冰冻切片步骤2010.6

1.速冻组织：冰冻切片机的使用需要加强！！

将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾?，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。

冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。

2．组织固定与切片：

样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min让OCT胶浸透组织。

取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。

组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min。

修片，切片。重点步骤

室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定5~10min，烘箱干燥20min。PBS洗，5分钟×3。进行抗原热修复（7-1-5-1-5）微波热修复可以吗，室温自然冷却。（选做：用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性）。

3．组织切片免疫荧光染色：

冰冻切片室温晾干15min,用组化油笔将待染组织圈好，圈不可太小，太小时若阻水胶粘到组织上，组织便不能染上色。圈也不宜太

大，太大则浪费抗体。

选做：用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1 小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）

滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液(抗体的量视组织大小而定，原则是可以均匀覆盖组织面，且保证整个过程中不会使组织干涸，我们的胰腺组织一般是加10-20μl)，将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒，室温孵育2小时或4℃过夜。

第二天早上，先将湿盒放到37℃回温1h（37℃环境可用二氧化碳培养箱或者分子杂交箱提供），然后吸取片上的一抗进行回收，将切片插入到小染缸PBS冲洗，。

滴加用PBS稀释好的二抗（从此开始所有步骤都在暗房进行）置于分子杂交箱中37℃孵育1小时。

回收二抗，切片置于染缸内，PBS洗5min×3次。

滴加DAPI工作液染核，室温10-20min(工作浓度0.1%染色15min) 回收DAPI,滴加5-10μl抗荧光衰减封片剂或中性树胶，用处理干净的盖玻片封片，即可到荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察拍照。做好的片放在切片盒内，置于4℃冰箱，可保存一周左右。（做免疫组化时请戴好手套）

注意事项：

（1）整个实验过程中勿使表面干燥

（2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光