引物设计原则及酶切位点选择和设计
引物设计原则及酶切位点选择和设计
引物设计原则及酶切位点选择和设计：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用[整理]载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来T连入质粒中的重要目的酶切，所以感到还是直接扩增好一点。
但这就需要你仔细设计引物。
扩增出靶基因的时候在核就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR可以在质粒的图谱说明书上酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，找取相应的位点，进行设计。
（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题往往导致两个，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，两个位点应是载体上的，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。
只能切一个，酶都切不好。
因此，紧挨在一起，还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如promega的说明书上说，最好隔四个。
我看AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。
两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。
最好使用酶切效率高的。
的酶。
最好使用双酶切有共同buffer最好使用自己实验室有的酶，这样可，ecor1等），最好使用较常用的酶（如hind3，bamh1以省钱。
的问题，很多的战友都有疑惑。
其实园子里有很多的解释了。
的计算，关于TmTm大家可以理解，双链溶解所需的温度。
即是DNA叫溶解温度（melting temperature, Tm），Tm因此，的溶解是没有作用的。
而不互补的区域对DNA 这个温度是由互补的DNA区域决定的，（除时，只计算互补的区域Tm才有贡献。
计算Tm只有和模板互补的区域对对于引物的Tm，过低，是因为他们误把保护碱。
不少战友设计的引物都Tm 非你的酶切位点也与模板互补）反应的诸多困难。
引物设计原则及酶切位点选择和设计
引物设计原则及酶切位点选择和设计1.引物长度：引物长度通常在15-30个碱基对之间，过短的引物可能无法在目标DNA上特异性结合，而过长的引物则会增加非特异性杂交的风险。
2.引物GC含量：引物应具有适度的GC含量，一般在40-60%之间，以确保引物的稳定性和特异性结合能力。
3.引物互补性：引物对的互补性应满足一定的要求，即引物内部无内部连续互补序列，以免引物产生二次结构或引发非特异性杂交。
4.引物末端设计：引物设计时应考虑5'端和3'端的碱基配对，确保引物在目标序列上合理附着并提高扩增效率。
5.引物目标区域选择：引物的目标区域应在目标序列上具有充分的特异性，尽量避免引物与非目标序列相互作用。
酶切位点选择和设计：1. 利用enzyme切割DNA是一种常见的分子生物学技术，合理选择和设计酶切位点十分重要。
酶切位点应在目标序列中具有充分的特异性，尽量避免位点在非目标序列中出现，以避免非特异性切割。
2.酶切位点的选择应考虑应用的需求，例如PCR扩增、限制性酶切鉴定等。
对于PCR扩增，可根据目标序列设计引物，保证引物包含酶切位点，同时也满足引物设计的原则；对于限制性酶切鉴定，应选择与限制性酶切位点有相关性的序列。
3.酶切位点的设计还应注意酶切位点周围的序列，避免引物或其他片段在PCR扩增过程中产生不必要的相互作用。
4.酶切位点的设计还需注意所选择的酶切酶的酶切活性，以确保酶能够切割目标序列，并尽量减少切割非目标序列的风险。
5.在实验设计中，还需考虑酶切位点的数量以及其相对位置，尽量避免多个位点靠得太近或相互重叠，以减少酶切产生的DNA片段数目和长度。
同时还需注意位点之间的横向特异性，以避免相同或相似的位点出现在非目标序列中。
总之，引物设计和酶切位点选择是分子生物学实验中关键的环节，合理的设计和选择能够提高实验的特异性和效率，有助于更好地进行目标序列扩增和酶切等操作。
引物设计原则
引物设计原则
1.合适的引物长度：引物长度通常在18-30个碱基对之间，过长或过
短的引物都不利于PCR扩增的稳定性。
2.适当的引物GC含量：引物的GC含量应在40%-60%之间，过高或过
低的GC含量都会影响引物和模板DNA的特异性结合。
3.引物特异性:引物应具有高度特异性，可以通过引物序列在数据库
中进行BLAST分析来评估引物的特异性。
4.避免引物自身的二聚体和结构性：引物序列中要避免出现自身二聚
体和结构性，这会干扰PCR扩增的效果。
5.选择高峰结构引物：在引物设计时，优先选择会形成高峰结构的引物，这有助于提高扩增效率。
6.引物末端碱基的特异性：在引物末端碱基选择时，尽量使用能够增
强特异性和避免非特异性扩增的碱基。
7.引物的熔解温度（Tm）：引物的熔解温度直接影响PCR扩增反应的
特异性和效率，应根据目标DNA的长度和序列来确定引物的Tm。
8.避免引物之间的交叉杂交：在多引物PCR反应中，引物之间的交叉
杂交会干扰扩增效果，可以通过软件模拟或实验确认引物之间没有相互杂交。
9.引物序列中避免多个重复碱基：引物序列中的多个重复碱基可能导
致非特异性扩增，应避免在引物序列中出现连续的多个重复碱基。
10.引物设计的可操作性和经济性：引物设计时，要考虑到引物合成
的成本和操作的方便性，选择价格适中的合成方法，并确保引物容易操作。
以上是引物设计的原则和考虑因素，通过合理设计和优化引物序列，可以提高PCR扩增实验的特异性、敏感性和效率，从而获得准确和稳定的实验结果。
引物设计基本原则
引物设计基本原则引物设计是指在分子生物学研究中，用于扩增目标DNA序列的两个引物的设计。
好的引物设计是成功进行PCR反应的关键之一、下面是引物设计的基本原则：1.引物长度：引物长度一般在18-24个碱基对左右，太短容易引起非特异性扩增，太长则可能导致引物无法与目标序列完全匹配。
2.引物的GC含量：引物的GC含量一般在40-60%之间，太低则可能导致引物无法与目标序列形成稳定的双链结构，太高则可能导致引物与非特异性目标序列发生杂交。
3.引物的熔解温度(Tm)：引物的Tm是指引物与目标序列在溶液中解链的温度。
引物设计时应保证所设计的两个引物的Tm值相似，一般相差不超过2-3摄氏度。
这样可以保证引物在PCR反应中同时结合于目标序列。
4.引物的特异性：引物设计时必须确保引物与目标序列的特异性，即引物在基因组中只与目标序列互补匹配，不与其他非目标序列发生杂交。
为了提高引物的特异性，可以使用生物信息学工具如BLAST进行引物的序列比对和分析。
5.引物的结构：引物设计时应注意引物的序列结构。
首先要避免引物的自身二级结构，特别是避免引物的自身二聚体形成，可以使用在线工具进行预测和评估。
另外，引物的末端最好是链末端，避免引物形成环状结构。
6.引物的位点选择：在设计引物时，应选择位于目标序列上的独特位点作为引物扩增的位点。
这样可以确保引物扩增出的产物是目标序列，而不是其他类似的序列。
7.引物的序列设计：引物设计时应避免序列中出现连续的重复碱基序列，避免过多的GC或AT连续存在。
此外，引物设计时还可以考虑在引物的序列中加入特定的限制性内切酶位点，方便后续分子克隆和分析。
总结起来，引物设计的基本原则包括引物长度、GC含量、Tm值、特异性、结构、位点选择和序列设计。
良好的引物设计是成功进行PCR反应的前提之一，能够提高扩增效率和特异性，并且避免产生非特异性扩增产物。
引物设计原则.
引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1) 引物长度约为16-30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。
太长则比较浪费,且难以合成。
(2) 引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度Tm＝4(G+C)+2(A+T).(3) 四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。
(4) 引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的不配对。
(5) 在引物内, 尤其在3'端应不存在二级结构。
(6) 两引物之间尤其在3'端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量。
两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。
(7) 引物5'端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。
(8) 引物不与模板结合位点以外的序列互补。
所扩增产物本身无稳定的二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响产量。
(9) 简并引物应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的Met, 3'端应不存在简并性。
否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。
引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。
利用紫外分光光度计, 可精确计算引物浓度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算：X mol/L＝OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)X: 引物摩尔浓度,A、C、G、T: 引物中4种不同碱基个数。
分子生物学实验作的并不多，我的几点经验，1 直接查文献照搬别人成功的引物最省事。
引物设计原则及酶切位点选择和设计
引物设计原则及酶切位点选择和设计［整理］:最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用T载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来酶切，所以感到还是直接扩增好一点。
但这就需要你仔细设计引物。
连入质粒中的重要目的就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR扩增出靶基因的时候在核酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，可以在质粒的图谱说明书上找取相应的位点，进行设计。
（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题两个位点应是载体上的，，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。
因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。
我看promega的说明书上说，最好隔四个。
还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG,这样的位点比较难切。
两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。
最好使用酶切效率高的。
最好使用双酶切有共同buffer的酶。
最好使用较常用的酶（如hind3, bamhl, ecorl等），最好使用自己实验室有的酶，这样可以省钱。
Tm的计算，关于Tm的问题，很多的战友都有疑惑。
其实园子里有很多的解释了。
Tm叫溶解温度（melting temperature, Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。
大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。
因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。
计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。
不少战友设计的引物都Tm过低，是因为他们误把保护碱基和酶切位点都计算到Tm里了，最后的结果是导致了PCR反应的诸多困难。
引物设计原及酶切位点选择和设计
引物设计原则及酶切位点选择和设计[整理]：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用T载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来酶切，所以感到还是直接扩增好一点。
但这就需要你仔细设计引物。
连入质粒中的重要目的就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR扩增出靶基因的时候在核酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，可以在质粒的图谱说明书上找取相应的位点，进行设计。
（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题两个位点应是载体上的，，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。
因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。
我看promega的说明书上说，最好隔四个。
还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。
两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。
最好使用酶切效率高的。
最好使用双酶切有共同buffer的酶。
最好使用较常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），最好使用自己实验室有的酶，这样可以省钱。
Tm的计算，关于Tm的问题，很多的战友都有疑惑。
其实园子里有很多的解释了。
Tm叫溶解温度（melting temperature, Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。
大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。
因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。
计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。
不少战友设计的引物都Tm过低，是因为他们误把保护碱基和酶切位点都计算到Tm里了，最后的结果是导致了PCR反应的诸多困难。
引物设计原则
1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2.引物长度一般在15~30碱基之间。
引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。
有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。
若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm 值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4.引物3′端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
5.引物3′端不能选择A，最好选择T。
引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C 错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
6. 碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。
降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物设计原则及酶切位点选择和设计
引物设计原则及酶切位点选择和设计1.引物设计原则：（1）引物长度：引物的长度一般在18-25个核苷酸（nt）之间。
引物过长可能导致不特异性扩增，引物过短则可能无法成功扩增。
（2）碱基组成：引物的碱基组成应该均匀分布，避免特定区域的高GC含量或者低GC含量。
GC含量应在40-60%之间。
（3）避免自身二聚体和互补引物之间的二聚体：引物之间及引物与自身之间不能形成稳定的二聚体，以免影响扩增效果。
二聚体可以通过软件进行预测。
（4）避免非特异性扩增：引物设计时应确保引物序列与其他靶标基因序列无相似性。
（5）避免SNP（单核苷酸多态性）位点：引物的设计应尽量避免SNP 位点，以免扩增产物的多样性。
（6）避免结构性重复区：引物的设计应避免结构性重复区，例如反向重复、环状重复等，以避免扩增产物的粘连。
2.酶切位点选择和设计：酶切位点选择和设计是在DNA或RNA序列的分析中广泛用于限制性酶切消化、DNA片段克隆等操作。
以下是一些常见的酶切位点选择和设计原则：（1）酶的选择：根据实验目的选择适当的酶。
（2）酶切位点的位置：酶切位点应该尽量远离待扩增或分析的区域，以避免酶切对目标序列的影响。
（3）酶切位点的序列：酶切位点应满足酶的识别序列并且没有其他酶切位点。
（4）反相重复片段：酶切位点的设计应避免反相重复片段，以免产生非特异性切割。
（5）引物和酶切位点之间的距离：引物和酶切位点之间的距离应该足够远，以避免酶切位点在扩增反应中的影响。
总之，引物设计原则和酶切位点选择和设计的合理性是实验顺利进行的重要保障。
通过符合引物设计原则、选择合适的引物以及恰当设计酶切位点，可以提高实验的准确性和可重复性。
引物加酶切位点的原理
引物加酶切位点的原理
引物加酶切位点是一种在分子生物学实验中常用的技术，用于引导限制性内切酶切割特定的DNA序列。
其原理如下：
1. 设计引物：首先，根据需要切割的DNA序列，设计两个引物。
这两个引物通常位于目标序列的两端，其序列会与目标序列的末端互补配对。
引物的设计要求尽可能准确，以确保引物与目标序列的互补配对能够稳定形成。
2. 引物结合：将设计好的引物与待切割的DNA序列加热至高温，使其双链DNA解链。
随后，将体系温度降低，使引物与DNA序列的互补链能够重新结合。
3. 添加限制性内切酶：在引物结合的体系中添加限制性内切酶。
限制性内切酶是一类能够识别并切割特定DNA序列的酶。
它
们通常与特定的核酸序列互作，并在该序列特定的位置引发剪切作用。
4. 酶切：限制性内切酶与DNA序列中的酶切位点结合，以酶
切作用切割DNA链。
由于引物结合形成的DNA序列中引入
了酶切位点，因此限制性内切酶能够在这些位点上发挥作用，导致DNA序列在酶切位点处断裂。
5. 分析：酶切作用后，可通过各种分析方法来检测DNA序列
的切割情况。
常见的方法包括琼脂糖凝胶电泳、聚合酶链反应（PCR）、或者直接观察DNA条带的可见性。
总结起来，在引物加酶切位点的方法中，引物的设计与酶切位点的结合是关键步骤。
通过合理设计引物，并选择适合的限制性内切酶，可以实现精确的DNA序列切割。
这对于分子生物
学研究、基因工程、或者遗传性疾病诊断等领域具有重要意义。
各种酶切位点的保护碱基引物设计必看
各种酶切位点的保护碱基引物设计必看酶切位点的保护碱基引物设计在分子生物学领域中起着至关重要的作用。
它们是研究者在酶切实验中必不可少的工具，用于保护酶切位点周围的碱基，以避免酶的切割作用。
本文将介绍保护碱基引物设计的一般原则和具体步骤，并探讨一些常见的问题和注意事项。
保护碱基引物设计的一般原则如下：1.引物长度：保护碱基引物的长度通常为15-25个碱基对。
2.引物序列：引物应根据酶切位点的序列设计。
为了确保引物的特异性，通常将酶切位点和其周围的碱基考虑在内。
3.引物组成：引物的核苷酸组成应考虑碱基的GC含量，以保持引物的稳定性。
通常，GC含量高于50%的引物更稳定。
4.引物末端修饰：引物的末端修饰可以提高引物与目标DNA的亲和性，并增加引物的稳定性。
常用的末端修饰包括磷酸化和胺基修饰等。
保护碱基引物设计的步骤如下：1.获取酶切位点序列：首先，需要获取目标DNA序列中待保护的酶切位点的序列。
2.引物设计：根据酶切位点的序列设计引物。
引物的长度通常为15-25个碱基对。
为了提高特异性，可以考虑在引物序列中加入一些限制性内切酶无法识别的碱基。
3.引物末端修饰：根据需要选择引物的末端修饰方式，例如磷酸化和胺基修饰等。
4.引物的合成：完成引物设计后，可以委托专业的生物科技公司进行引物的合成。
确保引物的纯度和质量。
在进行保护碱基引物设计时，还需注意一些常见的问题和注意事项：1.引物特异性：在设计引物时，要确保引物与目标DNA的序列具有高度特异性，以避免引物与非目标区域的杂交。
2.引物的稳定性：引物的稳定性对于酶切实验的成功至关重要。
在设计引物时，要尽量选择稳定的引物序列，例如具有较高GC含量的引物。
3.引物纯度和质量：为了保证引物的质量和稳定性，引物的合成必须由专业的生物科技公司进行。
确保引物的纯度高，无杂质。
4.引物的浓度和稀释：在使用引物进行酶切实验时，要合理确定引物的浓度和稀释倍数，以保证实验的成功。
总之，保护碱基引物设计是分子生物学研究中不可或缺的一部分。
载体结构设计酶切位点和引物原理
载体结构设计酶切位点和引物原理一、概述随着生物技术的发展，载体结构设计在基因工程研究中扮演着至关重要的角色。
其中，酶切位点和引物的设计原理对于基因克隆、表达及遗传转化等方面均有重要意义。
本文将从酶切位点和引物的原理出发，探讨载体结构设计的相关内容。
二、酶切位点的设计原理1. 基本概念酶切位点是指DNA序列上特定的核苷酸序列，能够被特定的限制性内切酶识别并切割。
通过合理设计酶切位点，可以实现对DNA序列的特异性切割，为后续的基因工程操作提供必要的前提条件。
2. 设计原则（1）选择适当的限制性内切酶酶切位点的选择应基于限制性内切酶的特异性，并考虑到后续的克隆和操作需求。
通常选择常用的限制性内切酶，如EcoRI、BamHI等。
（2）避免酶切位点的相互重叠在设计酶切位点时，应当避免酶切位点之间的相互重叠，以免出现无法正常切割的情况。
还应考虑酶切位点的相对位置，以保证后续的克隆操作能够顺利进行。
（3）考虑DNA序列的完整性在设计酶切位点时，应当考虑到DNA序列的完整性，避免对基因序列造成不必要的破坏。
还需注意酶切位点的分布情况，以减少对DNA序列的干扰。
3. 应用示例以人类胰岛素基因为例，其序列包含多个酶切位点，如EcoRI和BamHI。
通过合理设计酶切位点，可以实现对人类胰岛素基因的特异性切割，为后续的基因工程操作奠定了基础。
三、引物的设计原理1. 基本概念引物是用于PCR扩增、基因克隆等实验操作中的一种寡核苷酸片段。
合理设计的引物能够与目标DNA序列特异性结合，从而实现对目标序列的扩增和克隆。
2. 设计原则（1）选择合适的引物长度引物的长度应控制在15-30个核苷酸之间，过长或过短的引物容易导致PCR扩增效率低下。
（2）避免引物间的相互作用在引物的设计中，需要避免引物之间的相互作用，以免出现不必要的二聚体或引物假扩增。
（3）考虑引物的特异性引物的设计应基于目标DNA序列的特异性，避免引物与非目标序列结合，从而影响后续实验结果的准确性。
引物设计原则最全汇总
引物设计原则最全汇总1.特异性：引物应与所需扩增的目标序列特异性结合，避免与非目标序列发生非特异性结合，以确保产生准确结果。
2.高GC含量：引物的GC含量应高于50%，以增加引物与目标序列的稳定性和特异性。
3.避免酶切位点：在引物设计过程中，应避免引物与目标序列中的酶切位点重叠，以防止扩增产物的酶切降解。
4.引物长度：引物的长度通常在18至30个核苷酸之间，过长的引物会降低特异性，而过短的引物则可能导致非特异性扩增。
5.引物的Tm值匹配：引物的熔解温度（Tm）应在同一PCR反应中保持一致，以确保引物能同时结合于目标序列并发挥作用。
6.避免互补性：在引物设计过程中，应避免引物之间存在互相互补的情况，以防止互补引物之间的杂交，从而导致错误的扩增结果。
7.引物末端修饰：常用的引物末端修饰包括磷酸化、末端标记和引物的截断，通过这些修饰可以提高引物的选择性和特异性。
8.引物的GC平衡：引物的GC含量应在一定范围内均衡，以避免在PCR反应中产生二聚体或无效的扩增。
9.引物序列的重复性：引物设计中应避免引物序列的重复性，以防止引物产生二聚体或与非目标序列互补结合。
10.引物的独特性：在引物设计中，应确保引物序列在目标基因组中的唯一性，避免与非目标序列存在相似区域。
11.引物的结合位点：引物的结合位点应尽可能位于目标序列的保守区域，以增加引物与目标序列的稳定性和特异性。
12.引物的交叉反应：在引物设计中，应避免引物之间存在交叉反应，即两个不同引物同时与同一目标序列结合。
13.引物与模板序列的一致性：在引物设计过程中，应将引物与目标序列进行比对，确保引物与目标序列的一致性，避免在扩增过程中形成不可扩增的结构。
14.避免自相互补性：在引物设计过程中，应避免引物序列存在自相互补性，防止引物自结合或形成不稳定的结构。
15.引物的GC间隔：在引物设计中，应使引物中的GC核苷酸尽可能均匀分布，以避免形成不稳定的结构。
16.引物的无副产物性：在引物设计过程中，应避免引物产生具有毒性或干扰扩增的副产物。
设计引物如何设计酶切位点
经常有战友对一些常见问题在丁香园反复问答了很多遍，所以希望园子中一些战友，特别是低分与0分战友，能将好的帖子归纳总结了一下，并结合自己的经验整理，一方面这是个学习提高的过程，另一方面也能帮助大家解决这方面的问题。
同时如有不当或不完善的地方，希望各位战友不断补充，争取有朝一日我们能把园子里战友的经验系统整理，给大家以帮助。
我先把设计引物如何设计酶切位点这方面的帖子整理一下，因为昨天一下子看到三个相似问题。
原帖如下：我想向你求教一个问题,假如说我想把胰岛素基因和腺病毒载体连接起来,如何确定设计目的基因PCR时的引物呢?和相应的限制性核酸内切酶呢?谢谢老师能给予讲解,谢谢[整理]：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后切不开，所以经常采用最通用的方法，用T载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来酶切，所以感到还是直接扩增好一点。
但这就需要你仔细设计引物。
连入质粒中的重要目的就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR扩增出靶基因的时候在核酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，可以在质粒的图谱说明书上找取相应的位点，进行设计。
（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题两个位点应是载体上的，，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。
因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。
我看promega的说明书上说，最好隔四个。
还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。
两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。
最好使用酶切效率高的。
最好使用双酶切有共同buffer的酶。
引物加酶切位点的原理
引物加酶切位点的原理引物加酶切位点是分子生物学中常用的实验技术，它在DNA重组、PCR扩增、基因克隆等领域起着至关重要的作用。
引物是DNA 序列中的一小段，它能够特异性地与目标DNA序列结合，而酶切位点则是DNA分子上特定的酶切酶能够识别并切割的序列。
本文将介绍引物加酶切位点的原理及其在实验中的应用。
引物的设计是引物加酶切位点实验的第一步。
引物通常由20-30个碱基组成，它们的序列应该与目标DNA序列互补，以确保引物能够特异性地结合到目标DNA上。
在引物的设计中，需要考虑引物的长度、GC含量、Tm值等因素，以确保引物在实验条件下能够有效地结合到目标DNA上。
引物的加入使得酶切位点的选择变得更加灵活。
酶切位点是DNA序列中特定的核苷酸序列，它是酶切酶识别并切割的靶点。
在实验中，引物的引入可以使得酶切位点的选择更加精准，从而实现对目标DNA的特异性切割。
通过合理设计引物，可以在目标DNA上引入新的酶切位点，从而为后续的实验操作提供便利。
引物加酶切位点的原理是通过引物的特异性结合和酶切位点的特异性切割，实现对目标DNA的定点切割。
在实验中，首先将引物与目标DNA序列结合，形成引物-目标DNA复合物。
随后，加入酶切酶，酶切酶能够识别并切割酶切位点，从而在目标DNA上引入切割。
通过这一原理，可以实现对目标DNA的特异性切割，为后续的实验操作提供基础。
引物加酶切位点在分子生物学实验中有着广泛的应用。
它可以用于PCR扩增中的引物设计、基因克隆中的目标DNA切割等实验操作。
通过合理设计引物和选择合适的酶切位点，可以实现对目标DNA的精准操作，为分子生物学研究提供了重要的技术支持。
总之，引物加酶切位点的原理是通过引物的特异性结合和酶切位点的特异性切割，实现对目标DNA的定点切割。
它在分子生物学实验中有着重要的应用，为研究人员提供了强大的实验工具。
通过合理设计引物和选择合适的酶切位点，可以实现对目标DNA的精准操作，为分子生物学研究提供了重要的技术支持。
设计引物如何设计酶切位点
设计引物如何设计酶切位点设计酶切位点是为了能够在特定DNA序列的位置上将DNA分子切割成特定的片段。
这种技术广泛应用于分子生物学、基因工程、基因组研究等领域。
在设计酶切位点时，需要考虑以下几个关键因素：选择合适的酶、确定切割的序列、选择适当的酶切位点。
首先，在设计酶切位点时，需要选择适合的酶。
酶是一种生物催化剂，能够在特定的条件下，加速或调节化学反应的进行。
在分子生物学中，常用的酶包括限制性内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶等。
不同的酶具有不同的切割特异性和活性要求，因此在设计酶切位点时需要根据实验的需要选择合适的酶。
其次，在确定切割的序列时，可以考虑以下几个因素：1.切割位点的特异性：切割位点应该具有特异性，能够准确地识别目标DNA序列，而不会切割其他非目标序列。
这样可以确保切割的准确性和可重复性。
2.切割位点的位置：切割位点的位置应该与实验的需求相一致。
例如，如果需要将DNA分子切割成两个等长的片段，可以选择在目标序列的中间或靠近中间的位置进行切割。
3.切割位点的碱基组成：DNA分子的碱基组成也会影响酶的识别和切割。
一些限制性内切酶对切割位点周围的碱基序列有特定的要求，例如，GC丰富序列容易被一些内切酶切割。
最后，在选择适当的酶切位点时，需要综合考虑实验的需求和酶的特性。
一些内切酶可以识别和切割多个不同的序列，这些酶被称为多切酶。
多切酶可以提高实验的灵活性和效率。
为了设计酶切位点，可以借助一些在线工具和数据库，例如NEBcutter、REBASE等。
这些工具可以帮助研究者快速、准确地找到适合的酶切位点，并提供详细的信息和评估。
总之，设计酶切位点是一项复杂的工作，需要综合考虑多个因素。
在设计过程中，需要选择合适的酶、确定切割的序列、选择适当的酶切位点。
通过合理设计酶切位点，可以在实验中高效、可靠地切割DNA分子，为后续的分析和研究提供基础。
引物加酶切位点的原理
引物加酶切位点的原理引物加酶切位点是分子生物学实验中常用的技术手段，它的原理是利用引物与DNA序列的互补配对特性，结合酶切位点的特异性切割作用，实现对目标DNA序列的选择性扩增和切割。
这项技术在基因克隆、PCR扩增、基因组编辑等领域有着广泛的应用，下面将详细介绍引物加酶切位点的原理。
首先，引物是DNA序列的部分互补片段，通常由20-30个碱基组成。
在引物加酶切位点技术中，引物的设计是非常关键的，它需要与目标DNA序列的两端互补配对，以确保在PCR扩增或酶切反应中能够特异性地结合目标DNA。
引物的选择要考虑到引物的长度、GC含量、Tm值等因素，以确保引物与目标DNA的特异性结合和扩增。
其次，酶切位点是DNA序列中特定的核苷酸序列，它是许多限制性内切酶识别并切割的靶点。
限制性内切酶是一类能够识别特定DNA序列并在特定位置切割DNA链的酶，它们的作用使得DNA分子在特定的酶切位点处产生特定的切割。
在引物加酶切位点技术中，选择合适的限制性内切酶和其对应的酶切位点是非常重要的，它决定了对目标DNA序列的特异性切割。
引物加酶切位点技术的原理是将引物与目标DNA序列特异性地结合，然后利用PCR扩增或酶切反应对目标DNA进行扩增或切割。
在PCR扩增中，引物与目标DNA序列互补配对后，通过DNA聚合酶的作用，将目标DNA序列进行扩增，从而得到大量的目标DNA。
而在酶切反应中，引物与目标DNA序列互补配对后，加入相应的限制性内切酶，使其在特定的酶切位点处切割DNA链，从而实现对目标DNA的特异性切割。
总之，引物加酶切位点技术是利用引物与DNA序列的互补配对特性，结合酶切位点的特异性切割作用，实现对目标DNA序列的选择性扩增和切割。
它在分子生物学实验中有着广泛的应用，为基因克隆、PCR扩增、基因组编辑等领域的研究提供了重要的技术支持。
引物加酶切位点技术的原理清晰，操作简便，是分子生物学研究中不可或缺的重要技术手段。
⑤酶切位点分析及引物设计
⑤酶切位点分析及引物设计酶切位点分析及引物设计是分子生物学中常用的技术手段，用于确定DNA序列中特定的酶切位点，以及设计引物来扩增目标序列。
本文将从酶切位点分析的原理、方法和应用，以及引物设计的原则和方法等方面进行介绍。
一、酶切位点分析的原理和方法酶切位点是指DNA分子中特定的序列，该序列能够被特定酶切割成两个或多个片段。
酶切位点分析的原理是将待分析的DNA序列与特定酶的识别序列进行比对，发现匹配的序列，则认定这里可能存在酶切位点。
常用的酶切酶有限制性内切酶和特异性内切酶。
限制性内切酶是一类能够识别特定DNA序列并在特定位置切割DNA分子的酶，其切割位点是特异性的；特异性内切酶则是能够在DNA序列中找到特定的序列并切割的酶。
酶切位点分析的方法包括PCR-RFLP法、Southern blotting法和测序法等。
PCR-RFLP法是通过PCR扩增DNA片段，然后用特定酶切割PCR产物，并通过凝胶电泳分析切割后的片段大小来确定酶切位点；Southern blotting法则是将DNA分子进行电泳分离，然后经过膜转移，用酶切破坏特定序列，并通过探针的杂交来确定酶切位点；测序法则是通过直接测序DNA序列，发现具有酶切位点的序列。
二、引物设计的原则和方法引物是用于扩增目标DNA序列的短链DNA片段，通常由两个互补的引物组成，分别位于目标序列的两个末端。
引物设计的原则是要确保引物与目标序列的互补度高、无二次结构、无引物间的互相结合等。
引物设计的方法主要有基本方法和计算机辅助方法。
基本方法是根据特定的DNA序列设计引物，考虑引物长度、GC含量以及互补性等因素；计算机辅助方法则是利用计算机软件根据序列的特征自动设计引物。
常用的引物设计软件有Primer3、OligoAnalyzer等，这些软件可以根据用户设定的参数，自动生成合适的引物。
引物设计的时候需要考虑引物的长度、GC含量、互补度、Tm值、引物间的互补性等参数，以确保引物能够特异性地结合到目标序列上，并且能够在PCR反应中起到良好的扩增效果。
引物设计原则最全汇总
引物设计原则（汇总）普通引物设计（适用于从载体上扩增模板）：1.普通引物长度一般在20-30bp之间，常用24-28bp左右以保证基因特异性；2.下载基因序列到Vector NTI；3.找到所需安装载体序列；4,将基因序列的CDS高亮标记；5.寻找载体序列中常用酶切位点，一般为EcoRI、BamHI、Hindlll、XhoI等等，比对检测基因序列中是否有这些位点，有的话舍弃，最后选择两个酶切位点，最好离得远一点，并且最好buffer用一样的。
酶切位点一般是6bp的回文序列；6.从基因ATG开始往后选择10-20bp均可（我的习惯是27bp-6bp酶切位点-2bp保护碱基-xbp 补齐序列），但最好保证最后两个是G或者C，以减少错配率；7.将上游酶切位点序列补在ATG前方，并根据载体对框情况补足两者之间的空缺，再根据序列的GC含量和TM值在酶切位点前补足保护碱基，以保证GC和AT的含量不能过高。
注意，所有的补齐不能用到终止密码子；8.检测上游序列的结构情况，理论上不要太多二级结构以及3’端匹配即可；不过重复的序列也不能太多，以免移码；9.从下游终止密码子开始向前选择10-20bp均可，但最好保证最后两个是G或者C，以减少错配率；10.选择complementary sequence，在N端补齐下游酶切位点，如果tag在C端（即下游），则在第9点中应该从终止密码子前开始选择（即舍弃终止密码子），并且下游引物也要对框，如果tag在N端，则下游引物不需要对框，只要在N端加上下游酶切位点，再根据情况加上2个保护碱基，然后检测二级结构，原则上3’端部匹配即可。
不过重复的序列也不能太多，以免移码；11.将设计好的上下游引物放在一起检测二级结构，原则上3’端部匹配即可。
不过重复的序列也不能太多，以免移码；12.最后在NCBI的primer Blast网站上比对引物序列，看是否基因特异性的。
2011年10月18日左洁1.引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
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引物设计原则及酶切位点选择和设计[整理]：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用T载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来酶切，所以感到还是直接扩增好一点。
但这就需要你仔细设计引物。
连入质粒中的重要目的就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR扩增出靶基因的时候在核酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，可以在质粒的图谱说明书上找取相应的位点，进行设计。
（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题两个位点应是载体上的，，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。
因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。
我看promega的说明书上说，最好隔四个。
还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。
两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。
最好使用酶切效率高的。
最好使用双酶切有共同buffer的酶。
最好使用较常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），最好使用自己实验室有的酶，这样可以省钱。
Tm的计算，关于Tm的问题，很多的战友都有疑惑。
其实园子里有很多的解释了。
Tm叫溶解温度（melting temperature, Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。
大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。
因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。
计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。
不少战友设计的引物都Tm过低，是因为他们误把保护碱基和酶切位点都计算到Tm里了，最后的结果是导致了PCR反应的诸多困难。
所以，设计引物的时候，先不管5'端的修饰序列，把互补区的Tm控制在55度以上（我喜欢控制在58以上，具体根据PCR的具体情况，对于困难的PCR，需要适当提高Tm），再加上酶切位点和保护碱基，这样的引物通常都是可用的，即使有小的问题，也可以挽回。
Tm温度高的引物就比较容易克服3‘发卡、二聚体及3'非特异结合等问题。
简单的计算公式可以用2+4的公式。
若你计算的Tm值达到了快90 ，不包括酶切位点。
引物公司给你发的单子是包括酶切位点的。
自己可以再估计一下。
如你设计了带酶切位点的引物，总长分别为29、33个碱基，去掉酶切位点和保护碱基，分别为17、21个碱基。
引物公司给的单子是70多度，实际用的只有50度，用55度扩的结果也差不多。
其它关于Tm值的计算，有用PP5.0进行评价的，需要考虑的参数包括：base number、GC%、Tm、hairpin、dimer、false priming、cross dimer。
退一般退火温度为Tm-5度，退火温度的计算可以不把加入的酶切位点及保护碱基考虑进去，如上所言，PCR几个循环后，引物外侧的序列已经参入了扩增片断中，所以你可以在预变性后多加几步，温度比你Tm值低些（这样可能会增加非特异性），Tm值是你包括酶切位点及保护碱基的Primer计算出来的。
1.一般在5'端加保护碱基,如果你扩增后把目的条带做胶回收转入T-VECTOR或者其它的载体的话,酶切时可以不需加保护碱基2.有人的经验加入酶切位点的引物可以和未加入时使用相同的退火温度,结果也还是令人满意。
关于引物二聚体，最好用primer或是其他设计引物的软件进行计算一下，看看引物之间的△G（自由能）的绝对值，如果小于10，一般是问题的。
如果稍大，PCR时可以提高一下退火温度，一般是没有问题的。
如果3’端形成二聚体，并且自由能绝对值较大，如果PCR没有条带，建议重新设计引物。
此外，所加的三个核苷酸的保护序列经过尽心设计有时也可以降低二聚体的△G。
在设计酶切位点时，最好能尽可能多的利用引物本身的碱基。
这是因为，一个特异性引物一般都是20bp左右，再加上酶切位点序列和保护性碱基，大致就是28bp左右了。
而我们在设计退火温度时，与引物的长度有关，比正常的引物(20bp) 的Tm肯定要高一些。
如果我们能利用引物自身的部分序列，就可以有效地减少引物的长度。
还有，有些酶是离不开末端序列的，因此，在设计一个酶位点时，最好把该酶的性质弄清楚设计时限制性酶切位点是应该在5’端的顶端。
在设计引物时，常在5‘端添加酶切位点，以利于PCR产物连接到载体。
设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。
先用软件设计出合适的引物，引物的3’端是引发延伸的起点，因此一定要与模板准确配对，应尽量避免在引物3’端的第一位碱基是A。
（容易错配）引物3’端最佳碱基的选择是G 和C，因为他们形成的碱基配对比较稳定。
目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。
当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。
酶切位点都需要保护碱基以利于内切酶的有效切割。
酶切位点前加保护碱基1，两个酶切点至少隔上3个碱基，在做载体构建的时候设计引物扩增片段进行定向连接，除了酶切位点，还要在两端加一个三个核苷酸的保护序列，否则PCR产物很难被酶切，因此就会导致连接失败，因为内切酶需要一定的辅助性碱基才能顺利切割，在没有辅助碱基的情况下，有的酶是可以切割的，比如：SalI和SpeI，他们不需要辅助性碱基即可切割，但大部分酶是需要辅助性碱基的。
所以引物顺序应是：5’—保护碱基+酶切位点+引物配对区—3’下面是几个战友的讨论，请问：在引物的5‘端加限制酶切位点，只在酶切位点的5‘端加保护碱基可以吗？还是必须要在酶切位点的两侧加保护碱基？是的，只要在5‘端加保护碱基可以了。
其实保护碱基就是要给限制性内切酶一个结合位点，3‘端还有更长的引物序列在，当然不需要再加保护碱基了，下面就来讨论一下这个问题：（下面引自NEB网站）1、寡核苷酸近末端位点的酶切为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
（这里用的是寡核苷酸！！而不是末端带酶切位点的肽链！）实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
然后NEB就提供了一个表，关于链长和切割效率的。
我觉得这只能说明酶在作用于识别位点时所需占据的链长，并不能说明在设计酶切位点时要加那么长的保护碱基，比如我用的NotI，要加10个碱基，切25个小时才95％的效率，这还是用了20倍的酶量！我师姐只加了4个碱基，也没见出现问题。
2、线性载体近末端位点的酶切将线性载体与相应内切酶（10 units/µg）在适宜温度及缓冲液条件下反应60分钟，随后进行连接和转化。
切割效率=100%-(酶切产物转化子数/再连接产物转化子数)""近末端碱基对数"指的是从识别位点到DNA末端的碱基对数，但并不包括最初切割位点处留下的单链突出碱基。
（解释一下：就像下面这个例子EcoRI酶切位点NNNG AATTCNNC TTAAG它的近末端碱基对数就是3，而不是4）还没有证据表明单链核苷酸能否提高切割效率，因此在设计PCR引物时应至少加上4个额外碱基。
Not I 7 100 (2) Bluescript SK- Spe I4 100 (1) Bluescript SK-Ksp I1 98 (2) Bluescript SK Xba I拿NotI酶切位点的设计与保护碱基的选择酶寡核苷酸序列切割率%2 hr20 hrNot I TT GCGGCCGC AAATTT GCGGCCGC TTTAAAATAT GCGGCCGC TATAAAATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTATAAGGAAAAAA GCGGCCGC AAAAGGAAAA10102525101090>90Nsi I TGC ATGCAT GCACCA ATGCAT TGGTTCTGCAGTT10>90>90>90Pac I TTAATTAAG TTAATTAA CCC TTAATTAA GG 025>90Pme I GTTTAAACG GTTTAAAC CGG GTTTAAAC CCAGCTTT GTTTAAAC GGCGCGCCGG752550>90Pst I G CTGCAG CTGCA CTGCAG TGCAAA CTGCAG AACCAATGCATTGGAAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAACTGCAG AACCAATGCATTGGATGCAT10>90>9010>90>90Pvu I C CGATCG GAT CGATCG ATTCG CGATCG CGA102510Sac I C GAGCTC G1010Sac II G CCGCGG CTCC CCGCGG GGA50>90Sal I GTCGAC GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GC GTCGAC GTCTTGGCCATAGCGGCCGCGGACGC GTCGAC GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA10105075Sca I G AGTACT CAAA AGTACT TTT 10752575C CCCGGG G CC CCCGGG GG TCC CCCGGG GGA10>901050>90Spe I G ACTAGT CGG ACTAGT CCCGG ACTAGT CCGCTAG ACTAGT CTAG 1010>90>905050Sph I G GCATGC CCAT GCATGC ATGACAT GCATGC ATGT102550Stu I A AGGCCT TGA AGGCCT TCAAA AGGCCT TTT >90>90>90>90>90>90Xba I C TCTAGA GGC TCTAGA GCTGC TCTAGA GCACTAG TCTAGA CTAG>907575>90>90>90Xho I C CTCGAG GCC CTCGAG GGCCG CTCGAG CGG10102575Xma I C CCCGGG GCC CCCGGG GGCCC CCCGGG GGGTCCC CCCGGG GGGA2550>9075>90>90酶寡核苷酸序列切割率%2 hr20 hrAcc I G GTCGAC CCG GTCGAC CGCCG GTCGAC CGG 0Afl III C ACATGT GCC ACATGT GGCCC ACATGT GGG>90>90>90>90Asc I GGCGCGCCA GGCGCGCC TTT GGCGCGCC AA >90>90>90>90>90>90CC CCCGGG GG TCC CCCGGG GGA >90>90>90>90BamH I C GGATCC GCG GGATCC CGCGC GGATCC GCG10>90>9025>90>90Bgl II C AGATCT GGA AGATCT TCGGA AGATCT TCC7525>90>90BssH II G GCGCGC CAG GCGCGC CTTTG GCGCGC CAA50>90BstE II G GGT(A/T)ACC C010BstX I AACTGCAGAA CCAATGCATTGGAAAACTGCAG CCAATGCATTGG AACTGCAGAA CCAATGCATTGG ATGCAT252550>90Cla I C ATCGAT GG ATCGAT CCC ATCGAT GGCCC ATCGAT GGG>9050>9050EcoR I G GAATTC CCG GAATTC CGCCG GAATTC CGG >90>90>90>90>90>90Hae III GG GGCC CCAGC GGCC GCTTTGC GGCC GCAA >90>90>90>90>90>90Hind III C AAGCTT GCC AAGCTT GGCCC AAGCTT GGG1075Kpn I G GGTACC CGG GGTACC CCCGG GGTACC CCG>90>90>90>90Mlu I G ACGCGT CCG ACGCGT CG2550Nco I C CCATGG GCATG CCATGG CATG5075Nde I C CATATG GCC CATATG GGCGC CATATG GCGGGGTTT CATATG AAACCCGGAATTC CATATG GAATTCCGGGAATTC CATATG GAATTCCC7575>90>90Nhe I G GCTAGC CCG GCTAGC CGCTA GCTAGC TAG10102550。