冰冻切片步骤2010.6
冰冻切片操作流程
冰冻切片操作流程
1.包埋切片
将组织置于20%-30%蔗糖溶液1～3天沉底，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。
取出组织，预冷PBS清洗后平放于软塑瓶盖或特制小盒内（比如用铝箔纸折成有口的方盒），加入适量OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。
取出组织冰块立即置入-80℃冰箱贮存备用，或置入恒冷箱切片机冰冻切片。
2.固定
在冰冻切片机上切片，完成后用预冷的4%多聚甲醛室温固定
20-30min，冷水清洗3-5次，-20度保存。
3.冰冻切片机切片，厚度3-5微米
4.切片后固定
将切好的冰冻片用预冷的组织固定液固定30min，蒸馏水洗3-5次，洗干净固定液，自然晾干后进行下一步实验或-20℃保存
冰冻片免疫荧光实验步骤
热修复抗原:将切片浸入修复缓冲液（柠檬酸盐或EDTA修复液）,电炉或微波炉加热至沸腾后断电，间隔5-10 min后，反复1-2 次。
室温自然冷却后水洗一次
滴加封闭液（5%BSA或二抗同源血清）, 37℃孵育30 分钟。
甩去多余液体, 不洗。
滴加适当稀释的一抗，4℃过夜后37℃复温30min，也可37 ℃孵育2 h。
PBS洗5min×3 次。
滴加生物素化山羊抗小鼠IgG(或兔IgG)，37℃30 min。
PBS洗5min×3 次。
滴加试剂SABC-FITC，37℃孵育30 min。
PBS洗5 min×4 次。
DAPI复染2-3min，充分水洗，封片观察。
病理冰冻切片的制片流程
病理冰冻切片的制片流程：
①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，好为24×24×2mm。
②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。
小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。
③将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。
④调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。
⑤调好防卷板。
制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。
切片时，切出的切片能在时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。
这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。
⑥应视不同的组织选择不同的冷冻度。
冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一概而论。
如：切未经固定的脑组织，肝组织和**结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10--15℃左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-15～20℃左右，切带脂肪的组织时，应调至-25℃左右，切含大量的脂肪时，应调至-30℃。
冰冻切片前组织的处理的步骤
冰冻切片前组织的处理的步骤
冰冻切片前组织的处理步骤包括以下内容：
1. 取材：在取材时，需要保持新鲜，如果组织自带有较多的水分，应使用滤纸将其吸干。
同时，取材时需要保持工具干燥，以防止冰晶空洞等现象的产生。
2. 包埋：包埋时，应选择适当的包埋剂，如OTC或普通的胶水。
同时，需要将包埋剂涂抹均匀，确定好组织的包埋方向。
包埋后的组织应竖立，以方便切片。
3. 冰冻：冰冻是切片前处理的关键步骤，应根据组织的类型和大小来调节冰冻温度和时间。
过低的温度可能导致组织过硬或切片碎裂，过高的温度则可能使组织硬度不够，难以切片。
4. 切片：在冰冻切片过程中，需要注意以下几点：首先，当组织和包埋剂冷冻到发白后即可开始切片；其次，切片时右手摇动手轮要力道均匀、柔和、缓慢；最后，切片厚度应控制在5um左右。
切片的操作完成后，应立即将切片展平粘贴在干净的载玻片上，并立即放入固定液中固定。
在处理过程中，需要注意防止气泡产生，以免影响切片的品质。
同时，样品托应牢固固定，以防因组织重力和刀片相互作用而使切片不成形。
此外，贴片时应在载玻片上滴3μl左右的PBS后贴片，以保证贴片稳定。
最后，刚切好的冰冻切片不宜马上做免疫组化，因为明胶这种蛋白质与硫酸铬钾形成的胶状混合物涂在载玻片上后，再与富含脂肪的脑片黏合需要一定的时间。
以上信息仅供参考，如需了解更具体的信息，建议咨询专业人士或查阅专业书籍。
不可错过的【冰冻切片制备】步骤！
不可错过的【冰冻切片制备】步骤！Frozen section01什么是冰冻切片？冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。
因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。
02制备步骤将组织在恒温冷冻切片机里切片。
冷冻腔内的温度一般设置为-18至-25℃，根据不同组织调节不同的腔温，平时应将冷冻头放置于冷冻台上。
冷冻切片机应长期处于恒温冷冻状态。
1）当冰冻组织取好后，在冷冻头上放少量的OCT或羧甲基纤维素(可用普通胶水代替)，放上组织，速冻；2）待组织冻结后，将冷冻头装到切片机上；3）粗切，修出切面细切几张，用毛笔刷去刀上组织片；4）放下抗卷板，开始切片，切片厚度一般为5～6微米，切出的片子用载玻片贴附后立即放入甲醇冰醋酸液（97ml甲醇+3ml冰醋酸）中固定，固定时间为10～20秒；03注意事项1）速冻：是冰冻切片的关键，因为只有速冻才能减少组织内的冰晶，最好的办法是将速冻头迅速压在组织上，冻好后就可切片。
特别适用于较脆的组织。
而含有脂肪较多的组织，最好放在液氮里处理。
在液氮里冷冻要注意不要冻过头，2～3秒钟就要拿出来看一下，只要有4/5的组织已经冻住就可以了，待冷冻头拿出后刚好全部冻住，否则就会引起组织发脆，或冷冻头与组织分离。
2）固定：切片后应立即放入甲醇冰醋酸中固定，不能等切片干后再固定，后者容易造成细胞退变。
固定液有很多种，甲醇作用快，收缩小，染色较清晰，是冰冻切片最理想的固定液，而每97ml加入冰醋酸3ml，会减少某些胶质、钙质较多的组织不容易掉片。
3）包埋剂：可用普通胶水代替，但要加入适量的水（胶水与水的比例大约在2：1左右）。
太稀了，容易损伤切片刀；太稠了，粘在切片上不容易洗掉，影响切片的质量。
4）冰冻用切片刀不仅要磨的快，而且要磨的直，否则切出的片子就不会平整，不能进入抗卷板。
最好能使用一次性刀片。
5）如组织发脆，可等几分钟后再切，也可用手在组织上稍稍加温；如果用手去摸组织块，最好戴手套，或用玻片间的纸夹在手与组织之间，以防感染。
脂肪组织冰冻切片步骤
脂肪组织冰冻切片步骤
脂肪组织冰冻切片的步骤如下：
1. 取材：在合适的环境下获取脂肪组织，一般大小为1.5×1.5×0.5cm，注意应尽量剔除脂肪组织、钙化、骨质等影响切片质量的成分。
2. 速冻：使用液氮或干冰-丙酮（乙醇）法将组织速冻。
液氮法是将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内，然后将其放入盛有液氮的小杯内，注意小盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，10~20s组织即迅速冰结成块。
干冰-丙酮（乙醇）法是将150~200ml丙酮（乙醇）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈黏稠状，再加干冰不再冒泡时，温度可达-70℃，然后使用异戊烧进行速冻。
3. 切片：将速冻后的组织块固定在切片机上，调整切片的厚度为4~6μm，然后进行切片。
4. 贴片：将切好的组织切片立即放入冰冻固定液中固定10~20秒，然后取出贴片。
5. 染色：使用苏木精染液进行染色，室温下染色1分钟，如果室温较低，则需要适当延长染色时间。
6. 水洗：染色后进行水洗，洗去多余的染液。
7. 封片：将切片晾干后，使用合适的封片剂进行封片。
注意，在整个过程中，都需要保持组织的冷冻状态，以防止组织内的冰晶形成和细胞结构的破坏。
同时，切片和染色的过程中，也需
要注意避免切片过厚或过薄，以及染色过深或过浅，以保证切片的质量。
以上信息仅供参考，具体操作可能会因实际情况和设备的不同而有所差异。
冰冻切片制片实验步骤及注意事项
冰冻切片制片实验步骤及注意事项冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。
因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。
冰冻切片制片实验步骤1、组织固定：新鲜组织固定于4%多聚甲醛24h以上。
将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整。
2、脱水：将修切好的组织放于15%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底后转入30%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底。
3、OCT包埋：将脱好水的组织取出用滤纸将表面水稍吸干后切面朝上放于包埋台上，组织周围滴上OCT包埋剂，将包埋台放在冰冻切片机的速冻台上速冻包埋，OCT变白变硬后即可进行切片。
4、切片：将包埋台固定于切片机上，先粗切将组织面修切平整后即可开始切片，切片厚°8-10μm。
将干净的载玻片平放于切出的组织片上方即可将组织贴于载玻片上。
-20°保存备用。
注意事项1、组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的骤冷剂有：① CO2气（-78℃）② 丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（-80℃）③ 液氮（-190℃）④ 液氮冷却的丙烷（-19℃）。
液氮适用于组织化学，较安全。
缺点：组织块易发生龟裂。
2、为防止水解酶和其他物质的移位、弥散，常用4℃、24小时的甲醛固定能很好地保存酶类。
但对许多脱氢酶和转移酶能灭活。
故不宜使用，低温，冷甲醛短时间固定（10分钟左右）固定，可显示琥珀酸脱氢酶。
3、电镜出现后，需要保存细胞的超微结构，以4%缓冲戊二醛（25%戊二醛16ml；0.1M二甲胂酸（pH7.）84ml；蔗糖8g）固定较好。
这些固定液主要用于水解酶，而不适于许多氧化还原酶和转移酶。
冰冻切片的操作流程
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1. 制备组织样品。
新鲜组织标本，清洗，固定，脱水，透明化，浸蜡，包埋。
冰冻切片制作方法与注意事项
冰冻切片制作方法与注意事项冰冻切片是一种常见的制备生物组织切片的方法，其原理是将生物组织迅速冷冻并切割成极薄的切片，用于研究组织的形态结构和组织学变化。
下面是冰冻切片的制作方法和注意事项。
一、冰冻切片的制作方法：1.组织采集：选择需要研究的组织，如动物器官或植物部位，通常用组织固定剂进行固定处理，以保持组织的形态结构。
2.组织预处理：将固定的组织转移到含有蔗糖或蔗糖与聚乙二醇的冰冻液中，浸泡一定的时间使组织与冷冻液充分均匀接触，便于组织快速冷冻。
3.冰冻：使用液氮或刀片冷冻架等快速冷冻设备，将组织迅速冷冻至-20℃以下，使组织中的水分迅速形成冰晶，避免组织的形态结构变化。
4.切割：将冷冻的组织置于切片机或切片微波机上，用冷冻刀片将组织切割成薄片，通常厚度为10-30μm。
5.将切割好的切片用刷子或微型镊子移至载玻片上，通常用蛋白质固定剂或聚甲醛进行固定处理，以保持切片的形态结构。
6.干燥：将固定好的切片置于干燥器中，用适当的温度和时间干燥切片，使其充分固定在玻片上。
7.染色：根据需要可对切片进行染色处理，常见的染色方法有HE染色、银染色、免疫组化染色等。
二、冰冻切片的注意事项：1.快速冷冻：为了保持组织的形态结构和避免变形，必须采用快速冷冻的方法，将组织迅速冷冻至-20℃以下。
液氮和刀片冷冻架是常用的设备。
2.切片设备：选择适合的切片设备，如切片机或切片微波机。
刀片的选择也十分重要，常见的冰冻刀片有钢刀、玻璃刀和蜡刀，选择合适的刀片可以提高切片质量。
3.切片厚度：切割时要控制好切片的厚度，通常为10-30μm。
切片太薄容易导致组织切面不完整，切片太厚则不能得到清晰的显微镜图像。
4.切片技巧：切片技巧也很重要，需要稳定的手部技巧和耐心。
在切割时要保持刀片的稳定，避免划伤或碎裂组织。
5.切片保存：切好的切片需要妥善保存，可以用普通干燥器或冷冻干燥器进行干燥，避免切片变形和水分损失。
6.染色方法：根据需要选择合适的染色方法。
冰冻切片的操作方法有哪些
冰冻切片的操作方法有哪些冰冻切片是一种常见的食物处理技术，它可以确保食材在冷冻过程中保持原始的形状和质地。
下面是关于冰冻切片的操作方法的详细说明。
1. 准备工作在进行冰冻切片之前，首先需要准备好一些必要的工具和材料。
这些包括切菜刀、切菜板、塑料袋或保鲜膜、冷冻盒或密封袋以及适量的冰块。
2. 选择适合冰冻切片的食材不是所有的食材都适合冰冻切片。
最适合冰冻切片的食材通常是那些有较高水分含量和较低油脂含量的食材，例如水果、蔬菜和肉类。
这些食材冰冻后容易切片且切片后质地会更加口感丰富。
3. 清洗和准备食材在切片前，需要彻底清洗食材以确保其卫生。
如果有必要，去掉果皮或蔬菜的外皮。
此外，根据需要将食材切成适当大小的块状，以方便在冷冻过程中进行切片。
4. 将食材放入塑料袋或密封袋中把要切片的食材放入塑料袋或密封袋中，然后将袋子密封。
确保将食材放在一层，并尽量避免重叠。
这有助于确保冷冻后食材可以更容易地进行切片。
5. 冷冻食材将装有食材的塑料袋或密封袋放入冷冻盒或冷冻室中。
在冷冻过程中，密封袋中的食材将逐渐凝固，并且保持原始的形状和质地。
通常情况下，将食材冷冻4-6小时即可。
6. 取出食材并切片冷冻时间到达后，从冰箱中取出袋子。
使用切菜刀和切菜板，将食材迅速切成薄片。
由于食材已经冷冻，这将更容易进行。
7. 存储和使用切片食材将切片食材放回密封袋中，并将其重新放入冷冻器中。
这样可以确保食材保持新鲜和安全。
在需要使用切片食材时，只需取出所需数量即可，而无需解冻整个食材。
冰冻切片是一种方便快捷的食材处理方法，可以让食材保持原始的形状和质地。
通过以上的操作方法，您可以轻松地进行冰冻切片，并在需要时使用这些切片食材来制作各种美食。
请记住，在进行冰冻切片之前，请确保食材的新鲜和卫生，并按照适当的贮存方式保存切片食材，以确保其品质和食用安全。
冰冻切片步骤很全面
冰冻切片步骤很全面文档编制序号：[KKIDT-LLE0828-LLETD298-POI08]冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。
它实际上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。
在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。
同时，由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤，因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断。
1. 取材：应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。
2. 速冻：为了较好地保存细胞内的酶活性或尽快制成切片标本的需要，一般在取材后就要立刻对组织块进行速冻，使组织温度骤降，缩短降温的时间，减少冰晶的形成。
液氮速冻切片法是实验室最常用的速冻切片方法。
具体做法是将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。
在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。
若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。
3．固定：样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min让OCT胶浸透组织。
取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。
组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min。
4.切片：恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10μm。
切片时，低温室内温度以-15℃～-20℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。
切好室温放置30min后，入4℃丙酮固定5~10min，烘箱干燥20min。
PBS 洗5min×3。
肺冰冻切片制作流程
肺冰冻切片制作流程
肺冰冻切片的制作流程主要包括以下几个步骤：
1、取材与准备：首先需要取出组织样本，并切割组织块使其符合冰冻切片用包埋模型。
这一步骤是为了确保切片的准确性和完整性。
2、骤冷：通常采用骤冷、速冻的方法进行，冷冻速度为1~10°C/s，以减少冰晶形成。
具体方法有干冰-丙酮（乙醇）法或液氮法。
3、冷冻保护：加入冷冻保护液，如甲醇或乙醇等，以防止组织解冻时发生变化。
4、包埋：使用低温包埋剂（OCT）包埋冰冻组织。
如果组织块小，可以适量加OCT包埋剂浸没组织。
5、切片：将组织放置于恒冷箱中进行切片。
在制成冻块后，置入恒冷箱切片机冰冻切片。
6、固定：样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，在4℃冰箱预冷5-10分钟让OCT胶浸透组织。
7、保存：若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。
此外，肺组织的最佳切片温度约-20℃，在此温度区间可以制作较满意的切片。
然而，肺组织冰冻切片的质量一般不如常规石蜡切片，且冰冻准确率大多低于90%。
因此，在制作过程中需要特别注意操作的准确性和技巧。
冷冻切片法流程
冷冻切片法流程冷冻切片法可是个很有趣的实验方法呢！让我来给你讲讲它的流程吧。
一、准备工作。
咱得先把要用的东西都准备好。
像冷冻切片机得提前检查好，确保它能正常工作。
还有载玻片、盖玻片，这些小物件可不能少。
冷冻剂也得备足了，这就像是给咱们的切片准备的“小冰箱”呢。
另外，取材工具也很重要，像手术刀之类的，要锋利又干净。
标本也是关键，要选取合适的组织，这个组织得具有代表性，就像选演员一样，得挑个能把整个故事讲清楚的“主角”组织。
二、取材。
这一步可不能马虎。
要快速地把组织取出来，为啥要快呢？因为时间一长，组织可能就会发生变化啦。
就像新鲜的水果放久了会烂一样，组织放久了结构可能就不那么准确了。
取出来的组织大小也要合适，不能太大也不能太小。
太大了放不进切片机，太小了又可能切不到想要的结构，就像穿衣服一样，得不大不小刚刚好。
而且在取材的时候，要尽量减少对组织的损伤，这组织可是很“娇弱”的呢。
三、冷冻。
把取好的组织放到冷冻切片机里面冷冻。
这个过程就像是把食物放进冰箱速冻一样。
冷冻的温度得调好，不能太冷也不能不够冷。
太冷了可能会让组织变得太硬，容易碎掉，就像冰块掉地上容易裂一样。
不够冷呢，组织又切不好，软趴趴的怎么能切出漂亮的切片呢。
在冷冻的时候还要注意观察组织的状态，就像看着锅里的菜有没有熟一样。
四、切片。
等组织冷冻好了就可以切片啦。
切片的时候手要稳，就像绣花一样。
切片的厚度也很有讲究，太厚了看不清楚细胞结构，太薄了又容易切坏。
这就需要不断地练习，找到那种恰到好处的感觉。
而且切出来的切片要完整，不能缺边少角的，不然就像漂亮的拼图少了几块，多可惜呀。
五、贴片。
切好的片子要贴到载玻片上。
这个时候要小心操作，就像把小宝贝轻轻地放在床上一样。
要确保片子贴得平平整整的，不能有褶皱，要是有褶皱就像衣服没熨平一样，看着就不舒服，而且还会影响观察呢。
六、染色。
贴片完成后就可以染色啦。
染色剂就像给组织穿上不同颜色的衣服，这样我们就能更清楚地看到不同的结构啦。
冰冻切片实验步骤
全部实验步骤1 取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时2 30%蔗糖脱水48小时以上3 -250C包埋（冰冻切片机内）4冰冻切片冰冻切片步骤1.冰冻切片4um左右，室温25°C复温30min，浸入4°C预冷的丙酮固定10min，2.PBS（PH为7.2-7.4）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约1min后更换）3.用30%过氧化氢一份，纯甲醇50份（需要现配，避光条件封闭，可以用纸盒盖住皿）30min。
4.PBS（PH为7.2-7.4，酸性）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约1min后更换），甩去PBS，擦干切片周围的水分，用免疫组化笔或蜡笔在组织周围画一适当大小的圈，距离组织不宜太近，与切片组织保持5mm左右距离，太近会导致边缘效应。
5.5%BSA，室温孵育20min，期间注意观察，以免BSA干燥而导致背景太高，请注意在皿内玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。
6.甩去血清，PBS洗1min，擦干周边水分，圈内可不擦，但尽量要甩干，以免导致抗体浓度不均。
7.配置一抗工作液用5%BSA（抗体浓度为1:100），悬空加入一抗工作液50-100ul，枪头不要触及组织，以免损伤组织结构，滴加一抗后在水平桌面画圈方式振荡，混匀一抗，否则抗体可能附着不匀。
8.放入湿盒内，置于4°C冰箱过夜（最长不可超过48h），注意盖盖，放入后观察玻片是否处于水平位（否则抗体可能流失，导致玻片组织干掉，出现背景高和假阳性），孵育期间观察抗体是否干，若干了赶快用PBS清洗浸泡。
9.第二天上午取出玻片，置常温复温30min，后PBS冲洗1+5+5+5min，10.滴加1:100生物素标记的二抗（注意选择核对一抗来源，抗体加入稀释后在EP管内弹匀，掌上离心机离心）室温孵育30min-1h，后PBS冲洗1+5+5+5min。
11.滴加1:100比例稀释的辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素PBS稀释液（SABC）室温1h，后PBS冲洗1+5+5+5min，甩干，以免显色不均。
冰冻切片实验步骤
全部实验步骤1 取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时2 30%蔗糖脱水48小时以上3 -250C包埋（冰冻切片机内）4冰冻切片冰冻切片步骤1.冰冻切片4um左右，室温25°C复温30min，浸入4°C预冷的丙酮固定10min，2.PBS（PH为7.2-7.4）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约1min后更换）3.用30%过氧化氢一份，纯甲醇50份（需要现配，避光条件封闭，可以用纸盒盖住皿）30min。
4.PBS（PH为7.2-7.4，酸性）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约1min后更换），甩去PBS，擦干切片周围的水分，用免疫组化笔或蜡笔在组织周围画一适当大小的圈，距离组织不宜太近，与切片组织保持5mm左右距离，太近会导致边缘效应。
5.5%BSA，室温孵育20min，期间注意观察，以免BSA干燥而导致背景太高，请注意在皿内玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。
6.甩去血清，PBS洗1min，擦干周边水分，圈内可不擦，但尽量要甩干，以免导致抗体浓度不均。
7.配置一抗工作液用5%BSA（抗体浓度为1:100），悬空加入一抗工作液50-100ul，枪头不要触及组织，以免损伤组织结构，滴加一抗后在水平桌面画圈方式振荡，混匀一抗，否则抗体可能附着不匀。
8.放入湿盒内，置于4°C冰箱过夜（最长不可超过48h），注意盖盖，放入后观察玻片是否处于水平位（否则抗体可能流失，导致玻片组织干掉，出现背景高和假阳性），孵育期间观察抗体是否干，若干了赶快用PBS清洗浸泡。
9.第二天上午取出玻片，置常温复温30min，后PBS冲洗1+5+5+5min，10.滴加1:100生物素标记的二抗（注意选择核对一抗来源，抗体加入稀释后在EP管内弹匀，掌上离心机离心）室温孵育30min-1h，后PBS冲洗1+5+5+5min。
11.滴加1:100比例稀释的辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素PBS稀释液（SABC）室温1h，后PBS冲洗1+5+5+5min，甩干，以免显色不均。
实验五 冰冻切片法
四、实验结果
观察小鼠肝脏细胞的形态
五、作业
实验完毕，每人交制好的玻片标本1片，在
标签纸写上玻片名称及自己的姓名和日期；
实验报告（姓名和日期）。
注意事项
速冻是冰冻切片的关键，冷冻的速度可有效的减少冰晶的出现， 软组织以及细胞丰富的组织如肝、脾、淋巴结等2-4min；
冰冻切片的温度要适宜，温度过低、过高会导致组织过硬或硬度 不够，从而影响切片质量，产生搓板状、梯田状、厚薄不均，破 碎或粉末状现象。根据器官组织形态结构和组成成分的不同，冰 冻组织切片的温度亦不同。推荐：乳腺、卵巢、子宫等：-20~25℃ 胃肠：-18~-20℃-甲状腺、肝，肾、脾等：-15℃左 右· 脂肪组织一般在-35℃以下； 封片时要做到无气泡，无溢液、标签清楚端正，保证切片的整洁。
冰冻切片的种类
冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法、二 氧化碳冰冻切片法、甲醇循环制冷冰冻切片法、半导 体冰冻切片法等。这些方法，随着时代的变迁，科技 的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也 逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切 片法，正在受到青睐。
半导体冰冻切片机构造
半导体制冷器
冷台 冷刀
制冷调节器
切片机
一、实验目的
了解半导体冰冻切片机的基本构造；
练习半导体冰冻切片法制片。
二、实验材料及用品
实验材料：小鼠肝脏
实验用具：载、盖玻片药品：甘油明胶液。
三、实验步骤
取材：引颈致死法杀死小鼠，取其肝脏，将新鲜肝脏组织切成1~1.5cm×1~1.5cm X 0.3~0.5cm 大小。组织块可不加任何处理，直接进行冰冻切片。另一种方法是组织先经10％中性福马林或 钙福马林固定，再水洗后冰冻切片。若组织用酒精固定，则固定后须用流水彻底除去组织内的 酒精，否则因酒精冰点低，不易冰冻。 切片机连接：半导体冰冻切片机的水路和电路按使用说明书要求接好。水流的次序为：自来水 龙头→冷台进水→冷台出水→冷刀进水→冷刀出水→下水。致冷器工作时，应始终保持水流畅 通，要牢牢记住，先通水，后通电；先关电源，后关水，否则将烧坏机器。必须保证一定的流 水量：>400ml/min 将新鲜材料置于冷台上冰冻组织，组织块冻结的硬度与切片的成败有密切关系，如切削后在刀 片上出现白色而脆的飞散碎片，即组织块冻结太硬；若为软弱的粥状则太软，只有适当硬度切 出的切片才能平展成形。这要根据工作经验，控制适当的致冷温度。 切片：切片厚度一般为10-15um。切下来的切片用湿毛笔从刀上挑起，置于清水中使其展开， 或直接粘于破片上。 封片：由于切片染色后不再经过脱水、透明等步骤，因此必须使用水溶性的封片剂，如甘油明 胶液，
冰冻切片组织制备
冰冻切片组织制备是一种在手术台上取下的组织放到冷冻机里面，在-20度左右冻成硬块，制成切片用于快速诊断的方法。
这种诊断仅作参考，应以石蜡诊断为主。
冰冻切片组织制备的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧
化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。
低温恒冷箱冰冻切片法是最常用的冰冻切片制备方法之一。
它的
工作原理是将手术台取下的组织迅速放入低温恒冷箱中，在-20度左右的低温下冷冻组织，使其变得坚硬。
然后，使用切片机将冷冻的组织切成薄片，制成切片。
这个过程可以在几分钟内完成，为医生提供快速的病理诊断。
二氧化碳冰冻切片法是一种较为新颖的冰冻切片制备方法。
它的
优点在于可以在短时间内将组织冷冻至-20度左右，而且不会对组织造成太大的损伤。
其工作原理是将手术台取下的组织放入二氧化碳制冷机中，利用液态二氧化碳的低温迅速冷冻组织。
然后，使用切片机将冷冻的组织切成薄片，制成切片。
甲醇循环制冷冰冻切片法是一种较为少见的冰冻切片制备方法。
它的优点在于可以将组织在短时间内迅速冷冻至-40度左右，而且制出的切片质量较好。
其工作原理是将手术台取下的组织放入甲醇循环制冷机中，利用甲醇的低温迅速冷冻组织。
然后，使用切片机将冷冻的组织切成薄片，制成切片。
无论采用哪种冰冻切片制备方法，其最终目的都是为医生提供快
速的病理诊断，以便在手术中及时判断病情，为患者提供最佳的治疗
方案。
同时，冰冻切片诊断结果仅作参考，最终的诊断结果应以石蜡诊断为主。
冰冻切片免疫组化步骤
冰冻切片免疫组化步伐之迟辟智美创作
1.需要准备的资料
APES包被的载玻片
PBS（）
4%多聚甲醛
PBST（含Tween-20）
PBST-G（含甘氨酸）
2.冰冻切片
取出组织块放于软塑料盖或特制的小盒内，之后将其缓慢平放于盛有液氮的小杯内，让盒底部接触液氮（小盒及组织块切勿浸入液氮内），年夜约10-20秒组织即迅速冰冻成块.取出组织冰块立即置于-80℃冰箱贮存备用，或置于恒温切片机冰冻切片.
切片厚度4-8 um (5 um)，对免疫组化的需要用APES包被的载玻片，以增加组织片的粘附性.
切片后如不立即染色，必需吹干，贮存于高温冰箱内保管.
3.免疫组化染色步伐
固定：取出切片，室温放置5mins.用4%的多聚甲醛PBS溶液室温固定15mins，PBS冲刷三次（冲刷可以采纳侧斜淋洗，也可至于平皿中摇晃）.
打孔：如果是需要染细胞内的卵白，用曲拉通（TritonX-100）打孔：组织样品浸于含0.25% TritonX-100的PBS中10mins，之后用PBS洗3次，每次5mins.如果是染膜卵白的，不需要曲拉通打孔.
封闭：将组织置于含1%BSA的PBST溶液中30mins，封闭非特异性粘合的抗体.对多聚甲醛固定并进行免疫荧光的样本，在封闭缓冲液中加入的甘氨酸.
孵化：组织样本浸于一抗（用含1%BSA的PBST稀释），放于湿盒中，室温1h或4℃过夜.用PBS洗3次，每次5mins.
浸入二抗（1%BSA的PBST溶液），室温1h.PBS洗3次，每次5mins.
染色：，染色1min，PBS淋洗三次.
封片：用盖玻片封片，指甲油固定，保管与4或-20℃.。
冷冻切片程序
冷冻切片程序:
在手术过程中，外科大夫为了明确手术切除标本的性质及病变。
通常送新鲜组织做冷冻切片病理检查，由病理医师在短时间内（一般30分钟左右）做出病理诊断。
外科医生根据病理诊断，决定手术切除范围。
冷冻切片需要一台具有冷冻功能的切片机。
常用冷冻切片机有以下几种类型：①恒冷式冷冻切片机，切片机装在恒冷柜内，恒冷柜内的温度大约-20～-30℃。
②二氧化碳冷冻切片机和③半导体冷冻切片机，该机在冬春秋季一般应用还可以，只是在炎热的夏天受气温的影响，很难切出高质量的切片。
只有在房间内按装一台功率略大一点的空调，气温高的问题可以得到一定的解决。
（二级医院，无冰冻切片机者，可以使用“超声波快速组织处理仪”做快速石蜡切片诊断，代替冷冻，一般50分钟左右可以出报告）。
冰冻切片的制备
冰冻切片组织的制备:固定将组织置于4%多聚甲醛固定液中，4℃摇床过夜。
漂洗将固定后的标本用1X PBS漂洗三次，每次15分钟。
脱水将组织置于30%蔗糖溶液中，4℃摇床过夜。
第二天观察是否脱水完全，判断的标准是，当管竖直时，组织是否沉到蔗糖溶液的底部，若组织已完全沉降到蔗糖溶液的底部，平放或震荡后仍能沉降，则可判断组织已脱水完全。
包埋将组织倒入培养皿中，用眼科刀将脑和脊髓根据切片切面的需要在不同的部位切开，并做好头尾端的标记。
之后将组织置于包埋盒中，用滤纸吸干组织周围多余的蔗糖溶液，滴加OCT（optimal cutting temperature compound）到包埋盒中，用移液枪头小心的将组织周围的O.C.T混匀，切忌起气泡，静止10分钟，以防切片时脱片。
重新取一个包埋盒，将组织移入到包埋盒中，倒入OCT，再次用移液枪头将组织与O.C.T 混匀，将组织按切片需要方向摆放于包埋盒的底部，迅速置于干冰与酒精的混合物中。
在包埋盒上做好标记，用保鲜膜和锡纸包好后放入-80℃冰箱贮藏待切。
切片：切片前先将切片机的箱体温度及刀头温度均设为-20℃，把包埋盒从-80℃冰箱取出置于切片机中平衡半小时左右。
之后将包埋块用O.C.T固定在样品托上，然后将样品托固定在样品头上，调整合适的位置，以使样品与刀头处于平行位置。
手动切片。
用细毛笔将切片均匀整齐地平铺在明胶包被的载玻片上，室温下晾片30min-1h后进行免疫组化染色。
冰冻切片的快速染色法冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分钟后即可染色。
以往，为了防止切片脱落，当切片附贴于载玻片后，即用电吹风吹干后再固定。
根据实验对比认为这种做法欠妥未经固定的切片，强热作用后，蛋白发生变性，核内含有的物质由于热的作用融合在一起，染色后镜下分辨不出核内的各种物质。
冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，这样可以使切片中细胞内各种物质都在没有任何变化的情况下被固定起来，核染色质清晰，核仁明显，其他物质都完好保存。
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1.速冻组织：冰冻切片机的使用需要加强！！
将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾?，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。
取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。
冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。
2．组织固定与切片：
样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min让OCT胶浸透组织。
取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。
组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min。
修片，切片。
重点步骤
室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定5~10min，烘箱干燥20min。
PBS洗，5分钟×3。
进行抗原热修复（7-1-5-1-5）微波热修复可以吗，室温自然冷却。
（选做：用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性）。
3．组织切片免疫荧光染色：
冰冻切片室温晾干15min,用组化油笔将待染组织圈好，圈不可太小，太小时若阻水胶粘到组织上，组织便不能染上色。
圈也不宜太
大，太大则浪费抗体。
选做：用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1 小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）
滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液(抗体的量视组织大小而定，原则是可以均匀覆盖组织面，且保证整个过程中不会使组织干涸，我们的胰腺组织一般是加10-20μl)，将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒，室温孵育2小时或4℃过夜。
第二天早上，先将湿盒放到37℃回温1h（37℃环境可用二氧化碳培养箱或者分子杂交箱提供），然后吸取片上的一抗进行回收，将切片插入到小染缸PBS冲洗，。
滴加用PBS稀释好的二抗（从此开始所有步骤都在暗房进行）置于分子杂交箱中37℃孵育1小时。
回收二抗，切片置于染缸内，PBS洗5min×3次。
滴加DAPI工作液染核，室温10-20min(工作浓度0.1%染色15min) 回收DAPI,滴加5-10μl抗荧光衰减封片剂或中性树胶，用处理干净的盖玻片封片，即可到荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察拍照。
做好的片放在切片盒内，置于4℃冰箱，可保存一周左右。
（做免疫组化时请戴好手套）
注意事项：
（1）整个实验过程中勿使表面干燥
（2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光。