固定化酶的研究进展

固定化酶的研究进展

固定化酶是20世纪60年代发展起来的一项新技术。最初主要是将水溶性酶与不溶性体结合起来，成为不溶于水的酶衍生物，所以曾叫过“水不溶酶”和“固相酶”。但是，后来发现，也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中，高分子底物与酶在超滤膜一边，而反应产物可以透过膜逸出。在这种情况下，酶本身仍是可溶的，只不过被固定在一个有限的空间内不能再自由流动。因此，用水不溶酶或固相酶的名称就不再恰当。在1971年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶”的名称[1]。

一固定化酶的发展历程[1]

酶参与体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变换。作为一种生物催化剂，酶可以在常温常压等温和条件下高效地催化反应，一些难以进行的化学反应在酶的催化作用下也可顺利地进行反应，而且反应底物专一性强、副反应少等优点大大促进了人们对酶的应用和酶技术的研究。近年来，酶被人们广泛应用于食品生产与检测、生物传感器、医药工程、环保技术、生物技术等领域。

1916年美国科学家NELSON和GRIFFIN最先发现了酶的固定化现象；直到20世纪50年代，酶固定化技术的研究才真正有效地开展；1953年，德国科学家GRUB-HOFER 和SCHLEITH首先将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后将淀粉酶、胃蛋白酶、羧肽酶和核糖核酸酶等与上述载体结合制备固定化酶；到20世纪60年代，固定化技术迅速发展；1969年日本千畑一郎利用固定化氨基酰胺酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸，是世界上固定化酶大规模应用的首例；在1971年的第一届国际酶工程会议上，正式建议使用固定化酶(mimobilizedenzyme)这个名称。我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是中国科学院微生物所和上海生化所的酶学工作者同时开始了固定化酶的研究工作

二固定化酶的特点[2] [3]

固定化酶具有许多优点：极易将固定化酶与底物、产物分开；可以在较长时间内进行分批反应和装柱连续反应；在大多数情况下，可以提高酶的稳定性；酶反应过程能够加以严格控制；产物溶液中没有酶的残留，简化了提取工艺；较水溶性酶更适合于多酶反应；可以增加产物的收率,提高产物的质量；酶的使用效率提高，成本降低。但是，固定化酶也有其不足之处，如固定化时，酶活力有损失；增加了固定化的成本，工厂开始投资大；只能用于水溶性底物，而且较适用于小分子。

三固定化酶固定化方法[3] [4]

由于所固定的酶或细胞的不同，或者固定的目的及固定用的载体的不同，使固定化方法大相径庭。根据固定的一般机理，可将之分为如下几种方法。酶的固定化方法有：

吸附法、包埋法、共价键结合法、肽键结合法及交联法。不同的固定化方法所产生的效果也不相同，各有自己的优缺点，如吸附法制备容易，能够再生，但结合程度较低，活力回收率低，而包埋法结合程度高，活力回收率高，但制备较难，不能再生。所以对不同的实验目的，可采用不同的固定方法。

四固定化酶的研究进展

1 固定化酶固定化载体的研究进展

载体材料的选择是决定酶能否成功固定化以及固定化酶活力高低的重要因素。酶蛋白的活性中心是酶催化活性所必需的，酶蛋白的空间结构也与酶活力密切相关，因而在固定化的过程中必须注意酶活性中心的氨基酸残基不受到载体的影响，而且要避免酶蛋白高级结构的破坏。从载体材料的组成来看，固定化酶所使用的载体可以分为无机载体、高分子载体、复合载体及新型载体等。

1.1无机载体[5] [6] [7] [8] [9]

传统的无机载体材料（如二氧化硅、活性炭、玻璃珠、硅胶等）来源方便、廉价、机械强度高、无毒，一般是借助吸附方法来制备固定化酶，或经小分子化学改性以共价键合方式制备固定化酶，用无机载体直接以吸附法固定化酶虽然具有方法简单、造价低廉、固定化酶初始活性较高等优点，但无机载体的结构不易调控，影响传质且键合酶的能力差，固定化酶容易因脱附而迅速失活。

1.2高分子载体

天然高分子载体如壳聚糖(Chitosan)[10]是甲壳素的脱乙酰化产物，是一种氨基多糖。由于壳聚糖具有良好的机械性能、稳定的化学性质，同时又易于接枝而改性，再加上其来源丰富，成本低廉，制备简单，已成为开发固定化酶载体材料的方法之一。利用壳聚糖上的氨基与戊二醛发生Schiff反应，再与酶形成Schiff碱而固定化酶。壳聚糖壳起着漉网的作用，限制着底物和产物的进出。合成高分子类载体如通过自由基沉淀聚合反应合成甲基丙烯酸—丙稀酰胺—顺丁烯二元酸酐三元共聚物，利用共聚物上的酸酐基团，直接进行木瓜蛋白酶的固定化。这种固定化酶可通过调节体系的pH值来改变其沉淀-溶解状态。

1.3复合载体[7] [8] [9]

无机载体与传统有机聚合物载体材料能形成互补体系，因此利用组成和结构可调控的有机聚合物对传统无机载体材料改性修饰，制备兼具两者优良特性的复合载体用于酶的固定化研究受到了众多学者的青睐。为增强无机材料结合酶的能力，可把易于与酶结合的有机或无机材料涂敷在多孔无机材料的表面，制备出固定化酶复合载体。如用甲壳胺固定酶时常用戊二醛作交联剂，此时甲壳胺容易形成凝胶，液体的流动因此而受阻传质性能差，底物不能与酶充分接触。硅胶表面有羟基，这些羟基能与甲壳胺中的羟基形成氢键，甲壳胺能很好地吸附在硅胶的表面形成复合载体。这种复合载体具有无机载体

良好的机械性能，可克服高分子载体机械性能差的弱点，所以用复合载体制备的固定化酶更适合在产业化中作为生物催化剂使用。复合载体材料有机可改进材料的性能，目前主要有磁性高分子微球[11]，既可以通过共聚、表面改性等化学反应在微球表面引入多种反应性功能基团，也可通过共价键来结合酶、细胞、抗体等生物活性物质，在外加磁场的作用下，进行快速运动或分离因，而在生物工程、生物医学及细胞学等领域有着广泛的应用前景。

1.4新型载体[5]

新型材料如介孔材料[5] [12]，介孔材料是一种多孔固体材料，它具有蜂窝样的孔道，大小只有2~5nm。很多介孔材料的孔道都是规则有序排列的，包括层状、六方对称排列和立方对称排列的孔道结构。介孔材料作为酶固定化载体的优越性表现在：①相对于微孔分子筛，介孔材料较大的孔径使其表面活性基团有较好的可接近性，孔内可负载大体积基团，适用于体积大小范围较宽的客体分子；②介孔材料的表面富含羟基基团，与酶分子发生氢键作用，加强载体与酶分子的作用力，而且羟基在表面的分布及其数量可根据目标进行调变；③具有较高的比表面积达(达1000m2/g)，理论负载量较高；④无机介孔材料在酶催化反应过程中呈惰性，不影响催化反应；⑤在理论研究方面，均一孔径有利于建立固定化酶的结构模型，表面性质及结构的可调变性可为酶∕载体的分子水平设计与结构控制提供有意义的信息。

1.5智能型高分子载体[13]

最近又新兴了一种新的载体就是智能型高分子载体，智能型高分子载体亦称环境响应型载体，是指能够感知外界环境的刺激并作出相应回应的一类具有功能发现能力的新材料，如温度敏感型凝胶载体，即温度响应型高分子水凝胶，是一类可通过改变自身性质来对外界温度变化作出响应的智能材料，目前温度响应水凝胶在固定化酶方面的研究主要集中在随温度变化而发生体积相转变的高温收缩型凝胶，所得的固定化酶可实现酶的均相催化和异相分离，以及连续性和重复使用性。此外，还有pH-敏感型载体、磁响应型载体材料以及多重响应型载体等智能型高分子载体。

2 固定化酶的应用研究进展

固定化酶的应用广泛，固定化酶技术的研究不仅在化学生物学、生物工程医学及生命科学等领域异常活跃，而且因为其节省能源与资源，减少污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。

2.1固定化酶在食品工业上的应用[3] [14] [15] [16]

固定化酶在食品工业的各个方面都显示出广阔的应用前景，如固定化酶技术的发展使生物传感器应运而生，它的问世不仅使食品成分的快速、低成本、高选择性分析测定成为可能，而且生物传感器技术的持续发展将很快实现食品生产的在线质量控制，降低食品生产成本，并给人们带来安全可靠及高质量的食品；在制造啤酒时，可以试用固定