Sephadex G-25凝胶层析说课材料
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（1）葡聚糖凝胶Sephadex G-25 （2）血红蛋白与核黄素的混合液 （3） 洗脱液：0.05mol /L磷酸缓冲液 （pH=7.3）或生理盐水
操作流程
凝胶处理 ↓
层析柱的预备 ↓
装柱 ↓
平衡 ↓
加样与洗脱 ↓
实验操作
（1）凝胶处理。将Sephadex G-25凝胶干粉放入过量水 中
浸泡24h或沸水水浴2h。浸泡后，搅动凝胶在静置，待 凝胶
思考题
（1）说明凝胶层析的原理 （2）层析柱中的“纹路” 、气泡和凹凸不平 的床表面对层析效果有何影响？ （3）连接高位贮液瓶与层析柱之间的U形导 管，有防止层析床液体流干的作用，说明其 原理。 （4）恒压贮液瓶为何能保证操作压的恒定？
谢谢观赏
此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢
注意事项
（1）各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，否 则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应无液体，并随 着柱下口溶液的流出不断有气泡产生，则表示恒压瓶不漏气。 操作过程中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏 气之处，应仔细检查并加以纠正。 （2）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝 胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液 体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。
沉积后，倾去上层细粒悬液，如此反复多次。
（2）层析柱的预备。用清洗剂将层析柱仔细清洗干净。 固
定好层析柱各处的接口，用水检查层析柱各处的接口密 封性。
将清洗后的层析柱垂直固定在铁架台上。自柱底端出口 的聚
乙烯管内注入溶液以除去柱管内和尼龙网底部的气泡， 待气
泡排出后，使溶液在底部留至3 ~5cm高即关闭出水口。
原理示意图
l 分子大小不同混合物上柱； 2 洗脱开始，小分子扩散进人凝胶 颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3 大小分子分开： 4大分子行程 较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中
实验器材与试剂
（一）器材 1.2cm×40cm层析柱、1mL微量可调式移
液器、721E型分光光度计、恒压贮液瓶、 自动部分收集器 （二）试剂
（4）平衡。装好后，使层析床稳定5~10min，然后接上高位 贮液瓶，打开出口活塞，调节高位贮液瓶的高度，控制流速 为1mL/min。用2倍于床体积的洗脱液进行平衡，使层析床稳 定。 （5）加样与洗脱。打开平衡好的层析柱底端出口，使柱内 溶液流至与床表面相切时关闭出口。将吸有0.5mL样品的加 样滴管在床表面上1mm处沿管内壁轻轻转动加样，加完后， 打开底端出口使样品流至床表面，关闭出口，用少量洗脱液 小心清洗管内壁1~2次，使样品流至床表面，然后将洗脱液 加至距床表面2~3cm高，接上高位贮液瓶并调好流速即开始 洗脱。 （6）收集与测定。收集时可用自动部分收集器或手工操作， 每管接洗脱液3mL，直至第二个洗脱峰降至基线附近。收集 后用721E型分光光度计在451nm波长处以洗脱液为空白，对 每管收集液进行光吸收测定。以收集管数为横坐标，吸光度
Sephadex G-25பைடு நூலகம்胶层析
实验目的
（1）掌握凝胶层析的原理 （2）掌握柱层析的基本装置 （3）熟悉凝胶层析的操作过程
常用的层析方法：凝胶层析、离子交换层 析、亲和层析、吸附层析、分配层析。
本次试验用的是凝胶层析，凝胶层析的固 定相是凝胶颗粒，流动相是单一缓冲液或盐 溶液，利用的是混合物中各种成分大小不同 这种原理特性来分离混合物。
实验原理
凝胶层析柱中装填着许多直径小于1mm的凝胶颗 粒，
颗粒内部不是实心的，而是呈三维多孔网状结构。 在洗
脱过程中，混合物样品流经凝胶柱，大分子物质因 其直
径大于凝胶网孔的孔径，不能进入凝胶颗粒内部， 只能
沿着凝胶颗粒的空隙随溶剂流动，流程短而移动速 度快，
先流出层析柱；小分子组分由于其分子直径小于网
操作流程
凝胶处理 ↓
层析柱的预备 ↓
装柱 ↓
平衡 ↓
加样与洗脱 ↓
实验操作
（1）凝胶处理。将Sephadex G-25凝胶干粉放入过量水 中
浸泡24h或沸水水浴2h。浸泡后，搅动凝胶在静置，待 凝胶
思考题
（1）说明凝胶层析的原理 （2）层析柱中的“纹路” 、气泡和凹凸不平 的床表面对层析效果有何影响？ （3）连接高位贮液瓶与层析柱之间的U形导 管，有防止层析床液体流干的作用，说明其 原理。 （4）恒压贮液瓶为何能保证操作压的恒定？
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注意事项
（1）各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，否 则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应无液体，并随 着柱下口溶液的流出不断有气泡产生，则表示恒压瓶不漏气。 操作过程中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏 气之处，应仔细检查并加以纠正。 （2）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝 胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液 体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。
沉积后，倾去上层细粒悬液，如此反复多次。
（2）层析柱的预备。用清洗剂将层析柱仔细清洗干净。 固
定好层析柱各处的接口，用水检查层析柱各处的接口密 封性。
将清洗后的层析柱垂直固定在铁架台上。自柱底端出口 的聚
乙烯管内注入溶液以除去柱管内和尼龙网底部的气泡， 待气
泡排出后，使溶液在底部留至3 ~5cm高即关闭出水口。
原理示意图
l 分子大小不同混合物上柱； 2 洗脱开始，小分子扩散进人凝胶 颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3 大小分子分开： 4大分子行程 较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中
实验器材与试剂
（一）器材 1.2cm×40cm层析柱、1mL微量可调式移
液器、721E型分光光度计、恒压贮液瓶、 自动部分收集器 （二）试剂
（4）平衡。装好后，使层析床稳定5~10min，然后接上高位 贮液瓶，打开出口活塞，调节高位贮液瓶的高度，控制流速 为1mL/min。用2倍于床体积的洗脱液进行平衡，使层析床稳 定。 （5）加样与洗脱。打开平衡好的层析柱底端出口，使柱内 溶液流至与床表面相切时关闭出口。将吸有0.5mL样品的加 样滴管在床表面上1mm处沿管内壁轻轻转动加样，加完后， 打开底端出口使样品流至床表面，关闭出口，用少量洗脱液 小心清洗管内壁1~2次，使样品流至床表面，然后将洗脱液 加至距床表面2~3cm高，接上高位贮液瓶并调好流速即开始 洗脱。 （6）收集与测定。收集时可用自动部分收集器或手工操作， 每管接洗脱液3mL，直至第二个洗脱峰降至基线附近。收集 后用721E型分光光度计在451nm波长处以洗脱液为空白，对 每管收集液进行光吸收测定。以收集管数为横坐标，吸光度
Sephadex G-25பைடு நூலகம்胶层析
实验目的
（1）掌握凝胶层析的原理 （2）掌握柱层析的基本装置 （3）熟悉凝胶层析的操作过程
常用的层析方法：凝胶层析、离子交换层 析、亲和层析、吸附层析、分配层析。
本次试验用的是凝胶层析，凝胶层析的固 定相是凝胶颗粒，流动相是单一缓冲液或盐 溶液，利用的是混合物中各种成分大小不同 这种原理特性来分离混合物。
实验原理
凝胶层析柱中装填着许多直径小于1mm的凝胶颗 粒，
颗粒内部不是实心的，而是呈三维多孔网状结构。 在洗
脱过程中，混合物样品流经凝胶柱，大分子物质因 其直
径大于凝胶网孔的孔径，不能进入凝胶颗粒内部， 只能
沿着凝胶颗粒的空隙随溶剂流动，流程短而移动速 度快，
先流出层析柱；小分子组分由于其分子直径小于网