205菌种复苏、传代、保存、使用、销毁标准操作规程

1 目的

规范微生物学检定用菌的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。

2 适用范围

本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等。

3 术语

3.1 标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。

3.2 传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。

3.3 工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。

3.4 菌种的传代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。

4 职责

4.1 品管部主管负责菌种的申购、接收、保存、分发。

4.2 微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。

5内容

5.1冻干菌种的复苏

菌种复苏、接种在超净工作台内按无菌操作要求进行。准备好菌种安瓿管（安瓿管从冰箱取出后首先置室温30分钟）、灭菌的毛细滴管、培养皿、镊子、1ml注射器（配有长针头）、营养肉汤培养基、灭菌水及琼脂斜面，将以上物品移入菌

种室，用75%乙醇棉球擦净安瓿管外壁放在无菌培养皿内晾干，点燃酒精灯，将安瓿管的封口一端在火焰烧灼红热，用毛细管吸取灭菌水少许滴在灼热处，使其骤冷而炸裂。在不离开火焰圈内，迅速用1ml注射器抽取0.3ml肉汤培养基加入安瓿管内并摇动使冷冻块溶解，摇匀。用注射器吸取该安瓿管中内溶物分别接种至1支肉汤培养基、2支琼脂斜面培养基。将接种后的肉汤及培养基斜面根据菌种特性分别置于菌种相适宜的温度培养，培养完毕，取出培养物，用无菌接种环蘸取少许肉汤培养物，然后在平皿接种处进行划线使其形成单菌落，根据菌种特性分别置于适宜的温度下培养18-24小时，进行革兰染色镜检及相应的生化试验或采用细菌鉴定条对其进行确认。如不符合要求，应及时与生产商联系。

5.2菌种传代

5.2.1准备

准备需用的培养基斜面，在培养基管上贴注牢固的标签，标签上注明菌名及接种日期。

自冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入菌种室，一般每菌的传代数量比每月正常使用量多1-2管。

5.2.2传代方法

在超净工作台内的酒精灯火焰圈内，左手握住菌种斜面管，将管口靠近火焰旁,右手拿接种针后端，将接种针烧红30秒，随后将全部接种针的金属部分从前至后在火焰上烧灼，往返3次，右手用无名指、小指及掌部夹住硅胶塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手轻轻拔开塞子，将接种针伸入管内，先至菌种斜面的上部，试触无细菌生长的空白处，待接种针冷却后，轻刮菌苔，取待接种琼脂管，同上述操作轻拔塞子将接种针轻贴斜面表面由底向上，曲折移动；

5.2.3培养

白色念珠菌置20-25℃培养24小时，其余细菌30-35℃培养22-24小时。每次传

代完毕，传代人应及时填写菌种传代/使用/销毁记录。

5.2.4存放与使用

待充分生长后，将培养好的新鲜菌种管1支作为传代菌种，其余作为工作菌种。分别置2-8℃的冷藏柜保藏，专人保管，需使用菌种时，应向负责菌种保管的人员领取, 并及时填写菌种传代/使用/销毁记录。

5.2.5传代频率

传代菌种必须定期传代，菌种1-3月传代一次。

5.3 菌种的编号

5.3.1 采用字母加数字表示：英文缩写字母—代次—传代日期—顺序号

5.3.2 菌种的英文缩写字母：大肠埃希菌（E.c）、金黄色葡萄球菌（S.a）、枯草芽孢杆菌（B.s）、白色念珠菌（C.a）、黑曲霉菌（A.n）、乙型副伤寒沙门菌（S.p）5.3.3 代数用一位带有下标数字的字母表示：传代用菌种用G表示；工作用菌种用W表示；如G3表示传代用菌种第3代；W3表示工作用菌种第3代。

5.3.4 传代日期用6位数字表示：年份取最后两位数，月、日分别用两位数。如2012年1月12日传代的第一支大肠埃希菌作为传代用菌种的编号为：-120112-01。

E.c-G

3

5.4 菌种的保管

5.4.1 菌种设专人保管，并对所保存的菌种建立《菌种购买及发放记录》。

5.4.2 菌种的定期检查与鉴定

在菌种的保存期间，应每天检查保存菌种冰箱的温度、菌种管的塞子是否松动或生霉，并及时填写《菌种观察记录》，如有异常应及时处理。

5.4.3 所保管的菌种，不能随意转让其他单位和个人，需要时应有单位证明和批准手续方可供应。

5.5 菌种的领用与使用

5.5.1 微生物学检验人员根据检验需要，到菌种保管人员处领取工作用菌种或传代用菌种，同时填写《菌种传代/使用/销毁记录》相关内容。

5.5.2 微生物学检验人员菌种保管人员处领取工作用菌种或传代用菌种，用于日常检验或验证试验，使用后及时填写《菌种传代/使用/销毁记录》，以便追踪菌种使用历史。

5.6 菌种（废弃）的销毁

5.6.1 下列情况的菌种或培养物或被污染的器具等，必须采用121℃、30分钟湿热灭活处理；

5.6.1.1 新一代菌种制备成功后的上一代菌种；

5.6.1.2 使用完后的菌种和带有标准菌种的器具和培养物；

5.6.1.3 超过有效期的菌种；

5.6.1.4 凡被污染、变异、可疑等异常情况菌种；

5.6.1.5 其他应废弃的菌种。

5.6.2 废弃菌种的销毁由品管部主管批准后，由微生物学检验员进行灭活处理，并有其他人在场监督，并填写《菌种传代/使用/销毁记录》和《微生物检验废弃物处理记录》。

5.7 记录归档

本标准涉及的记录由品管部保存，保存期5年。

6 相关文件和记录

《菌种购买及发放记录》

《菌种观察记录》

《菌种传代/使用/销毁记录》

《微生物检验废弃物处理记录》