２。
Ｇａｒｃｉａ—Ｈｅｒｎｄｎｄｅｚ等［１４］对３４例女性宫颈上皮内瘤
变（ＣＩＮ）２、３级患者使用ＭＶＡ Ｅ２重组病毒疫苗治
疗，所有患者的ＣＩＮ症状都有不同程度减轻，均产 生抗ＭＶＡ Ｅ２疫苗的抗体和抗ＨＰＶ转化细胞的 特异性ＣＴＬ应答，患者病毒载量显著降低。 Ａｌｂａｒｒａｎ Ｙ Ｃａｒｖａｊａｌ等［１５］将ＭＶＡ Ｅ２疫苗用于治 疗男性尿道内扁平湿疣患者的高危型ＨＰＶ感染， 也取得了良好的治疗效果。 痘苗病毒的缺陷之一是会刺激机体产生针对衣 壳蛋白的中和抗体。最近研究发现，临床抗癌药物 环氧化酶２抑制剂Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ可抑制抗痘苗病毒中 和抗体的产生［１６］，与痘苗病毒载体疫苗联用，会有 更好的临床效果。 腺病毒载体可以插入大片段外源基因，制成高 滴度病毒颗粒，以此为载体的疫苗也有报道［１ ７‘，但 是其肿瘤抗原的表达较痘苗病毒低，激发的免疫应
调控序列，见图１。
１．２
ＨＰＶ蛋白
作者单位：２０００５２上海生物制品研究所有限责任公司第二研究 室 通信作者：楼觉人，Ｅｍａｉｌ：ｊｕｅｒｅｎｌｏｕ＠ｇｍａｉｋ ｃｏｍ
Ｅ蛋白与ＨＰＶ的生命活动、繁殖和感染密切 相关，对其各自功能也有较为深入的研究。 ＨＰＶ感染早期合成的Ｅ１、Ｅ２蛋白是病毒
万方数据
・７８・
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｒｎａ．ｊ．ｉｓｓｒＬ
１６７３－４２１１．２０１５．０２．００６
ｇｉｏｎ，ＮＣＲ），Ｅ区从５’端依次为Ｅ６、Ｅ７、Ｅ１、Ｅ２、 Ｅ４、Ｅ５蛋白的ｏＲＦ。Ｌ区在Ｅ区的下游，编码Ｌ１
和Ｌ２。ＬＣＲ长约８５０ ｂｐ，没有编码功能，但是包含
病毒ＤＮＡ复制与转录因子的结合位点，是重要的
Ｅ７引发的移植瘤消退。Ｓｅｗｅｌｌ等［１９］将
Ｅ７和ＬＬＯ蛋白靠近Ｎ端１９个氨基酸序列
（富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸）组成的融合 蛋白转入减毒单核细胞增多性李斯特菌中，构建的 重组疫苗也能激发机体的免疫应答。但是这类疫苗 会引发较强的不良反应。 ＢＣＧ广泛用于预防结核病，也是有效的免疫调 节剂。国内外不少科研人员以此为载体开发宫颈癌 疫苗，但是以ＢＣＧ为载体的疫苗在体内表达抗原的 水平很低，不能有效诱导特异性抗体和ＣＴＬ应答。 目前较有前景的细菌载体疫苗为安全性和免疫 原性都较好的乳酸菌载体疫苗［２０。，但是尚无临床研 究报道。 ２．３多肽与蛋白疫苗 ２．３．１多肽疫苗多肽疫苗是根据免疫应答中树 突状细胞（ＤＣ）获取的多肽或者ＭＨＣ分子提呈的 多肽抗原结构设计的，易于制备，安全稳定。但是其 免疫原性弱，且具有ＨＬＡ限制性。Ｋｅｎｔｅｒ等［２１］选
ｐａｐｉｌｌｏｍａ—
１５０个氨基酸组成，包括２个Ｃ地Ｃ－Ｘ２９～ＣＸ２Ｃ锌
指结构，由一３６个氨基酸组成的外结构域连接肽相 连，可与Ｐ５３等多个信号转导相关因子结合［８］。 Ｅ７蛋白的相对分子质量为１８ ０００～２０ ０００，由 ９７个氨基酸组成，Ｎ端有３７个氨基酸，包含ｐＢＲ 结合位点及信号转导和降解ｐＢＲ的结构，与细胞代 谢和死亡相关［９］。Ｃ端包含与Ｅ６蛋白相似的２个 各由２９个氨基酸组成的锌指结构，与细胞信号转导 密切相关。
ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，
ＨＰＶ）是宫颈癌的主要致病因素，约９９．７％的宫颈 癌都与ＨＰＶ感染有关［１］。ＨＰＶ是严格嗜上皮病 毒，主要感染皮肤和黏膜上皮组织的基底细胞，人是 其唯一的宿主。因此，研究ＨＰＶ的生物学特征和 致病机制，并开发相应的疫苗，是预防宫颈癌的重要 手段。 多项研究证明，ＨＰＶ导致细胞癌变主要与其早 期（Ｅ）蛋白，尤其是Ｅ５、Ｅ７的持续表达有关。在浸
ｅｒｉｏｌｙｓｉｎ，ＬＬＯ）的ＨＰＶｌ６ Ｅ７融合蛋白，能使７５％
ＨＰＶｌ６ ＨＰＶ
休克蛋白６５与ＨＰＶｌ６ Ｅ７蛋白融合所得［２５｜，可增 强对Ｅ７蛋白的抗原提呈，同时配合Ｐｏｌｙ－ＩＣＬＣ佐 剂治疗ＣＩＮ，能增强免疫应答，阻止病灶扩大，有望 控制病情恶化。 ２．４核酸疫苗 ２．４．１ ＤＮＡ疫苗ＤＮＡ疫苗是将病毒抗原ＤＮＡ 插人真核表达质粒载体，形成重组质粒后，直接注入 体内，抗原基因会在体内持续表达，刺激机体产生较 强的免疫应答。 Ｂｒｉｎｋｍａｎ等［２６］构建了真核表达质粒Ｅ７ＩＲ。 针对ＤＮＡ疫苗的缺陷，分别采取了以下措施：（１）
ｃｏｎｔｒｏｌ
ｒｅｇｉｏｎ，ＬＣＲ）或者非编码区（ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ
ｒｅ—
已有预防性ＨＰＶ疫苗上市，但由于预防性疫苗的 靶抗原来自ＨＰＶ的主要衣壳蛋白Ｌ１和次要衣壳 蛋白Ｌ２，而在病毒感染后期这些蛋白基因会丢 失［２引，所以预防性疫苗不具有治疗效果。综合两方 面因素，Ｅ蛋白成为治疗宫颈癌的最重要靶点，以此
圄匾生丝剑虽堂盘查垫！！堡！旦箜塑鲞箜！塑！坐』堡！！！ｇｉ望！！！垒Ｐ巫！！！！！！ｙ！！：！！！盟！：；
ＤＮＡ复制的基础。Ｅ１蛋白调控病毒基因转录，失 活后会使病毒基因组插入到宿主染色体。Ｅ２蛋白 的相对分子质量为４２ ０００，由３６５个氨基酸残基组 成，Ｃ端为ＤＮＡ结合域，Ｎ端为转录活化结构域。 Ｅ２为ＤＮＡ结合蛋白，可控制病毒ＤＮＡ复制、转 录，细胞周期进程、凋亡、衰老及病毒基因稳定和分 离［４］。在ＨＰＶ感染细胞中，Ｅ２蛋白通过与Ｅ６、Ｅ７ 启动子上特异的ＤＮＡ序列结合，下调Ｅ６、Ｅ７癌基 因的表达，抑制其致癌作用。 Ｅ４蛋白通过阻止染色体复制起始，抑制细胞 ＤＮＡ合成，从而阻断细胞从Ｇ２期向Ｍ期过渡［５］， 改变线粒体功能，促使细胞凋亡［６］。 Ｅ５蛋白的功能目前还未完全确定，不完全排除 它有单独致癌的作用，已知它有协同Ｅ６、Ｅ７蛋白的 作用‘７｜。 Ｅ６蛋白的相对分子质量为１６ ０００～１９ ０００，由
２．２重组细菌载体疫苗 细菌载体疫苗是将编码抗原的ＤＮＡ片段通过 重组质粒插入减毒病原菌或共生菌中所得到的重组 疫苗。目前常用的细菌载体有单核细胞增多性李斯 特菌、沙门菌、ＢＣＧ、乳酸乳球菌、植物乳杆菌等。
・７９・
Ｇｕｎｎ等［１胡构建的重组单核细胞增多性李斯特 菌疫苗，能分泌表达融合有李斯特菌溶血素Ｏ（１ｉｓｔ—
Ｕｔｅｒｉｎｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ
宫颈癌是世界范围内妇女主要的致命疾病之
一，每年新增约４９３ ０００个病例，造成２７３ ０００例患
为靶点的疫苗是目前主要的研究方向。除此之外， 随着对ＨＰＶ致病机制的深入研究，与ＨＰＶ感染相 关的其他因子也有望成为新的治疗靶点。
１ １．１
者死亡。人乳头瘤病毒（ｈｕｍａｎ
润性宫颈癌中，均能检出ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７蛋白。目前
ＨＰＶ的基本特征
ＨＰＶ的基因结构 ＨＰＶ是一类小分子ＤＮＡ病毒，基因组的结
构、组成及基因表达都高度保守。基因组大小约为
８ ０００
ｂｐ，为双链闭合环状ＤＮＡ分子，包含８个开
放阅读框（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ，ＯＲＦ），都是由ＤＮＡ 双链中的同一条链为模版进行转录。基因组按功能 分为３个区域：Ｅ区、晚期（Ｌ）区、长控制区（１０ｎｇ－