荧光抗体技术制备和基本结构要求
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利用一定波长的激发光对样 品进行激发，产生一定波长的 荧光，对样品结构或其组分进 行定性、定位、定量观察检测。
荧光显微镜的基本结构
荧光显微镜
➢光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯 ➢滤光片：隔热、激发和吸收滤光片 ➢光路：透射光、落射光 ➢聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器 ➢镜头：消色差镜头
荧光显微镜的基本结构
应用
异硫氰酸荧光素 (FITC) 490～495nm 520～530nm （黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定
四乙基罗丹明 (RB200) 570～575nm 595～600nm（橙红色） FITC的衬比染色或双标记 FAT
四甲基异硫氰酸罗丹明 (TRITC) 藻红蛋白（PE）
7-氨基-4-甲基香豆素 Eu3+螯合物
荧光的基本知识
荧光效率
定义:荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率
计算公式: 荧光效率=
发射荧光的光量子数（ 荧光强度） 吸收光的光量子数（激 发光强度）
荧光的基本知识
荧光寿命
➢定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程 度时所用的时间。 ➢各种荧光物质的荧光寿命不同。
荧光的基本知识
荧光淬灭
❖抗体效价：双向免疫扩散试验 ❖抗体特异性：吸收试验、抑制试验 ❖抗体抗体特异性染色滴度：倍比稀释
荧光抗体的制备
荧光抗体的保存
❖-20℃：保存1～2年 ❖真空干燥：长期保存
二、标本的制作
标本的类型
组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用） 印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织 涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬液 培养细胞：单层培养细胞
荧光显微镜
滤光片
隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。 激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见波长 的光域，提供合适的激发光。 吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过， 保护眼睛。
荧光抗体的制备
抗体的荧光素标 记
❖标记原理:利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液 中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。 ❖标记方法:
搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间 短， 荧光素用量少，但有非特异性染色。
透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀， 非特异染色较低。
荧光抗体的制备
荧光抗体的纯化
❖去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤 ❖去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法 ❖去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收
荧光抗体的制备
荧光抗体的鉴定
❖荧光素与蛋白结合率：
F/P=
2.87 A495nm A280nm 0.35 A495nm
550nm
490-560nm 354nm 340nm
620nm（橙红色）
595nm（红色） 430nm（蓝色） 613nm
FITC的衬比染色或双标记 FAT 双标记FAT、流式细胞术
双标记或多标记FAT 时间分辨荧光免疫测定
第二节 荧光抗体技术
荧光抗体技术的基本原理
荧光素标记抗体与切片中组织细胞抗原反应，洗 涤分离后荧光显微镜观察呈现特异荧光的抗原抗体复 合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检测， 或对自身抗体进行定性和滴度测定。
定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消 退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高（≥20℃）、苯胺、酚、 硝基苯、I-等 。
荧光的基本知识
荧光偏振
FH－FL P＝──────
FH＋FL
二、荧光物质
荧光物质是一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。
常用的荧光物质
荧光物质
最大吸收光谱
最大发射光谱
荧光抗体技术制备和 基本结构要求
一、标本的制作 二、荧光抗体的制备 三、荧光抗体染色与结果判断 四、荧光显微镜的基本结构 第三节 荧光免疫分析的类型 一、时间分辨荧光免疫测定 二、荧光偏振免疫测定 三、荧光酶免疫测定
第四节 荧光免疫技术在医学检验中的应用 一、荧光抗体技术的应用 二、荧光免疫测定的应用
荧光抗体技术的内容
荧光抗体制备 标本制作 荧光抗体染色 荧光显微镜检查
一、荧光抗体的制备
抗体要求
高特异性 高亲和力 经纯化提取IgG
荧光抗体的制备
荧光素要求
❖有能与蛋白质形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解 离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。 ❖荧光效率高，与蛋白质结合后，仍保持较高的荧光效率。 ❖荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。 ❖与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。 ❖标记方法简单、安全无毒。 ❖与蛋白质的结合物稳定，易于保存。
标本的制作
组织切片的类型
➢冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细胞结构欠清晰。 ➢石蜡切片：组织细胞结构显现清楚，抗原损失多。
标本的制作
标本的固定和保存
➢固定剂：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等 ➢保 存：4℃、-20℃
三、荧光抗体染色及结果判断
直接法
荧光素标记的特异 性抗体直接与相应 抗原反应。
直接荧光抗体染色法示意图
荧光抗体染色及结果判断
荧光抗体染色结果判断
“-”：无或仅见极微弱荧光。 “+”：荧光较弱但清楚可见。 “++”：荧光明亮。 “+++”：耀眼强荧光。 特异荧光强度“++”以上判定为阳性，对照光应呈“-”或 “±”。 根据呈"++"的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。
四、荧光显微镜的基本结构
荧光显微镜
荧光抗体染色及结果判断
间接法
特异性抗体与相应抗 原反应，荧光素标记 的抗抗体再与第一抗 体结合。
源自文库间接荧光抗体染色法示意图
荧光抗体染色及结果判断
双标记法
两种荧光素分别标记的两种不同的特异性抗体， 与同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜色荧光。
荧光抗体染色及结果判断
荧光抗体染色结果判断
设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型
思考题 小结
第一节 概 述
一、荧光的基本知识
荧光（fluorescence）
荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃 迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释 放出能量，称为荧光。
荧光的基本知识
发射光谱和激发光谱
➢发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录的样 品发射荧光的强度。 ➢激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发 光激发样品记录的相应的荧光发射强度。
荧光显微镜的基本结构
荧光显微镜
➢光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯 ➢滤光片：隔热、激发和吸收滤光片 ➢光路：透射光、落射光 ➢聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器 ➢镜头：消色差镜头
荧光显微镜的基本结构
应用
异硫氰酸荧光素 (FITC) 490～495nm 520～530nm （黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定
四乙基罗丹明 (RB200) 570～575nm 595～600nm（橙红色） FITC的衬比染色或双标记 FAT
四甲基异硫氰酸罗丹明 (TRITC) 藻红蛋白（PE）
7-氨基-4-甲基香豆素 Eu3+螯合物
荧光的基本知识
荧光效率
定义:荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率
计算公式: 荧光效率=
发射荧光的光量子数（ 荧光强度） 吸收光的光量子数（激 发光强度）
荧光的基本知识
荧光寿命
➢定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程 度时所用的时间。 ➢各种荧光物质的荧光寿命不同。
荧光的基本知识
荧光淬灭
❖抗体效价：双向免疫扩散试验 ❖抗体特异性：吸收试验、抑制试验 ❖抗体抗体特异性染色滴度：倍比稀释
荧光抗体的制备
荧光抗体的保存
❖-20℃：保存1～2年 ❖真空干燥：长期保存
二、标本的制作
标本的类型
组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用） 印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织 涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬液 培养细胞：单层培养细胞
荧光显微镜
滤光片
隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。 激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见波长 的光域，提供合适的激发光。 吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过， 保护眼睛。
荧光抗体的制备
抗体的荧光素标 记
❖标记原理:利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液 中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。 ❖标记方法:
搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间 短， 荧光素用量少，但有非特异性染色。
透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀， 非特异染色较低。
荧光抗体的制备
荧光抗体的纯化
❖去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤 ❖去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法 ❖去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收
荧光抗体的制备
荧光抗体的鉴定
❖荧光素与蛋白结合率：
F/P=
2.87 A495nm A280nm 0.35 A495nm
550nm
490-560nm 354nm 340nm
620nm（橙红色）
595nm（红色） 430nm（蓝色） 613nm
FITC的衬比染色或双标记 FAT 双标记FAT、流式细胞术
双标记或多标记FAT 时间分辨荧光免疫测定
第二节 荧光抗体技术
荧光抗体技术的基本原理
荧光素标记抗体与切片中组织细胞抗原反应，洗 涤分离后荧光显微镜观察呈现特异荧光的抗原抗体复 合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检测， 或对自身抗体进行定性和滴度测定。
定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消 退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高（≥20℃）、苯胺、酚、 硝基苯、I-等 。
荧光的基本知识
荧光偏振
FH－FL P＝──────
FH＋FL
二、荧光物质
荧光物质是一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。
常用的荧光物质
荧光物质
最大吸收光谱
最大发射光谱
荧光抗体技术制备和 基本结构要求
一、标本的制作 二、荧光抗体的制备 三、荧光抗体染色与结果判断 四、荧光显微镜的基本结构 第三节 荧光免疫分析的类型 一、时间分辨荧光免疫测定 二、荧光偏振免疫测定 三、荧光酶免疫测定
第四节 荧光免疫技术在医学检验中的应用 一、荧光抗体技术的应用 二、荧光免疫测定的应用
荧光抗体技术的内容
荧光抗体制备 标本制作 荧光抗体染色 荧光显微镜检查
一、荧光抗体的制备
抗体要求
高特异性 高亲和力 经纯化提取IgG
荧光抗体的制备
荧光素要求
❖有能与蛋白质形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解 离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。 ❖荧光效率高，与蛋白质结合后，仍保持较高的荧光效率。 ❖荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。 ❖与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。 ❖标记方法简单、安全无毒。 ❖与蛋白质的结合物稳定，易于保存。
标本的制作
组织切片的类型
➢冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细胞结构欠清晰。 ➢石蜡切片：组织细胞结构显现清楚，抗原损失多。
标本的制作
标本的固定和保存
➢固定剂：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等 ➢保 存：4℃、-20℃
三、荧光抗体染色及结果判断
直接法
荧光素标记的特异 性抗体直接与相应 抗原反应。
直接荧光抗体染色法示意图
荧光抗体染色及结果判断
荧光抗体染色结果判断
“-”：无或仅见极微弱荧光。 “+”：荧光较弱但清楚可见。 “++”：荧光明亮。 “+++”：耀眼强荧光。 特异荧光强度“++”以上判定为阳性，对照光应呈“-”或 “±”。 根据呈"++"的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。
四、荧光显微镜的基本结构
荧光显微镜
荧光抗体染色及结果判断
间接法
特异性抗体与相应抗 原反应，荧光素标记 的抗抗体再与第一抗 体结合。
源自文库间接荧光抗体染色法示意图
荧光抗体染色及结果判断
双标记法
两种荧光素分别标记的两种不同的特异性抗体， 与同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜色荧光。
荧光抗体染色及结果判断
荧光抗体染色结果判断
设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型
思考题 小结
第一节 概 述
一、荧光的基本知识
荧光（fluorescence）
荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃 迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释 放出能量，称为荧光。
荧光的基本知识
发射光谱和激发光谱
➢发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录的样 品发射荧光的强度。 ➢激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发 光激发样品记录的相应的荧光发射强度。