第六章固定化酶
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酶工程 第六章酶与细胞固定化 第二节酶和菌体固定化
第二节 酶和菌体固定化
半透膜包埋法制成的固定化酶小球，直径—般只有几 ㎛至几百㎛，称为微胶囊。制备时，—般是将酶液分散在 与水互不相溶的有机溶剂中，再在酶液滴表面形成半透膜， 将酶包埋在微胶囊之中。例如：将欲固定化的酶及亲水性 单体(如已二胺等)溶于水制成水溶液，另外将疏水性单体 (如癸二酰氯等)溶于与水不相混溶的有机溶剂中，然后将 这两种互不相溶的液体混和在一起，加入乳化剂（如司盘 -85等）进行乳化，使酶液分散成小液滴，此时亲水性的 已二胺与疏水住的癸二酰氯就在两相的界面上聚合成半透 膜，将酶包理在小球之内。再加进吐温-20(Tween-20)， 使乳化破坏，用离心分离即可得到用半透膜包埋的微胶囊 型的固定化酶。
第二节 酶和菌体固定化
用离子键结合法进行酶固定化，条件温和，操作简便。 只需在一定的pH值、温度和离子强度等条件下，将酶液 与载体混合搅拌几个小时，或者将酶液缓慢地流过处理好 的离于交换柱，就可使酶结合在离于交换剂上，制备得到 固定化酶。例如：将处理成-OH型的DEAE-葡聚糖凝胶加 至含有氨基酰化酶的0.1mo1/L的pH7.0磷酸缓冲液中，于 37℃条件下，搅拌5h，氨基酰化酶就可与DEAE-葡聚糖 凝胶通过离子键结合，制成固定化氨基酰化酶。或者将处 理过的DEAE-葡聚糖凝胶装进离子交换柱，用氢氧化钠处 理，使之成为-OH型，用无离子水冲洗，再用pH 7.0的 0.1mo1/L磷酸缓冲液平衡备用。另将一定量的氨基酰化酶 溶于pH7.0的0.1mol／L磷酸缓冲液中配成一定浓度的酶液， 在37℃的条件下，让酶液慢慢流过离子交换柱，就可制备 成固定化氨基酰化酶。用于拆分乙酰—DL—氨基酸，生 产L—氨基酸
酶工程
第六章 酶与细胞固定化
第二节 酶和菌体固定化
将酶与水不溶性的载体结合，制备固定化酶的过程称 为酶的固定化。
《酶的固定化》PPT课件
第一节 酶固定化
定义 酶的固定化:将酶和菌体与不溶性载体结合的过程; 固定化酶:在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续 进行反应，反应后的酶可回收重复使用; 概念发展
“水不溶酶”（water insoluble enzyme) “固相酶”（solid phase enzyme)
1971年第一届国际酶工程会议正式采用“固定化酶（immobi lized enzyme)”
• 1、吸附法(link) • 2、包埋法(link) • 3、结合法(link) • 4、交联法(link) • 5、热处理法(link)
酶固定化方法示意图
吸附法 用固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使其固定的方法; 固体吸附剂:活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等; (1)操作简单，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，可反复使用; (2)物理吸附结合能力弱，酶与载体结合不牢固易脱落.
(2)产物酸碱性对最适pH值的影响
酸性:固定化酶的最适pH值比游离酶的高 碱性:固定化酶的最适pH值比游离酶的低 中性:固定化酶的最适pH值一般不变 原因:载体障碍产物的扩散
(back)
底物的特异性
与底物分子量的大小有关; 作用于低分子量底物的酶，没有明显变化，如氨基 酰化酶、葡聚糖氧化酶等; 既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的 酶，往往会发生变化。如，固定在羧甲基纤维素上 的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对 酶蛋白的作用仅为游离酶的3%左右 原因:载体的空间位阻作用
Relative activity (%)
100
80
60
A
B 40
20
0 30 40 50 60 70 80 90 Temperature ( 篊 )
固定化酶
⑧充分考虑到固定化酶制备过程 和应用过程中的安全因素。
固定化载体的选择标准
① 载体的形式 ② 载体的结构 ③ 载体的性质
④ 酶偶联量或装载量和实效系数
二、固定化酶的制备方法
结晶法 分散法 物理吸附法 离子结合法 网格法
非化学结合法
包埋法
微囊法 交 联 法
化学结合法
共价结合法
1、物理吸附法
(physical adsorption)
第一节
第二节
酶的固定化
辅酶的固定方法
第三节
第四节
固定化细胞
固定化酶的性质及其影响因素 Nhomakorabea
第五节
固定化酶催化反应动力学
对于现代工业来说，酶不是一种理想的 催化剂
绝大多数水溶性的酶，酶蛋白对外界环境很敏 感，极易失活。催化结束后极难回收，只能进 行分批生产。
解决办法??
第一节
酶的固定化
一、固定化酶（Immobilized Enzyme）
定义：是指在一定空间内呈闭锁状态存在的 酶，能连续地进行反应，反应后的酶可回收 重复使用。
固定化酶的优缺点
固定化酶优点：
(1)简化了提纯工艺 (2)可以装塔连续反应
固定化酶缺点：
①酶活力有损失 ②工厂初始投资大 ③只能用于可溶性底物， 对大分子底物不适宜 ④与完整菌体相比，需 要辅助因子的催化反应 不适宜于多酶反应
法条件温和，酶失活少，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很 麻烦。作为膜材料的高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基 丙烯酸甲酯等。
界面聚合法
化学方法。将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合， 形成半透膜，将酶包埋于半透膜微囊中。所得的微 囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程中 发生化学反应而失活。
食品化学-06酶
（2）酸处理法 ） • 多数酚酶最适 ＝6～7，PH < 3失活。 多数酚酶最适PH＝ ～ ， 失活。 失活 • 常用的酸有：柠檬酸、苹果酸、磷酸、抗坏血酸、混合酸。 常用的酸有：柠檬酸、苹果酸、磷酸、抗坏血酸、混合酸。 • 柠檬酸可降低 ，还可络合酚酶辅基 2+，但单独用效果不大。常 柠檬酸可降低pH，还可络合酚酶辅基Cu 但单独用效果不大。 与抗坏血酸、亚硫酸合用。 与抗坏血酸、亚硫酸合用。 • 实践证明：0.5%柠檬酸 + 0.3%抗坏血酸效果好。 实践证明： 抗坏血酸效果好。 柠檬酸 抗坏血酸效果好 • 抗坏血酸还可使酚酶失活，且可耗氧。 抗坏血酸还可使酚酶失活，且可耗氧。
5
酶的固定方法 2. 共价连接
利用酶与载体形成共价键固定酶 此法载体与酶结合牢固、半衰期长。 此法载体与酶结合牢固、半衰期长。 形成共价键的反应剧烈，常常引起酶蛋白高级结构发生变化， 形成共价键的反应剧烈，常常引起酶蛋白高级结构发生变化，因 此酶活力回收一般较低。 此酶活力回收一般较低。 共价结合法使用的载体主要有： 共价结合法使用的载体主要有： 纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳素及其衍生物、 纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳素及其衍生物、氨基酸 共聚物、甲基丙烯酸（或醇）共聚物、多孔玻璃等。 共聚物、甲基丙烯酸（或醇）共聚物、多孔玻璃等。
17
b．钙离子激活中性蛋白酶 分离出两种：CANPⅠ和CANPⅡ 分离出两种：CANPⅠ和CANPⅡ 都是二聚体 都是二聚体 含有相同的较小亚基（MW=30,000）和较大的亚基（MW=80,000， 含有相同的较小亚基（MW=30,000）和较大的亚基（MW=80,000，免疫性 质不同）。 ）。 质不同）。 完全激活：50～ μmol/L CANP I 完全激活：50～100 μmol/L Ca2+ 的激活： mmol/L CANP II 的激活：1～2 mmol/L Ca2+ 活性部位中含有半胱氨酸残基的巯基，被归属于巯基蛋白酶 活性部位中含有半胱氨酸残基的巯基， CANPS的作用 CANPS的作用 • 通过分裂特定的肌原纤维蛋白质影响肉的嫩化 • 同溶菌体蛋白酶协同作用 • 死后僵直的肌肉缓慢松弛，这样产生的肉具有良好的质构 死后僵直的肌肉缓慢松弛，
固定化酶
1.2 脂肪酶的研究与应用1.2.1 脂肪酶的研究概况脂肪酶可以根据其来源分类，分为微生物脂肪酶、动物脂肪酶和植物脂肪酶。
脂肪酶可以很容易地从微生物真菌（如南极洲假丝酵母）或细菌（如荧光假单胞菌）中通过发酵过程高产量地生产出来，其过程缺乏基本的净化步骤。
一些脂肪酶表现出对底物的位置专一性，而另一些则不然。
对不同来源的游离脂肪酶类型的比较研究表明，荧光P.脂肪酶具有最高的酶活性。
通常，来自真菌来源的脂肪酶比来自细菌来源的脂肪酶表现出更好的甘油三酯酯交换活性。
作为一种多功能生物催化剂，脂肪酶具有其他酶蛋白无法比拟的优点[15]：1、在有机溶剂中具有良好的稳定性；2、催化过程不需要辅助因子，一般不发生副反应；3、可以催化水解，酯化，酯交换等众多反应[16]；4、具有独特的化学选择性、区域选择性及立体选择性；5、底物谱广，可催化非天然底物进行反应。
与动植物脂肪酶相比，微生物脂肪酶生产周期短，分离纯化相对简单，并可利用基因工程和蛋白质工程等技术实现酶的改造并构建生产工程菌[17]，适合工业化生产与应用。
1994年，丹麦Novozymes公司首次应用基因工程菌生产来源于Thermomyces lanuginosus的脂肪酶Lipolase，此后许多来源于微生物的脂肪酶也实现了商业化生产[18]。
脂肪酶的应用领域日益扩大，被广泛运用于生物柴油、食品加工、面粉改良、造纸造酒、有机合成等化工领域[19]。
1.2.2 脂肪酶的结构及催化机制脂肪酶是一类重要的水解酶，催化三酰甘油酯中酯键的裂解，具有广泛的生物技术应用价值。
脂肪酶是在人体内正确分配和利用油脂所必需的酶。
脂蛋白脂肪酶(LPL)在毛细血管中很活跃，它通过水解包装脂蛋白中的甘油三酯，在防止血脂异常方面起着至关重要的作用。
30年前，有人提出了一种不活泼的LPL低聚物的存在。
M., Tushar Ranjan (2020)指出天然油中高浓度的omega - 3脂肪酸(ɷ-3 FAs)对于维持身体健康非常重要。
2011酶工程 第六章 固定化酶与固定化细胞
(2)固定化使酶和细胞的使用率提高
江南大学的孙志浩通过卡拉胶 包埋的方法，使酶的重复利用 30个批次后活性没有明显减少， 大大促进了酶的利用率，加速 了工艺工业化进程．
(3)可精简产物分离工序
底物和产物更容 易和酶分离
固定化酶也存在一些缺点
酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化 的成本，使工厂开始投资大。
(2) 共价结合法
借助共价键将酶的活性非必须侧 链基团或细胞表面基团（如氨基、 羧基、羟基、巯基、咪唑基等） 和载体的功能基团进行偶联以达 到固定化目的方法。 此法得到的固定化酶结合牢固、 稳定性好、利于连续使用，因此 它是目前应用最多的一类固定化 酶的方法。
共价偶联法的优点、缺点
共价偶联法的优点：得到的固定化酶结合牢固、 稳定性好、利于连续使用。 共价偶联法的缺点：载体活化的操作复杂，反应 条件激烈，需要严格控制条件才可以获得较高活 力的固定化酶。同时共价结合会影响到酶的空间 构象，从而对酶的催化活性产生影响。
B 叠氮法
用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶， 步骤如下： 酯化 肼解 叠氮化 偶联
与酶中的氨基、羟基、巯基反应。
此反应适用于含羟基、羧甲基等的载体，如CM—纤维素、
葡聚糖、聚氨基酸、乙烯 — 顺丁烯二酸酐共聚物等。以羧甲 基纤维素为例，可先在酸等作用下转变为叠氮衍生物，这种 产物能在低温、pH 7.5—8.5 的情况下和酶的氨基直接偶联。 但叠氮衍生物也能和羟基、酚羟基或巯基反应。
E ．溴化氰法
与酶中的氨基反应
F 异硫氰酸法
含芳香氨基的载体也可先用硫光气处理成异硫氰酸 (或异氰
酸)盐的衍生物，这样得到的产物极易在温和条件下和酶分
子的氨基反应。由于在中性pH条件下优先和α-氨基反应， 因此可进行选择性偶联。 （见示意图）
第六章固定化酶
为碱性时，由于它的积累使固定化酶催化区 域的pH升高，故此使固定化酶的最适pH比游 离酶的最适pH要低一些。
固定化酶最适温度的变化
一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化
Eg：用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其 作用的最适温度比游离酶高5—10
以共价结合法固定化的色氨酸酶，其最适温度比游离酶高
50
迄今已有许多酶用离子结合法固定化， 例如1969年最早应用于工业生产的固定化氨基 酰化酶就是使用多糖类阴离子交换剂DEAE-葡 聚糖凝胶固定化的。
51
DEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶： 将DEAE-SephadexA25充分溶胀，用0.5mol/LNaOH 和水洗涤后，加入pH7.0—7.5的米曲霉3042粗酶液( 水解乙酰—DL-Ala活力为25umol/m1·h)充分混合(1g 湿重载体加60ml酶液)后，于低温下搅拌过夜后，吸 去上清液，再用蒸馏水和0.15mol/L醋酸钠水溶液洗 涤固定化酶，置4℃备用。
固定化酶作用的最适温度可能会受到固定方法和固定化载 体的影响。
5． 底物特异性变化
固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同， 其变化与底物相对分子质量的大小有一定关系。
作用于小分子底物的酶
特异性没有明显变化
既可作用于小分子底物又可作用于大分子底物的酶 特异性往往会变化。
Eg：胰蛋白酶：高分子蛋白、低分子（二肽、多肽），固定在羧甲基 纤维素上，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酪蛋白的作用仅为游 离酶的3%；
第六章固定化酶?第一节概述?第二节固定化酶的制备?第三节固定化酶的性质及其影响因素?第三节固定化酶的性质及其影响因素?第四节固定化细胞?第五节固定化辅酶和原生质体?第六节固定化酶细胞的应用生物催化剂细胞酶非生长生长可溶固定化悬浮固定化连续间歇间歇吸附包埋交联化学连续材料材料膜固定膜固定酶液固定化再循环系统再循环系统连续连续间歇间歇间歇间歇第一节概述固定化酶的发展史凝胶吸附化学连接物凝胶吸附半连续分批连续活塞模式搅拌连续反应器连续活塞模式搅拌连续反应器图61生物催化剂作用方式示意游离酶在使用过程中不足之处
固定化酶最适温度的变化
一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化
Eg：用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其 作用的最适温度比游离酶高5—10
以共价结合法固定化的色氨酸酶，其最适温度比游离酶高
50
迄今已有许多酶用离子结合法固定化， 例如1969年最早应用于工业生产的固定化氨基 酰化酶就是使用多糖类阴离子交换剂DEAE-葡 聚糖凝胶固定化的。
51
DEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶： 将DEAE-SephadexA25充分溶胀，用0.5mol/LNaOH 和水洗涤后，加入pH7.0—7.5的米曲霉3042粗酶液( 水解乙酰—DL-Ala活力为25umol/m1·h)充分混合(1g 湿重载体加60ml酶液)后，于低温下搅拌过夜后，吸 去上清液，再用蒸馏水和0.15mol/L醋酸钠水溶液洗 涤固定化酶，置4℃备用。
固定化酶作用的最适温度可能会受到固定方法和固定化载 体的影响。
5． 底物特异性变化
固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同， 其变化与底物相对分子质量的大小有一定关系。
作用于小分子底物的酶
特异性没有明显变化
既可作用于小分子底物又可作用于大分子底物的酶 特异性往往会变化。
Eg：胰蛋白酶：高分子蛋白、低分子（二肽、多肽），固定在羧甲基 纤维素上，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酪蛋白的作用仅为游 离酶的3%；
第六章固定化酶?第一节概述?第二节固定化酶的制备?第三节固定化酶的性质及其影响因素?第三节固定化酶的性质及其影响因素?第四节固定化细胞?第五节固定化辅酶和原生质体?第六节固定化酶细胞的应用生物催化剂细胞酶非生长生长可溶固定化悬浮固定化连续间歇间歇吸附包埋交联化学连续材料材料膜固定膜固定酶液固定化再循环系统再循环系统连续连续间歇间歇间歇间歇第一节概述固定化酶的发展史凝胶吸附化学连接物凝胶吸附半连续分批连续活塞模式搅拌连续反应器连续活塞模式搅拌连续反应器图61生物催化剂作用方式示意游离酶在使用过程中不足之处
郭勇酶工程(第三版)第六章固定化酶
Chapter 6
Immobilized Enzyme
第六章 固定化酶和固定化细 胞、原生质体
制作：郑穗平
酶催化的优点 ——作为一种生物催化剂，酶参与生物 体内的各种代谢反应，具有专一性强、 催化效率高及作用条件温和等优点。
酶应用过程中的一些不足
酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如α-淀粉酶、Taq酶等；和 胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在高温、强酸、 强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。 酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系 统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力， 也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高， 而且难于连续化生产。 产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给 产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。
（5）聚丙烯酰胺凝胶包埋法 先配臵一定浓度的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺 （N,N‘-甲叉双丙烯酰胺，别名MBA，又叫亚甲基双丙烯酰胺，次甲基双丙烯酰
胺，N,N’-甲撑双丙烯酰胺。是一种白色晶体粉末，无味，吸湿性极小。遇高温
与一定量的酶液等混合 均匀后加入一定量的过硫酸钙和四甲基乙二 胺，混合后让其静臵聚合即可获得。 优点：机械强度高，可调节凝胶孔径 缺点：丙烯酰胺单体有毒性
将一定量的角叉菜胶悬浮于一定体积的水 中，加热溶解。灭菌后冷却到30-50°C， 与一定量的酶液等混合均匀后，趁热滴到 预冷的氯化钾溶液中，或者先滴到冷的植 物油中，成型后再臵于氯化钾溶液中的到 球状固定化颗粒。 优点：通透性能好，对细胞无毒害。
（4）明胶包埋法 将一定量的明胶悬浮于一定体积的水中， 加热溶解。灭菌后冷却到35°C以上，与一 定量的酶液等混合均匀后制成所需形状的 胶粒。机械强度不够可用戊二醛等双功能 试剂交联。
Immobilized Enzyme
第六章 固定化酶和固定化细 胞、原生质体
制作：郑穗平
酶催化的优点 ——作为一种生物催化剂，酶参与生物 体内的各种代谢反应，具有专一性强、 催化效率高及作用条件温和等优点。
酶应用过程中的一些不足
酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如α-淀粉酶、Taq酶等；和 胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在高温、强酸、 强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。 酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系 统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力， 也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高， 而且难于连续化生产。 产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给 产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。
（5）聚丙烯酰胺凝胶包埋法 先配臵一定浓度的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺 （N,N‘-甲叉双丙烯酰胺，别名MBA，又叫亚甲基双丙烯酰胺，次甲基双丙烯酰
胺，N,N’-甲撑双丙烯酰胺。是一种白色晶体粉末，无味，吸湿性极小。遇高温
与一定量的酶液等混合 均匀后加入一定量的过硫酸钙和四甲基乙二 胺，混合后让其静臵聚合即可获得。 优点：机械强度高，可调节凝胶孔径 缺点：丙烯酰胺单体有毒性
将一定量的角叉菜胶悬浮于一定体积的水 中，加热溶解。灭菌后冷却到30-50°C， 与一定量的酶液等混合均匀后，趁热滴到 预冷的氯化钾溶液中，或者先滴到冷的植 物油中，成型后再臵于氯化钾溶液中的到 球状固定化颗粒。 优点：通透性能好，对细胞无毒害。
（4）明胶包埋法 将一定量的明胶悬浮于一定体积的水中， 加热溶解。灭菌后冷却到35°C以上，与一 定量的酶液等混合均匀后制成所需形状的 胶粒。机械强度不够可用戊二醛等双功能 试剂交联。
固定化酶技术
1.4交联法 交联法是用多功能试剂进行酶蛋白 之间的交联，使酶分子和多功能试 剂之间形成共价键，得到三向的交 联网架结构，除了酶分子之间发生 交联外，还存在着一定的分子内交 联。多功能试剂制备固定化酶方法 可分为：(1) 单独与酶作用；( 2) 酶 吸附在载体表面上再经受交联；( 3) 多功能团试剂与载体反应得到有功 能团的载体，再连接酶。交联剂的 种类很多，最常用的是戊二醛，其 他的还有异氰酸衍生物、双偶氮二 联苯胺、N，N-乙烯马来酰亚胺等。 交联法的优点是酶与载体结合牢固， 稳定性较高；缺点是有的方法固定 化操作较复杂，进行化学修饰时易 造成酶失活。
用固定化酶处理受污染水体中的农药也取 得了很好的效果。
用聚丙烯负载二氧化钛膜固定农药降解酶， 降解农药甲基对硫磷。研究发现，甲基对 硫磷在30 min 内降解了70%以上。尤其等 以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，固定 化真菌漆酶对农药氯苯嘧啶醇进行降解。 研究认为，在酸性条件下，固定化漆酶对 氯苯嘧啶醇具有良好的降解作用。
4.2.3 其他应用
CO2是一种重要的温室气体。目前全球每 年排放的数十亿吨CO2需要得到妥善的处 置。固定化酶技术在固定CO2方面也取得 了成果。据报道，以工业固体废弃物为原 料， 利用固定化碳酸酐酶和超重力强化反 应可得到CO2的有效固定 固定化酶技术在清洁生产领域具有潜在的 应用价值。固定化的木聚糖酶和漆酶用于 纸浆漂白， 可以避免产生传统造纸工艺过 程中用氯漂白产生的难以生物降解的各类 氯代有机物。
包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等 多空载体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。这个方法 比较简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性被破坏的程度低， 但此法对大分子底物不适用。
(1)网格型 将酶包埋在凝胶细微网 格中，制成一定形状的 固定化酶，称为网格型 包埋法。也称为凝胶包 埋法。
固定化酶与固定化细胞(第六章)
固定化催化剂的特殊应用（ 固定化催化剂的特殊应用（三） 特殊应用 药物控释载体9
药物释放要求： 定点（靶向性）； 定量（太高太低均有害）； 避免被（胃酸、蛋白酶）破坏； 避免引起免疫反应。 措施：聚合物修饰；凝胶包埋；制成微球 制剂或脂质体、具有导向性的药物等。
固定化催化剂的特殊应用（ 固定化催化剂的特殊应用（四） 特殊应用 －－生物传感器
第六章 固定化酶与固定化细胞
固定化酶定义的形成以及扩展
固定化酶是20世纪50年代发展起来的一项新技术， 最初称“ 水不溶性酶 ”（water insoluble enzyme） 和 “ 固相酶 ” （solid phase enzyme),是将水溶性的酶 与不溶性的载体结合起来。 后来，人们发现可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装 置中，高分子底物与酶在超滤膜的一边，反应产物可以 透过膜逸出。这种情况下，酶本身仍处于溶解状态，只 不过是被固定在一个有效的空间内。再用上面的名字已 不合适。 1971年第一次国际酶工程会议上统一称为“ 固定化 酶”。（immobilized enzyme ）是指在一定空间内成闭索 状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后酶可以回收 利用。 “ 固定化的生物催化剂” 包含酶、含酶细胞及微生物 的固定化。1
固定化酶半衰期（T 固定化酶半衰期（T1/2）的测定
测定半衰期的意义：评价固定化方法；生 产上决定更换酶的时机。 定义：从开始到活力只剩一半时所经历的 时间。有使用半衰期，贮藏半衰期等。 方法：直接法测既费时、费力，有时还不 可行（如半衰期很长）。 参考测定放射性元素半衰期的做法，间接 测定。
间接法测定固定化酶半衰期T 间接法测定固定化酶半衰期T1/2
生物催化剂固定化的优点
o 某些酶回到了它在体内的原始状态。 o 可以重复使用，节约了成本。 o 使用时方便得多，对产物抑制型反应既有 利又方便。 o 催化剂易和产物分离，有利于提高产品质 量（如生产针剂药品，最后不能含蛋白 质）。 o 大多数情况下催化剂固定化后稳定性提高。 o 酶反应过程可以控制。 o 较游离酶更适合于多酶体系反应。
固定化酶
中等
活力回收率
载体再生 费用 底物专一性 适用性
较高
可能 低 不变 酶源多
低
不可能 高 可变 较广
高
可能 低 不变 广泛
中等
不可能 中等 可变 较广
高
不可能 低 不变 小分子底物、 药用酶
3 评价固定化酶指标
固定化后酶的考察项目
（1） （3）
测定固定化酶的活力，以
确定固定化过程的活力回收 率。
考察固定化酶最适反应 条件。
固定化后酶性质的变化
4
固定化酶和亲和色谱
• 亲和技术的基础：是生物活性化合物生物特异信 息的综合。 • 利用了生命现象中生物分子间特有的高亲和力、 高专一性，可逆结合而设计的纯化方法。 • 是唯一能够体现待分离物质间生物学功能差异的 分离方法。
THANK YOU
固定化后酶性质的变化
2
• 固定化青霉素酰化酶，只要改变pH值等条件，就可以生成不同的产物
固定化酶在医药治疗上的应用
青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素
H2N R1
O
R2
+
NH2 O N O
S
Penicillin G acylase H2O R
1
OH
NH2 H N S O N O O OH
1: D-(-)-PGA (R1 = H, R2 = NH2) 2: D-(-)-PGM (RI = H, R2 = OMe) 3. D-(-)-HPGA (R1 = OH, R2 = NH2) 4: D-(-)-HPGM (R1 = H, R2 = OMe
酶降低了酶的亲和力。
• （2） 载体与底物电荷相反，静电作用，Km'<Km
6 固定化酶的应用
第六章固定化酶反应器08
15
4、膜反应器（Membrane reactor or 、膜反应器 Hollow fiber reactor）
酶连接于膜表面和以特定形式存在于膜内分隔空 间，可用较大孔径的膜，因为溶质与固定化酶的 大小差别，远大于溶质与可溶酶的差异，这样， 溶质可容易通过膜，不易被堵塞。 有许多种类的膜反应器，一个普通的形式为，使 用半透膜的中空纤维，浸没于反应混合物中，该 反应器可分批也可连续。
25
26
酶反应器的发展
1、含有辅助因子再生的酶反应器 问题由来： 许多酶反应都需要辅因子的协助，如辅酶、辅基、能 量供给体等。这些辅因子价格昂贵，需再生循环使用 才能降低成本，因而发展了辅因子再生酶反应器。 例：利用固定化脱氢酶可将固定化NADH再生为NAD。依 靠半透膜能将固定化NAD保留在反应器内，实现了NAD 的再生与循环使用。 辅因子再生方法： （1）两种酶反应偶联、两种底物偶联 （2）电化学方法（生物传感器） （3）化学方法（氧化剂）
5
2、活塞流反应器或填充床反应器 、 （Plug flow reactor,PFR; or Packed bed reactor, PBR） 把颗粒状或片状等固定化酶填充于固定床 （填充床）内，底物按一定方向以恒定的速 度通过反应床。它是一种单位体积催化剂负 荷量最大，效率高的反应器。反应器水平或 垂直放置，底物用泵从底部或顶部打入（上 流比下流好，因不易阻塞，液流更均匀）。
12
连续搅拌罐反应器
产物 过滤器
固定化酶
底物
13
CSTR与PBR的比较： 与 的比较： 的比较
（1）在CSTR中，所有酶暴露在相对低的底物浓度和 相对高的产物浓度中，效率因子η下降，反应器中酶 未被有效利用。 在PBR中，反应器的初始部分在高底物浓度下操作， 仅在最后部分，底物浓度较低，产物浓度较高，因此 仅在最后部分效率因子η下降，这意味着在CSTR中比 PBR可能需更多的酶。 在实际中，在CSTR中很容易得到紊流，可消弱扩 散限制作用，而在PBR中，使用层流，更容易遇到扩 散限制情况，因此CSTR可得到与PBR一样好的性能， 而监控PH、温度相对容易。
4、膜反应器（Membrane reactor or 、膜反应器 Hollow fiber reactor）
酶连接于膜表面和以特定形式存在于膜内分隔空 间，可用较大孔径的膜，因为溶质与固定化酶的 大小差别，远大于溶质与可溶酶的差异，这样， 溶质可容易通过膜，不易被堵塞。 有许多种类的膜反应器，一个普通的形式为，使 用半透膜的中空纤维，浸没于反应混合物中，该 反应器可分批也可连续。
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26
酶反应器的发展
1、含有辅助因子再生的酶反应器 问题由来： 许多酶反应都需要辅因子的协助，如辅酶、辅基、能 量供给体等。这些辅因子价格昂贵，需再生循环使用 才能降低成本，因而发展了辅因子再生酶反应器。 例：利用固定化脱氢酶可将固定化NADH再生为NAD。依 靠半透膜能将固定化NAD保留在反应器内，实现了NAD 的再生与循环使用。 辅因子再生方法： （1）两种酶反应偶联、两种底物偶联 （2）电化学方法（生物传感器） （3）化学方法（氧化剂）
5
2、活塞流反应器或填充床反应器 、 （Plug flow reactor,PFR; or Packed bed reactor, PBR） 把颗粒状或片状等固定化酶填充于固定床 （填充床）内，底物按一定方向以恒定的速 度通过反应床。它是一种单位体积催化剂负 荷量最大，效率高的反应器。反应器水平或 垂直放置，底物用泵从底部或顶部打入（上 流比下流好，因不易阻塞，液流更均匀）。
12
连续搅拌罐反应器
产物 过滤器
固定化酶
底物
13
CSTR与PBR的比较： 与 的比较： 的比较
（1）在CSTR中，所有酶暴露在相对低的底物浓度和 相对高的产物浓度中，效率因子η下降，反应器中酶 未被有效利用。 在PBR中，反应器的初始部分在高底物浓度下操作， 仅在最后部分，底物浓度较低，产物浓度较高，因此 仅在最后部分效率因子η下降，这意味着在CSTR中比 PBR可能需更多的酶。 在实际中，在CSTR中很容易得到紊流，可消弱扩 散限制作用，而在PBR中，使用层流，更容易遇到扩 散限制情况，因此CSTR可得到与PBR一样好的性能， 而监控PH、温度相对容易。
6 酶学与酶工程 第六章 酶的固定化
2．蛋白总量 (1)双辛可宁酸法(BCA法) (2)考马斯亮蓝法 3．偶联率及相对活力 偶联率＝(加入蛋白活力一上清液蛋白活力)／加入 蛋白活力X100％ 活力回收＝固定化酶总活力／加入酶的总活力 ×100％ 相对活力＝固定化酶总活力／(加入酶的总活 力一上清液中未偶联酶活力)X100％
物理吸附法常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅 藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。
操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉 价易得，而且可反复使用
于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢
固而容易脱落，
2.包埋法
将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方
法称为包埋法。
包埋法可分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法（半透膜法） 将酶或微生物包埋在高分子凝胶细微网格中的称为凝胶包 埋法；
将酶或微生物包埋在高分子半透膜中的称为微胶囊法。包
埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，因 此可以应用于许多酶、微生物的固定化。
1）凝胶包埋法 凝胶包埋法是应用最广泛的固定化方法 主要用包埋载体： 琼脂凝胶， 海藻酸钙凝胶， 角叉菜胶， 明胶， 聚丙烯酰胺凝胶
固定化酶颗粒的扩散阻力会使反应速率下降；
只能用于可溶性底物和小分子底物，对大分子底物不适
宜。
必须注意维持酶的催化活性及专一性 应该有利于生产自动化、连续化
应有最小的空间位阻
酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮存，利 于反复使用
固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物，产物或 反应液发生化学反应
理学食品酶学本固定化酶课件
（1）酶的底物为小分子化合物
一般来说，当酶的底物为小分子化合物时，固定化酶的底物特异性大多数情况下不发生变化。例如，氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构酶等，酶的底物为大分子化合物
当酶的底物为大分子化合物时，如蛋白酶、α-淀粉酶、磷酸二酯酶等，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。这是由于载体引起的空间位阻作用，使大分子底物难以与酶分子接近而无法进行催化反应，酶的催化活力难以发挥出来，催化活性大大下降；而分子量较小的底物受到空间位阻作用的影响较小，与游离酶没有显著区别。 酶底物为大分子化合物时，底物分子量不同，对固定化酶底物特异性的影响也不同，一般随着底物分子量的增大，固定化酶的活力下降。例如，糖化酶用CMC叠氮衍生物固定化时，对分子量8000的直链淀粉的活性为游离酶的77％，而对分子量为50万的直链淀粉的活性只有15%～17％。
以上四种固定化酶方法各有其优缺点（见表4-1）。往往一种酶可以用不同方法固定化，但没有一种固定化方法可以普遍地适用于每一种酶。在实际应用时，常将两种或数种固定化方法并用，以取长补短。
各固定方法的特点与比较
四、 固定化酶的特性
（一）固定化酶的形状 （二）固定化酶的性质 （三）酶活力 （四）固定化酶的稳定性 （五）固定化酶的反应特性
酶经固定化后，其对蛋白酶的抵抗力提高。这可能是因为蛋白酶是大分子，由于受到空间位阻的影响，不能有效接触固定化酶。例如，千畑一郎发现，用尼龙或聚脲膜包埋，或用聚丙烯酰胺凝胶包埋的固定化天门冬酰胺酶，对蛋白酶极为稳定，而在同一条件下，游离酶几乎全部失活。另外固定化后酶对有机试剂和酶抑制剂的耐受性也得到了提高。
固定化可延长酶的贮藏有效期。但长期贮藏，活力也不免下降，最好能立即使用。如果贮藏条件比较好，亦可较长时间保持活力。例如，固定化胰蛋白酶，在0.0025mol/L磷酸缓冲液中，于20℃保存数月，活力尚不损失。
酶工程第六章 固定化酶
酶的固定化方法主要可分为四类：吸附法、包埋法、共价键结合 法和交联法等。吸附法和共价键结合法又可统称为载体结合法。
6.3.1吸附法
吸附法（adsorption）是通过载体表面和酶 分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的 方法，是固定化中最简单的方法。 酶与载体之间的亲和力是范德华力、疏水相 互作用、离子键和氢键等。 吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。
（1）重氮法 重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基
团通过共价键相连接而固定化的方法，是共价键法中使用
最多的一种。
常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸的共
聚体和聚丙烯化生成叠氮化合物，再与酶分子上
的相应基团偶联成固定化酶。含有羟基、羧基、羧甲基等
其新的功能和新的应用正在迅速不断地扩展，是一项
研究领域宽广、应用前景极为引人瞩目的新研究领域和新 技术。
6.1 固定化酶的定义与优点
所谓固定化酶(immobilized enzyme)， 是指在一定的空间范围内起催化作用，并 能反复和连续使用的酶。
固定化酶的优点：
（1）同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用； （2）固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同 时也省去了热处理使酶失活的步骤； （3）稳定性显著提高； （4）可长期使用，并可预测衰变的速度； （5）提供了研究酶动力学的良好模型。
（1）物理吸附法
物理吸附法(physical adsorption)是通过物理方法将酶
直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方法。
是制备固定化酶最早采用的方法。
如α-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶等都曾采用过此
法进行固定化。物理吸附法常用的有机载体如纤维素、胶 原、淀粉及面筋等；无机载体如活性炭、氧化铝、皂土、 多孔玻璃、硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等。
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酶的pH值低； 催化反应的产物为中性时，固定化酶的最适pH值一般不
变；
这是由于固定化载体成为扩散障碍，使反应
产物向外扩散受到一定的限制所造成的。当
反应产物为酸性时，由于扩散受到限制而积
累在固定化酶所处的催化区域内，使此区域 内的pH比降低，必须提高周围反应液的pH， 才能达到酶所要求的pH。为此，固定化酶的 最适pH比游离酶要高一些。反之，反应产物
固定化酶作用的最适温度可能会受到固定方法和固定化载 体的影响。
5． 底物特异性变化
固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同， 其变化与底物相对分子质量的大小有一定关系。
作用于小分子底物的酶
特异性没有明显变化
既可作用于小分子底物又可作用于大分子底物的酶 特异性往往会变化。
Eg：胰蛋白酶：高分子蛋白、低分子（二肽、多肽），固定在羧甲基 纤维素上，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酪蛋白的作用仅为游 离酶的3%；
为碱性时，由于它的积累使固定化酶催化区 域的pH升高，故此使固定化酶的最适pH比游 离酶的最适pH要低一些。
固定化酶最适温度的变化
一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化
Eg：用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其 作用的最适温度比游离酶高5—10
以共价结合法固定化的色氨酸酶，其最适温度比游离酶高
——这种固定化的酶既具有酶的催化特性， 又具有一般化学催化剂能回收、反复使 用等优点，并且生产工艺可以连续化、 自动化。
3
进展
1916年Nelson和Griffin利用活性炭吸附蔗糖酶
固定化酶的研究从20世纪50年代开始
1953年德国的Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯 乙烯树脂为载体，经重氮法活化后，分别与羧肽 酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，而 制成固定化酶。
3）载体不带电荷，最适Ph一般不改变（有时也会有所 改变，但不是由于载体的带电性质所引起的。）
载体的性质对固定化酶作用的最适pH有明显的影响。
3．固定化酶pH的变化
（2）产物性质对pH的影响 催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适pH值比游离
酶的pH值高； 催化反应的产物为碱性时，固定化酶的最适pH值比游离
5—15
℃
同一种酶，用不同的方法或不同的载体进行固定化后，其
最适温度也有可能提℃高。 Eg：氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶经离子键结合法
固定化后，其最适温度（72）比游离酶的最适温度（60） 提高12度；用DEAE-纤维素固定化的，其最适温度（67） 比游离酶提高7度；而用烷基化法固定化的氨基酰化酶， 其最适温度却比游离酶有所降低。
6
固定化酶正式定名
在1971年第一届国际酶工程会议上，正 式建议采用“固定化酶”（immobilized enzyme）的名称。
7
固定化酶与游离酶相比，具有下列优点:
（l）极易将固定化酶与底物、产物分开； （2）可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱
连续反应； （3）在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； （4）酶反应过程能够加以严格控制； （5）产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； （6）较游离酶更适合于多酶反应； （7）可以增加产物的收率，提高产物的质量； （8）酶的使用效率提高，成本降低。
8
缺 点：
（l）固定化时，酶活力有损失； （2）增加了生产的成本，工厂初始投资大； （3）只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子
底物，对大分子不适宜； （4）与完整菌体相比不适宜于多酶反应； （5）胞内酶必须经过酶的分离程序。
9
第二节 固定化酶的性质及其影响因素
一． 影响固定化酶性质的因素 二． 固定化后酶性质的变化 三． 评价固定化酶的指标
第三章 固定化酶
第一节 概述 第二节 固定化酶的性质及其影响因素 第三节 固定化酶的制备 第四节 固定化细胞 第五节 固定化辅酶和原生质体 第六节 酶反应器和固定化酶（细胞）
的应用
酶催化的缺陷
（1）酶的稳定性较差 （2）酶的一次性使用 （3）产物的分离纯化较困难
设想
——如果能设计一种方法，将酶束缚于特殊 的相，使它与整体相（或整体流体）分 隔开，但仍能进行底物和效应物（激活 剂或抑制剂）的分子交换。
二． 固定化酶的性质
2． 固定化对酶稳定性的影响 （1） 操作稳定性提高
（2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。 (3 ) 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。 (4 ) 对分解酶的稳定性提高。 （5） 对变性剂的耐受力升高
2 ．固定化后酶稳定性提高的原因：
a. 固定化后酶分子与载体多点连接。 b. 酶活力的释放是缓慢的。 c. 抑制自降解，提高了酶稳定性。
一． 影响固定化酶性质的因素
1． 酶本身的变化，主要是由于活性中 心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态 等发生了变化。
一． 影响固定化酶性质的因素
2． 载体的影响
（1） 分配效应 （2） 空间障碍效应 （3） 扩散限制效应
3. 固定化方法的影响
二．固定化后酶性质的变化
1． 固定化对酶活性的影响：酶活性下降， 反应速度下降
20世纪从60年代起，固定化酶的研究在工业生产规模应 用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸， 实现了酶应用史上的一大变革。
4
固定化酶的定义
所谓固定化酶，是指在一定空间内呈 闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应， 反应后的酶可以回收重复使用。
5
“水不溶酶”（water insoluble enzyme） “固相酶”（solid phase enzyme）
3． pH的变化
PH对酶活性的影响： （1） 改变酶的空间构象 （2）影响酶的催化基团的解离 （3）影响酶的结合基团的解离 （4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后
不能生成产物。
固定化酶pH的变化
1） 载体带负电荷，最适pH比游离酶的最适pH高（向 碱性方向移动）。
2）载体带正电荷，最适pH比游离酶的最适pH低（向 酸性方向移动）。
以羧甲基纤维素为载体经叠氮法制备的核糖核酸酶，当以核糖
核酸为底物时，催化速率仅为游离酶的2%，而以环化鸟苷酸为底物 时，催化速率可达游离酶的50—60%。
变；
这是由于固定化载体成为扩散障碍，使反应
产物向外扩散受到一定的限制所造成的。当
反应产物为酸性时，由于扩散受到限制而积
累在固定化酶所处的催化区域内，使此区域 内的pH比降低，必须提高周围反应液的pH， 才能达到酶所要求的pH。为此，固定化酶的 最适pH比游离酶要高一些。反之，反应产物
固定化酶作用的最适温度可能会受到固定方法和固定化载 体的影响。
5． 底物特异性变化
固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同， 其变化与底物相对分子质量的大小有一定关系。
作用于小分子底物的酶
特异性没有明显变化
既可作用于小分子底物又可作用于大分子底物的酶 特异性往往会变化。
Eg：胰蛋白酶：高分子蛋白、低分子（二肽、多肽），固定在羧甲基 纤维素上，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酪蛋白的作用仅为游 离酶的3%；
为碱性时，由于它的积累使固定化酶催化区 域的pH升高，故此使固定化酶的最适pH比游 离酶的最适pH要低一些。
固定化酶最适温度的变化
一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化
Eg：用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其 作用的最适温度比游离酶高5—10
以共价结合法固定化的色氨酸酶，其最适温度比游离酶高
——这种固定化的酶既具有酶的催化特性， 又具有一般化学催化剂能回收、反复使 用等优点，并且生产工艺可以连续化、 自动化。
3
进展
1916年Nelson和Griffin利用活性炭吸附蔗糖酶
固定化酶的研究从20世纪50年代开始
1953年德国的Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯 乙烯树脂为载体，经重氮法活化后，分别与羧肽 酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，而 制成固定化酶。
3）载体不带电荷，最适Ph一般不改变（有时也会有所 改变，但不是由于载体的带电性质所引起的。）
载体的性质对固定化酶作用的最适pH有明显的影响。
3．固定化酶pH的变化
（2）产物性质对pH的影响 催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适pH值比游离
酶的pH值高； 催化反应的产物为碱性时，固定化酶的最适pH值比游离
5—15
℃
同一种酶，用不同的方法或不同的载体进行固定化后，其
最适温度也有可能提℃高。 Eg：氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶经离子键结合法
固定化后，其最适温度（72）比游离酶的最适温度（60） 提高12度；用DEAE-纤维素固定化的，其最适温度（67） 比游离酶提高7度；而用烷基化法固定化的氨基酰化酶， 其最适温度却比游离酶有所降低。
6
固定化酶正式定名
在1971年第一届国际酶工程会议上，正 式建议采用“固定化酶”（immobilized enzyme）的名称。
7
固定化酶与游离酶相比，具有下列优点:
（l）极易将固定化酶与底物、产物分开； （2）可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱
连续反应； （3）在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； （4）酶反应过程能够加以严格控制； （5）产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； （6）较游离酶更适合于多酶反应； （7）可以增加产物的收率，提高产物的质量； （8）酶的使用效率提高，成本降低。
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缺 点：
（l）固定化时，酶活力有损失； （2）增加了生产的成本，工厂初始投资大； （3）只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子
底物，对大分子不适宜； （4）与完整菌体相比不适宜于多酶反应； （5）胞内酶必须经过酶的分离程序。
9
第二节 固定化酶的性质及其影响因素
一． 影响固定化酶性质的因素 二． 固定化后酶性质的变化 三． 评价固定化酶的指标
第三章 固定化酶
第一节 概述 第二节 固定化酶的性质及其影响因素 第三节 固定化酶的制备 第四节 固定化细胞 第五节 固定化辅酶和原生质体 第六节 酶反应器和固定化酶（细胞）
的应用
酶催化的缺陷
（1）酶的稳定性较差 （2）酶的一次性使用 （3）产物的分离纯化较困难
设想
——如果能设计一种方法，将酶束缚于特殊 的相，使它与整体相（或整体流体）分 隔开，但仍能进行底物和效应物（激活 剂或抑制剂）的分子交换。
二． 固定化酶的性质
2． 固定化对酶稳定性的影响 （1） 操作稳定性提高
（2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。 (3 ) 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。 (4 ) 对分解酶的稳定性提高。 （5） 对变性剂的耐受力升高
2 ．固定化后酶稳定性提高的原因：
a. 固定化后酶分子与载体多点连接。 b. 酶活力的释放是缓慢的。 c. 抑制自降解，提高了酶稳定性。
一． 影响固定化酶性质的因素
1． 酶本身的变化，主要是由于活性中 心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态 等发生了变化。
一． 影响固定化酶性质的因素
2． 载体的影响
（1） 分配效应 （2） 空间障碍效应 （3） 扩散限制效应
3. 固定化方法的影响
二．固定化后酶性质的变化
1． 固定化对酶活性的影响：酶活性下降， 反应速度下降
20世纪从60年代起，固定化酶的研究在工业生产规模应 用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸， 实现了酶应用史上的一大变革。
4
固定化酶的定义
所谓固定化酶，是指在一定空间内呈 闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应， 反应后的酶可以回收重复使用。
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“水不溶酶”（water insoluble enzyme） “固相酶”（solid phase enzyme）
3． pH的变化
PH对酶活性的影响： （1） 改变酶的空间构象 （2）影响酶的催化基团的解离 （3）影响酶的结合基团的解离 （4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后
不能生成产物。
固定化酶pH的变化
1） 载体带负电荷，最适pH比游离酶的最适pH高（向 碱性方向移动）。
2）载体带正电荷，最适pH比游离酶的最适pH低（向 酸性方向移动）。
以羧甲基纤维素为载体经叠氮法制备的核糖核酸酶，当以核糖
核酸为底物时，催化速率仅为游离酶的2%，而以环化鸟苷酸为底物 时，催化速率可达游离酶的50—60%。