第四节基因差异表达获得目的基因
基因差异表达技术
基因差异表达技术真核生物中，从个体的生长、发育、衰老、死亡，到组织的得化、调亡以及细胞对各种生物、理化因子的应答，本质上都涉及基因的选择性表达。
高等生物大约有30000个不同的基因，但在生物体内任意8细胞中只有10%的基因的以表达，而这些基因的表达按特定的时间和空间顺序有序地进行着，这种表达的方式即为基因的差异表达。
其包括新出现的基因的表达与表达量有差异的基因的表达。
生物体表现出的各种特性，主要是由于基因的差异表达引起的。
由于基因的差异表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制，通过比较同一类细胞在不同生理条件下或在不同生长发育阶段的基因表达差异，可为分析生命活动过程提供重要信息。
研究基因差异表达的主要技术有差别杂交（differential hybridization）、扣除（消减）杂交（subtractive hybridization of cDNA，SHD）、mRNA差异显示（mRNA differential display，DD）、抑制消减杂交法（suppression subtractive hybridization，SSH）、代表性差异分析（represential display analysis，RDA）、交互扣除RNA差别显示技术（reciprocal subtraction differential RNA display）、基因表达系列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）、电子消减（electronic subtraction）和DNA微列阵分析（DNA microarray）等。
一、差别杂交与扣除杂交差别杂交（differential hybridization）又叫差别筛选（differential screening），适用于分离经特殊处理而被诱发表达的mRNA的cDNA克隆。
为了增加这种方法的有效性，后来又发展出了扣除杂交（subtractive hybridization）或扣除cDNA克隆（subtractive cDNA cloning），它是通过构建扣除文库（subtractive library）得以实现的。
目的基因获取PPT课件
.
1
目的基因
➢准备要分离、改造、扩增或表达的基因。
编码某种蛋白质
研究某基因与疾 病的关系
研究某基因结构和
功能的关系
.
2
一、基因的基本结构特征
一个能转录、翻译的结构基因依次包括 以下几部分：转录启动区、核糖体识别区 、编码区(包括起始密码子ATG、开放阅读 框、终止密码子TAG、TAA或T，再将这些cDNA与载体连接，转般步骤
1. 总RNA（total RNA）提取
➢ 提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。
➢方法：亲和层析。分离mRNA用商业化的 Oligo dT纤维柱。
.
12
.
13
3. cDNA第一链的合成
➢Oligo dT法：用Oligo dT作引物，合成 cDNA的第一链。
3’AAAAAAA
mRNA
5’
5’TTTTTTT cDNA 反转录酶
Oligo dT引物
不适用于大分子量的mRNA
.
14
.
27
mRNA
目的基因 的引物1
反转录成目的基因cDNA第一链
目的 基因cDNA第二链
PCR
目的基因 的引物2
.
28
获取目的基因方法的选择策略
类 型
已知的信息
获得目的基因的方法
PCR相关的技术简便、快速地获得全长的目的
已知目的基因的部分序列或其他物 基因
1 种中同源基因的保守序列
已知的目的基因部分片段为探针从基因中➢随机引物法：随机合成6-10bp的多种引物， 从mRNA的多个位点开始合成cDNA。
➢基因特异性引物法：mRNA序列已知，设计 基因特异性引物，在反转录酶的作用下合成 cDNA第一链。
《目的基因获取》课件
目学合成法 • 基因组测序法
01 目的基因获取概述
目的基因获取的定义
目的基因获取是指从生物体内分离出 特定的基因片段，通常是为了进行基 因克隆、表达或功能研究。
目的基因可以是已知序列的基因，也 可以是未知序列的基因，需要通过基 因筛选、PCR扩增等技术手段进 行分离。
编辑技术。02 基因法基因的构建1
基因的构建是目的基因获取的第一步，通常 采用基因克隆技术将所有择适当的载体、酶和引物 等工具，以确保基因片段能够正确质量和完整性。
02
在遗传学研究中，基因组测序可用于鉴定基因突变、遗传疾病关联和 进化机制等。
03
在疾病诊断与治疗中，基因组测序可用于检测致病基因突变、预测疾 病风险和指导个性化治疗。
04
在生物进化研究中，基因组测序可用于比较不同物种间的基因组差异 ，揭示物种进化历程和机制。
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PCR的反应条件
温度
PCR循环包括高温变性（95℃）、低温复性（50-65℃） 和适温延伸（72℃），每个步骤的温度和时间都有严格 要求。
dNTP
PCR需要四种脱氧核糖核苷酸作为原料，它们的浓度和纯 度会影响PCR产物的质量和产量。
引物
设计特异性良好的引物是PCR成功的关键，引物长度、特 异性、浓度等都会影响PCR结果。
01
基因组测序法是一种基于高通量测序技术的基因组 分析方法。
02
它通过将基因组DNA进行片段化、建库、测序和数 据分析，获取基因组的序列信息。
03
基因组测序法的原理基于碱基互补配对原则和测序 技术平台的多重独立测序反应。
基因组测序法的步骤
样本准备
包括基因组DNA提取、片段化、末端修复和质量评估、序列比对和变异 检测等分析，提取目的基因序列。
第四章 目的基因的制取
第四章目的基因的制取内容提要•目的基因的制取策略•鸟枪法制取目的基因•物理化学法分离目的基因•化学合成基因•反转录合成DNA第一节目的基因制取的策略一、外源基因与目的基因基因工程主要是通过人工方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而进行遗传研究或是获得表达产物。
通常我们把插入载体的DNA片段称为“外源基因”；将那些已被或准备要被分离、改造、扩增或表达的DNA片段称为“目的基因”。
原核细胞含有上千个基因，真核细胞基因组内的基因数目更是庞大。
目的基因一般都很小，都仅由几千或几百甚至更少的碱基对组成（人生长激素释放抑制因子的基因仅有42bp）。
要想获得某个特定的目的基因，必须对其性质、结构有所了解，根据其特点来制定分离方案。
二、目的基因制取的策略目的基因制取的策略可分为直接制取和间接制取。
一般来说，大部分低等生物基因组的碱基序列已测定，可以直接制取目的基因（确切定位）。
对于高等哺乳动物来说，目的基因在DNA上无法定位，只能间接制取。
获取目的基因的方法：1、直接制取法：以机械的方法或是限制性内切酶对总DNA进行切割，再直接分离特点位点的DNA分子。
2、逆转录法（互补cDNA法）：以RNA为模板，逆转录合成cDNA。
缺点是cDNA中不含天然基因的内含子。
3、PCR扩增法：对于含极微量mRNA的细胞大多采用PCR扩增，再进行目的基因的制取。
4、鸟枪法（散弹法）：可快速和高纯度地从单拷贝或多拷贝基因中筛选获得天然的目的基因。
5、人工化学合成法。
6、其它方法：mRNA差异显示法、限制性片段长度多态性探针技术等。
目前，真核基因，利用DNA合成仪合成目的基因的成本较高；利用cDNA文库获得目的基因需大量前期工作；直接以生物细胞染色体DNA为模板可获得目的基因，但模板的扩增会产生非特异性产物；一般通过构建完整的基因文库，再从文库中“钓取”出目的基因。
第二节鸟枪法制取目的基因一、“鸟枪法”的概念“鸟枪法”是指将基因组按染色体分开后，将它全部打乱，切成碎片，进行随机测序，测序后再将它们拼接起来的方法。
目的基因的获取
目的基因的获取基因工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同一生物体中，创造出具有高度应用价值的新物种。
为此必须从现有生物群中，根据需要分离出用于克隆的此类基因。
这类基因称之为目的基因，即准备要分离、改造、扩增或表达的基因。
目前目的基因的获取方法主要有以下2类：（1）已知基因的获得：PCR分离法和化学合成法等（2）未知基因的获得：直接分离法和基因文库分离法等第一节直接分离法1、限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。
应用对象：适合于从简单的基因组中分离目的基因,如质粒或病毒的大小只有几千碱基,大的也超不过几十万碱基,编码基因比较少，获得也比较简单。
（1）对已定序列的DNA分子，只需要用已知识别序列的限制性内切酶进行一次或几次切割，分离纯化所需要的DNA片断，与适当载体连接。
（2）对已知定位的目的基因，只要根据目的基因两侧的已知的酶切识别位点，一次就可以获得。
（3）即使含目的基因的DNA分子未定序或定位，也只须通过酶切分析，随后再通过部分酶切，构建一个简单的基因文库，从钩出目的基因。
2. 随机片断化2.1. 限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。
2.2 机械切割法（1）超声波超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。
（2）高速搅拌1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。
3. 物理化学法基本原理：DNA分子的两条链存在着G≡C、A＝T碱基配对，其中GC间存在3个氢键、A T间存在2个氢键，如果不同基因片段的碱基组成差异较大，其理化性质，如浮力密度和解链温度等也明显不同，采用相应的方法即可达到从生物基因组中分离目的基因的目的。
3.1密度梯度离心法由于富含碱基GC的双链DNA片段浮力密度较大，利用精密的密度梯度超速离心技术可使切割成适当片段的不同DNA按密度大小分离开来。
然后通过与某种放射性的mRNA杂交来检验，分离相应的基因。
tcga某个基因差异表达
tcga某个基因差异表达TCGA基因差异表达研究及其在肿瘤疾病中的应用引言：基因差异表达是指在不同组织、细胞或生理状态下，基因表达水平的差异。
TCGA（The Cancer Genome Atlas）项目是一个全球性的癌症基因组研究计划，旨在通过分析多种癌症类型的基因组数据，揭示癌症的发生机制和靶向治疗的潜在靶点。
本文将以TCGA某个基因差异表达为标题，探讨基因差异表达在肿瘤疾病中的应用。
第一节：基因差异表达的意义和方法基因差异表达研究可以帮助我们理解基因与表型之间的关系，揭示不同基因在不同条件下的表达模式，从而为疾病的发生机制和治疗提供重要线索。
常用的基因差异表达分析方法包括RNA测序和芯片技术，通过对样本中的RNA进行定量测量，得到基因的表达水平数据。
第二节：TCGA项目简介TCGA项目是一个多中心的合作研究项目，旨在通过对多种癌症类型的基因组数据进行系统分析，揭示癌症的分子特征和治疗靶点。
该项目利用高通量测序技术和其他生物信息学方法，对数千个癌症样本进行基因组测序，构建了一个庞大的癌症基因组数据库。
第三节：基因差异表达在肿瘤疾病中的应用基因差异表达在肿瘤疾病中有着广泛的应用。
首先，基因差异表达可以帮助我们发现新的肿瘤标志物。
通过比较肿瘤组织和正常组织中的基因表达差异，可以筛选出在肿瘤中高度表达的基因，并进一步验证其作为肿瘤标志物的潜力。
基因差异表达可以帮助我们理解肿瘤发生发展的分子机制。
通过比较不同肿瘤类型或不同分期的肿瘤组织中的基因表达差异，可以揭示不同类型和分期的肿瘤之间的分子差异，从而有助于我们理解肿瘤的发生和发展过程。
基因差异表达可以帮助我们预测肿瘤的预后和治疗反应。
通过分析肿瘤组织中的基因表达差异，可以建立预后模型和治疗响应模型，从而预测患者的生存期和对治疗的反应。
第四节：基因差异表达的挑战和解决方案基因差异表达研究面临着一些挑战，例如样本数量少、数据处理复杂等。
为了克服这些问题，研究者可以通过增加样本数量、使用更加精确的测序技术和开发更加有效的数据处理算法来提高研究的可靠性和准确性。
基因差异表达的研究方法
基因差异表达的研究方法摘要寻找差异表达基因成为目前基因研究的一个非常重要的手段。
寻找差异表达基因的方法有消减杂交法、mRNA 差异显示、代表性差异分析法、基因表达的序列分析、抑制消减杂交、表达序列标签、cDNA微阵列、半定量PCR、定量PCR。
特综述以上各种方法的原理、方法过程、优缺点及其应用，随着科学技术的发展对差异表达基因的研究会更加完善。
关键词基因；差异表达；消减杂交；差异显示；研究方法在真核生物的生命现象中，从个体的发育、生长、衰老、死亡，到组织、细胞的分化、凋亡或肿瘤的恶化以及细胞对各种生物、理化因子的应答，本质上都涉及基因在时间上或空间上的选择性表达，即基因的差异表达。
基因的差异表达与组织、细胞的生物学性状和功能密切相关，成为生命科学的重要研究课题（潘美辉等，1997）。
比较不同细胞或不同基因型在基因表达上的差异，不仅是研究生命过程分子机制的基础，亦是分离克隆目的基因的前提（胡昌华，2001）。
寻找差异表达基因成为目前基因研究的一个非常重要的内容。
差异表达的基因通常用稳定状态下mRNA的丰度高低有无来比较。
差异表达基因有2个含义，即表达基因的种类改变和基因表达量的变化。
通过它能找到疾病不同阶段、不同状态下表达不同丰度的基因，从而为进一步研究打下基础。
分离和鉴定差异表达基因是了解各项生命活动和疾病分子调控机制的重要手段（梁自文，2001）。
笔者拟对目前现有的寻找差异基因的方法作一综述。
1消减杂交法（subtractive hybridization）消减杂交在1984年由Palmer和Lamer（Lamar EE et at.，1984）提出，其目的是分离出两类同源分子间差异表达的基因，关键是利用分子杂交原理去除共同序列，保留差异序列，通过PCR多次循环扩增而分离，从而能进一步研究其差异表达基因。
具体做法：首先以oligo-dT为引物，从tester中制备放射性标记的单链cDNA 文库。
目的基因的获取方法
目的基因的获取方法目的基因的获取方法是基因工程研究中的重要一环，它涉及到基因的定位、克隆、转染等一系列操作。
在进行目的基因获取时，科学家们需要遵循一定的步骤和技术，以确保目的基因的准确获取和稳定表达。
下面将介绍一些常用的目的基因获取方法。
首先，基因定位是获取目的基因的第一步。
通过PCR、Southern blotting等技术，科学家们可以准确地定位到目的基因在细胞或生物体中的位置，为后续的克隆和转染奠定基础。
其次，基因克隆是目的基因获取的关键步骤。
科学家们可以利用质粒、原核生物或酵母等载体系统，将目的基因从细胞或生物体中克隆出来。
这一过程需要利用限制性内切酶、连接酶等酶切和连接技术，以确保目的基因的完整性和准确性。
接着，目的基因的转染是获取目的基因的另一重要步骤。
科学家们可以利用质粒转染、病毒载体转染等技术，将目的基因导入到细胞或生物体中，实现其稳定表达和功能研究。
此外，目的基因的获取还可以通过基因编辑技术实现。
CRISPR/Cas9、TALEN、ZFN等基因编辑技术可以精准地编辑基因组，实现目的基因的定点修饰和获取。
最后，为了确保目的基因的稳定性和可控性，科学家们还需要进行基因的筛选和鉴定。
通过PCR、Western blotting、荧光染色等技术，科学家们可以对目的基因进行筛选和鉴定，确保其在细胞或生物体中的准确表达和功能发挥。
总之，目的基因的获取是基因工程研究中的重要一环，它涉及到基因定位、克隆、转染、编辑、筛选和鉴定等一系列技术和步骤。
科学家们需要结合实际研究需求和具体操作，选择合适的方法和技术，以确保目的基因的准确获取和稳定表达。
希望本文介绍的方法能够对相关研究工作提供一定的参考和帮助。
生物技术制药复习题
生物技术制药复习题第一章绪论第一节生物技术的发展史1、生物技术：以生命科学为基础，利用生物体的特性和功能，设计构建具有与其性状的新物种或新品系，并与工程结合，利用这样的新物种进行加工生产，为社会提供商品服务的一个综合性技术体系。
它的范畴：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程。
基因工程是生物技术的核心。
P12、蛋白质工程----第二代基因工程；海洋生物技术-----第三代生物技术P13、生物技术发展史：传统、近代（抗生素、发酵罐）、现代（DNA重组）P31974年，Boyer和Cohen建立了DNA重组技术1975年，Koher 和Milstein 建立了单克隆抗体技术1982年，第一个基因工程药物重组人胰岛素被批准上市1989年，我国第一个基因工程药物干扰素批准上市2003年，中国的重组腺病毒-p53注射液成为石阶上第一个正式批准的基因治疗药物。
第二节生物技术药物1、生物技术制药：生物技术制药：采用现代生物技术人为地创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品。
P42、生物技术药物：采用DNA重组技术活其他生物技术研制的蛋白质或核酸类药物。
它与天然生化药物、微生物药物、海洋药物和生物制品共同归为生物药物。
3、现代生物药物分为4类：重组DNA技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂；基因药物；天然药物；合成与部分合成药物。
4、生物药物按用途分为：治疗药物；预防药物；诊断药物。
5、生物技术药物的特征：（1）分子结构复杂；（2）具有种属特异性；（3）治疗针对性强、疗效高；（4）稳定性差（5）基因稳定性；（6）免疫原性；（7）体内半衰期短；（8）受体效应；（9）多效性和网络性效应；（10）检验的特殊性。
第三节生物技术制药1、生物技术制药的特征：高技术、高投入、长周期、高风险、高收益。
P52、生物技术在制药中的应用有哪些？P7（1）基因工程制药：① 开发基因工程药物，如干扰素（IFN）、红细胞生成素（EPO）等②基因工程疫苗，如乙肝基因工程疫苗③基因工程抗体，它可以作为导向药物的载体④基因诊断与基因治疗⑤应用基因工程技术建立新药的筛选模型⑥应用极影工程激活素改良菌种，产生新的微生物药物⑦改进药物生产工艺⑧利用转基因动、植物生产蛋白质类药物。
目的基因的获得PPT课件
1.1 已知序列基因的PCR扩增 ⑴引物设计； ⑵引物效果检验和PCR参数确定。
5
1.2 RT-PCR
原理： 利用逆转录酶能将mRNA逆转录成
cDNA的特性，通过合适的引物，将细胞 内的mRNA逆转录成cDNA。
然后，通过PCR技术，将痕量的cDNA 扩增成大量的双链DNA。
6
逆转录步骤
cDNA 链合成： 一般利用polyT作为引物，也可用特异 性的序列作为引物
1
目的基因
需要克隆的DNA片段。
编码某种蛋白质
研究某基因结构 和功能的关系
研究某基因与 疾病的关系
2
目的基因
1.1 已知序列基因的PCR扩增 1.2 RT-PCR 1.3 RACE (cDNA末端的快速扩增)
然后根据核心序列设计引物。 来源：蛋白质、cDNA
10
RACE的技术流程
⑵ 设计简并引物和扩增核心区域
11
RACE的技术流程
⑶ 设计RACE引物并进行3‘RACE和5’RACE
扩增的核心区域克隆和测序后，既获得目的基因 中间部分的序列，根据这一序列分别设计RACE引物。
3‘RACE：
上游引物：根据中间核心序列设计 下游引物：oligo（dT） 利用cDNA第一链为模板将cDNA3’端扩增出来
17
思考题：
目的基因的获得方式有哪些？
18
个人观点供参考，欢迎讨论！
M=A、C、G N=A、G、C 、T 2.2 以5‘端随机引物和3’锚定引物进行PCR 2.3 PAGE 2.4 回收差异条带，利用差异条带法获取目的基因
1979年，Khornan等首次用化学的方法 合成了一种具有生物活性的大肠杆菌酪氨 酸转移酶核糖核酸基因，开创了基因化学 合成的先例。
获取目的基因的四种方法
获取目的基因的四种方法标题：探索获取目的基因的四种方法简介：基因是决定生物特征和功能的遗传物质，而获取目的基因是现代生物学和医学研究中的一个重要步骤。
本文将介绍和探讨获取目的基因的四种方法，包括传统的遗传改造、基因克隆、CRISPR-Cas9技术和人工合成基因，以帮助读者深入理解这些方法的原理、应用和前景。
正文：一、传统的遗传改造方法传统的遗传改造方法是获取目的基因的最早方法之一。
通过基因突变、杂交繁育和选择性育种等手段，研究人员可以选出具有特定性状的个体和品系，并通过交配和后代选择迅速积累和固定目的基因。
这种方法在农业、畜牧业和植物育种中具有广泛应用，但受限于对目标基因的了解程度和遗传背景的限制。
二、基因克隆技术基因克隆技术是获取目的基因的一种重要方法。
通过克隆目的基因的DNA序列并将其插入到目标生物的染色体中，研究人员可以实现目的基因的转导和表达。
这种方法常用于基因表达和功能研究，同时也为基因治疗和工程学提供了基础。
虽然基因克隆技术在获取目的基因方面取得了一定的成功，但其复杂、耗时和昂贵的操作限制了其广泛应用。
三、CRISPR-Cas9技术CRISPR-Cas9技术是一种革命性的基因编辑工具，也是获取目的基因的一种重要方法。
该技术利用CRISPR序列和Cas9蛋白质的配对作用，实现对目标基因的高效、准确和精确的编辑。
研究人员可以利用CRISPR-Cas9技术在基因组中删除、插入或修改目的基因，从而研究和改造生物体的特定基因。
CRISPR-Cas9技术在基础研究、疾病治疗和农业生产等领域具有广阔的前景。
四、人工合成基因人工合成基因是获取目的基因的一种新兴方法。
通过化学合成和无模板扩增等技术，研究人员可以设计和构建具有特定功能和特征的合成DNA序列，并将其注入到宿主生物体中。
这种方法不仅可以克服天然基因的限制和复杂性，还可以实现对目的基因的高度灵活和精确控制。
人工合成基因在合成生物学、生物制药和人工代谢途径设计等领域具有重要应用价值。
基因工程获取目的基因的方法
基因工程获取目的基因的方法1. 基因工程的简单介绍基因工程，这个听起来有点高大上的词，其实就像是在改造一个玩具，让它变得更好、更酷。
说白了，就是人类学会了如何操控基因这把“钥匙”，让我们可以“开锁”到各种各样的生物特性。
想象一下，科学家们就像是小孩子在玩拼图，他们把不同的基因拼接在一起，想要创造出全新的“图案”。
这可不只是好玩，还是对医疗、农业等领域的重大贡献呢！那么，如何获取这些“拼图块”呢？这就需要一些技巧了。
我们可以用不同的方法把目标基因从大自然中找出来，或者是从细胞里“偷”出来。
别着急，接下来就带大家看看这几种常见的方法。
2. 常用的方法2.1 PCR技术首先，要提到的就是PCR技术。
PCR就像是基因的复印机，能把你需要的基因快速“复制”出来。
这一过程其实并不复杂，只需几个步骤：首先，科学家们要准备好一段DNA链，就像准备好一张需要复印的纸。
接着，添加一些特定的酶和引物，这些小家伙就像是复印机的墨水和纸张，没了它们，复印机可就没法工作了。
然后，通过加热和降温的循环，DNA就会不断地“翻倍”，仿佛在开Party一样，越来越多的人涌进来。
最后，经过几个小时的“忙碌”，你就能得到大量的目标基因！听起来简单吧？当然，实际操作中还有很多细节需要注意，不然就会像做菜时放盐放多了，味道就变了。
2.2 基因克隆接下来是基因克隆，这是一种更为传统的获取目标基因的方法。
想象一下，你的家里有一盆漂亮的花，你希望能有更多的相同花。
于是你从花的根部剪下一个小枝条，插到土里，就能长出一模一样的花。
这就是克隆的基本原理。
在实验室里，科学家们会从细胞中提取目标基因，然后把它放进一个细菌或酵母的载体中。
这就好比给这个小细菌一个“任务”，让它去生产出更多的目标基因。
只需耐心等待，经过一段时间，小细菌们就会疯狂地繁殖，结果就是，你可以收获一大堆的目标基因。
2.3 CRISPR技术最后，咱们要聊聊时下最火的CRISPR技术。
CRISPR听起来像是科幻电影里的名词，但其实它是一种革命性的基因编辑工具。
基因克隆：差异表达基因的获得
RACE:g
筛选 2.4×106 pfu 获得了 9 个 cDNA分子; RACE: 用 0.5 µ mRNA 生产并筛选了数 g 百个重组质粒（不到 0.05%的 RACE产 物），分离到 29个不同的 cDNA克隆 ; 可 由 表 达 丰 度 极 低 （ 2 copise/cell ） 的 mRNA产生 cDNAs; 全长 cDNA 可从部分序列重叠的3’和5’ RACE产物进行重组，或通过分析3’和5’ RACE产物末端序列重新设计引物用 RTPCR扩增。
扩增子（amplicon）的制备：用Bam H1、
Bgl II 和 Hind III 酶切 tester 和 driver 组 DNA，并与有相应酶切位点的去磷酸化 的第一套 R-24/12 adaptor（先从50℃ 10℃ 逐 渐 退 火 1h ） 连 接 ， 加 入 R-24 adaptor 引物，72 ℃补平5’-端后PCR 扩增； 酶切消化 amplicon，去除 adaptor 序列； 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离 DNA ， 回 收 纯 化 150-1500 bp 大小片段（2-10% of total genome）
RACE
Rapid Amplification of cDNA Ends ( RACE ): a method used to amplify and clone the region between a single short sequence in a cDNA molecule and its unkown 3’ or 5’ end
RT-PCR
总RNA 的提取：异硫氰酸胍-酚-氯仿抽
提一步法；
甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析其质量，
观察所提RNA有无明显降解；
第四节基因差异表达获得目的基因
差异显示PCR（DDRT-PCR）
DDRT-PCR：基于PCR的mRNA差异显示技术 在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或
细胞中发生的不同基因，按时间、空间进行有序的表达 方式，称为基因的差异表达。
真核基因总数约为100 000个，但在一定的发育阶段、 在某一类型细胞当中，则只有15%左右的基因得以表达， 产生出大约15 000种不同的mRNA分子。
的mRNA序列，在5’端又设计了20种10bp长的随机
引物。
5’
mRNA
3’
AAAAAAAAAAAAAAAA
NM 3’
TTTTTTTT
5’
RT
cDNA 3’
NM TTTTTTTT 5’
5’
NNNNNNNNNN 3’
cDNA第二链，并PCR
（3）用一种3’锚定引物和一种5’随机引物进行扩增
实验结果：
（2）有些基因比较短，化学合成费用较低
2. 合成引物（20mer左右） 3. 合成探针序列 4. 定点突变合成
合成带有定点突变的基因片断。
5. 合成人工接头或衔接物
含有各种酶切位点的人工接头（Adaptor） 或衔接物（Linker）序列。
EcoRI Adaptor EcoRI Linker
DNA合成仪
在测序胶上，每组扩出50-100条长度为 100-500bp的带。 引物组合：
12种锚定引物，若与20种随机引物，可 组成240组引物。
240组能分出20000多条带！
如 果 每 条 带 相 当 于 一 种 mRNA ， 20000 mRNA基本上反映了一种特定细胞中全部的 mRNA。
（4）随机-锚定引物PCR的产物电泳比较
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利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增
（1）3’ 锚定引物
利用mRNA的poly A尾巴设计
Oligo（ dTMN） ：Oligo（ dT） 引 物 的 3’ 端 加 两 个 核 苷 酸 （ 倒 数第二个不再是T）。
M：A、G or C N: A、G、T or C
5’
mRNA
3’
AAAAAAAAAAAAAAAA
这些引物由11~12个T及 两个其它的碱基组成，用 通 式 5’-T11MN 或 5’-T12MN 表示。
使用这种锚定引物， 可 以 将 整 个 mRNA 群 体 在 cDNA 水 平 上 ， 分 成 大 致 相等但序列结构不同的12 份亚群体。
（2）5’端的随机引物
同时为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性
一、化学合成目前常用的方法
磷酸二酯法、 亚磷酸三酯法、 自动化合成法。
磷酸三酯法、 固相合成法、
二、化学合成DNA片断的组装
1、互补延伸连接法
预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作
为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完
整的双链。
5’
3’
Klenow片段 引物
5’
3’
T4多核苷酸激酶 T4DNA连接酶
在测序胶上，每组扩出50-100条长度为 100-500bp的带。 引物组合：
12种锚定引物，若与20种随机引物，可 组成240组引物。
240组能分出20000多条带！
如 果 每 条 带 相 当 于 一 种 mRNA ， 20000 mRNA基本上反映了一种特定细胞中全部的 mRNA。
（4）随机-锚定引物PCR的产物电泳比较
本章重点掌握的分离方法及主要特点
5’
3’
2、互补连接法 （1）互补配对
预先设计合成的片断之间都有互 补区域，不同片断之间的互补区 域能形成有断点的完整双链。
（2）5’端磷酸化 （合成的DNA单链的5’端是-OH） T4多核苷酸激酶
（3）T4 DNA连接酶连接 完整的DNA双链
三、 化学合成的应用
1.全基因化学合成 （1）mRNA的含量很低，很难操作cDNA
相同引物对在不同来源cDNA中的PCR产物并排电泳
选择有差异的带，回收测序，得到部分cDNA序列。 再通过筛选等各种方法获得全长cDNA或基因。
优点：速度快、操作简单、灵敏度高、样品需要量 少等；
缺点：假阳性率高、获得的cDNA片段很短。
第五节 基因的化学合成
1976年H.G. Khorana提出了用化学方法合成基因的 设想，并于1979年在science上发表了率先成功地 合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。
（2）有些基因比较短，化学合成费用较低
2. 合成引物（20mer左右） 3. 合成探针序列 4. 定点突变合成
合成带有定点突变的基因片断。
5. 合成人工接头或衔接物
含有各种酶切位点的人工接头（Adaptor） 或衔接物（Linker）序列。
EcoRI Adaptor EcoRI Linker
DNA合成仪
NM TTTTTTTT 3’
5’
12种锚定引物
3’ AG TTTTTTTT 5’ 3’ CG TTTTTTTT 5’ 3’ GG TTTTTTTT 5’ 3’ TG TTTTTTTT 5’ 3’ AA TTTTTTTT 5’ 3’ CA TTTTTTTT 5’ 3’ GA TTTTTTTT 5’ 3’ TA TTTTTTTT 5’ 3’ AC TTTTTTTT 5’ 3’ CC TTTTTTTT 5’ 3’ GC TTTTTTTT 5’ 3’ TC TTTTTTTT 5’
第四节 基因差异表达获得目的基因
差异显示PCR（DDRT-PCR）
DDRT-PCR：基于PCR的mRNA差异显示技术 在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或
细胞中发生的不同基因，按时间、空间进行有序的表达 方式，称为基因的差异表达。
真核基因总数约为100 000个，但在一定的发育阶段、 在某一类型细胞当中，则只有15%左右的基因得以表达， 产生出大约15 000种不同的mRNA分子。
的mRNA序列，在5’端又设计了20种10bp长的随机
引物。
5’
mRNA
3’
AAAAAAAAAAAAAAAA
NM 3’
TTTTTTTT
5’
RT
cDNA 3’
NM TTTTTTT 3’
cDNA第二链，并PCR
（3）用一种3’锚定引物和一种5’随机引物进行扩增
实验结果：