PCR试验及引物设计

Primer Premier 5.0用途：
• 引物分析评价功能； • 引物的自动搜索功能
Premier的主要功能：
Premier 的主要功能分四大块，其中有三 种功能较常用，即引物设计( )，限 制酶切点分析( )，基元查找( )。 另个功能是同源性分析（ ），并非 Premier 的特长，在此略过。该软件还有 别的一些功能，如序列”朗读”，DNA 与蛋白序列的互换（ ）
靶DNA的扩增
5’
(a)
引物2 5’
(b)
3’
3’
3’ 5’ 引物1
5’ (c) 引物2互补链
3’
3’ 引物1互补链
5’
(d)
3’
5’
新引物
5’
3’
(e) 不同长度的链
单位长度的链
(f)
引物2互补链
5’
3’
(g)
3’
引物1互补链
5’
目的片段（不同长度的链未示出）
聚合酶链式反应示意图
温度（℃）
94
PCR技术的原理
• 1.变性：在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋 的氢键断裂，形成单链DNA，称之为变性。
• 2.退火：是模板与引物的复性。引物是与模板 某区序列互补的一小段DNA片段。
• 3.延伸：从结合在特定DNA模板上的引物为出 发点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按 5’→3’的方向沿着模板顺序合成新的DNA链。
产物的数量满足实验需求为止。
一. 引物设计的基本原则
• 引物长度（primer length） • 产物长度（product length） • 序列Tm值 (melting temperature) • ΔG值(internal stability) • 引物二聚体及发夹结构
（duplex formation and hairpin） • 错误引发位点（false priming site） • 引物及产物GC含量（composition）
PCR试验与引物设计软件
primer Premier 5.0 应用简介
实验原理
• 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，是一种在体外快速扩增 特定基因或DNA序列的方法，故又称为 基因的体外扩增法。
• 在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补 的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和 延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。
1. 引物的长度
• 一般为15-30个核苷酸，在做长片段 PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长 的引物，但最多不超过50个核苷酸。
2. 引物3’端的序列
引物3’端的碱基一般不用A，因为A在 错误引发位点的引发效率相对比较高
考虑到密码子的简并性，引物3’端最后 一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。
GC含量太高也易于引发非特异扩增。
4. 引物所对应模板序列的Tm值
• 一般要求：55℃-65℃。 • 计算：
对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据 Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算
对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学 参数，从“最近邻位”的计算方式得到， 这也是现有的引物设计软件最常用的计 算方式。 • Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/来自百度文库1 + 0.7 [K+])) - 273.15
5. ΔG值(自由能) ，
反映了引物与模板结合的 强弱程度。一般情况下，引物 的ΔG值最好呈正弦曲线形状， 即5’端和中间ΔG值较高，而3’ 端ΔG值相对较低
6. 引物二聚体及发夹结构的能量
一般不要超过4.5，否则 容易产生引物二聚体带而且 会降低引物浓度从而导致 PCR正常反应不能进行
二. Primer Premier 5.0 引物设计软件简介
循环1
94℃变性 （1min）
循环2
72 72 ℃延伸
60
60 ℃退火 （1.5min）
（1min）
循环3
时间（min）
PCR反应的温度循环周期
PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引 物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反 应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃ 延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增
同一种氨基酸具有两个或更多个密码子的现象称为密码子的简并性
（degeneracy）。
引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构 也可能导致PCR反应失败
3. 引物的GC含量
• 同一碱基连续出现不应超过5个 • GC含量一般40-60%
GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低 的退火温度不利于提高PCR的特异性