Sephadex G-25凝胶层析说课材料
Sephadex G-25 凝胶层析2
Sephadex G-15
Sephadex G-25
粗 中粗 细 超细
Sephadex G-50
粗 中粗 细 超细
Sephadex 中粗
G-75
超细
Sephdex G-100
中粗 超细
Sephadex 中粗 G-150 超细
Sephadex 中粗 G-200 超细
干胶颗粒 直径/μm
40-120
40-120
凝胶装置图
色谱峰和分离结果
影响凝胶柱层析的主要因素有哪些？
①层析柱的选择与装填 层析柱的大小应根据分离样品量的 多少及对分辨率的要求而定。凝胶柱填装后用肉眼观察应均 匀、无纹路、无汽泡。
②流动相――洗脱液的选择：是含有一定浓度盐的缓冲液，目 的是为了防止凝胶可能有吸附作用。其选择主要取决于待分 离样品，一般来说只要能溶解洗脱物 质，并不使其变性的 缓冲液都可用于凝胶层析。
（1）凝胶处理。将Sephadex G-25 凝胶干粉放入过量水中浸泡24h或沸 水水浴2h。浸泡后，搅动凝胶再静置，戴凝胶沉积后，倾去上层细粒悬 液，如此反复多次。
（2）层析住的预备。用清洗剂将层析柱仔细清洗干净。
（3）装柱。将处理好的凝胶在烧杯内用一倍体积的洗脱液搅拌成悬浮液， 自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中。
补：核黄素
维生素B2，又称核黄素， 维他命B2。分子式 C17H20N4O6。它是人 体必需的13种维生素之一， 作为维生素B族的成员之 一，微溶于水，可溶于氯 化钠溶液，易溶于稀的氢 氧化钠溶液。维生素B2 是机体中许多酶系统的重 要辅基的组成成分，参与 物质和能量代谢。
【实验器材与试剂】
（2）离子交换层析(ion exchange chromatography)
实验三葡聚糖凝胶柱层析纯化蛋白质
层析柱的重要参数 ：
Vt(total volume) Vo(outer volume) Vi(inner volume) Ve(elution volume) Vg(gel volume) Vt=Vo+Vi+Vg , Ve=Vo+Kd×Vi。
组分的洗脱体积（Ve）：①当样品的 体积很少时（与洗脱体积比较可以忽 略不计） ，在洗脱图中，从加样到峰 顶位置所用洗脱液体积为Ve。 ②当 样品体积与洗脱体积比较不能忽略时， 洗脱体积计算可以从样品体积的一半 到峰顶位置。③当样品体积很大时， 洗脱体积计算可以从应用样品开始到 洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。
常用0.02％叠氮钠或20%乙醇溶液作防腐剂。 1 厘 米 光 程 时 ， 254nm 处 透 光 率 为 60 ％ ，
280nm处透光率为100％。
3、试剂、器材：
3.1、层析介质 Sephadex G-50； 3.2、样品（包含三个组分）： ①蓝色葡聚糖2000， ②溶菌酶，③ Trp
上样量：0.4ml/柱。 3.3、洗脱液：0.15M氯化钠，即生理盐 水。
、洗脱液流速的影响：
洗脱液的流速与样品分离的分辨率相关。 流速过快，会使色谱峰变形， 流速过慢，样品扩散倾向加剧。 一般流速控制在30－200ml/h。
今天洗脱流速控制在1ml/min。
、洗脱液的离子强度和pH值的影响：
纯化蛋白时,通常选用离子强度＞0.02的盐 溶液作洗脱剂，以增加样品的溶解度和 消除凝胶的吸附作用；
Kd是分配系数：用于衡量两个物质的分离分辩率， 是凝胶层析的一个特征常数，只与被分离物质 分子大小和凝胶孔径大小有关，与层析柱的长 短粗细无关。
Kd值的计算：Kd=(Ve-Vo)/Vi
实验6 凝胶层析分离技术—血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离
实验6、凝胶层析分离技术——血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离(学生实验方案）一、实验目的1. 掌握凝胶层析的基本原理。
2. 熟悉凝胶层析的操作过程。
3．掌握蛋白质洗脱分离监测和收集系统的安装及使用技术。
二、实验原理凝胶层析又叫分子筛层析，是利用凝胶将分子大小不同的物质进行分离的方法。
当分子大小不同的物质通过凝胶时,由于凝胶颗粒内部的网状结构具有分子筛作用,分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。
本实验用葡聚糖凝胶作支持物，用核黄素（黄色，相对分子质量为267KD）和血红蛋白（红色，相对分子质量为67000KD）混合物作样品，在层析时，血红蛋白相对分子质量大，不能进入凝胶颗粒内部，而从凝胶颗粒间隙流下，所受阻力小，移动速度快，先流出层析柱；核黄素相对分子质量小，可进入凝胶颗粒内部，洗脱流程长，因而所受阻力大，移动速度慢，后流出层析柱。
这样就可分离核黄素和血红蛋白。
三、试剂配制1、葡聚糖凝胶：sephadexG-252、洗脱液（pH7.2，0.1mol/L磷酸盐缓冲液）：取0.1mol/L磷酸氢二钠720ml和0.1mol/L 磷酸二氢钠280ml，混匀。
共配10L。
3、0.2%（m/v）血红蛋白溶液4、0.05%（m/v）核黄素(VitB2)溶液5、样品液：0.05%核黄素(VitB2)与0.2%血红蛋白液等量混合置4o C保存。
注意：核黄素需近期生产，并新鲜配制。
四、主要仪器设备1、恒流泵2、层析柱：高25～40cm，内径1cm。
3、自动收集器4、紫外检测仪5、台式记录仪6、可见分光光度计五、实验步骤1、凝胶处理；（1）溶涨与浮选：称取SephadexG-25 5g，加磷酸盐缓冲液（洗脱液）50ml，置于水中浸泡6小时（沸水浴中为2小时）。
转移至100mL量筒中，再加磷酸盐缓冲液（改用蒸馏水）至100mL刻度，搅动凝胶再静置，待凝胶沉积后，倾去上层细粒悬浮，如此反复多次。
（2）平衡：将浸泡后的凝胶，用3~4倍量的洗脱液处理约1小时，搅拌后继续去除上层细浮悬液。
Sephadex G-25凝胶层析
层析技术分离纯化生物大分子利用那些物 理化学性质上的差异？
血红蛋白的相对分子质量与核黄素的相对 分子质量差异很大，采用什么技术分离它 们？ 采用该技术分离血红蛋白与核黄素需要到 哪些实验器材与试剂？
（1）掌握凝胶层析的原理 （2）掌握柱层析的基本装置 （3）熟悉凝胶层析的操作过程
常用的层析方法：凝胶层析、离子交换层 析、亲和层析、吸附层析、分配层析。 本次试验用的是凝胶层析，凝胶层析的固 定相是凝胶颗粒，流动相是单一缓冲液或盐 溶液，利用的是混合物中各种成分大小不同 这种原理特性来分离混合物。
凝胶层析柱中装填着许多直径小于1mm的凝胶颗粒， 颗粒内部不是实心的，而是呈三维多孔网状结构。在洗 脱过程中，混合物样品流经凝胶柱，大分子物质因其直 径大于凝胶网孔的孔径，不能进入凝胶颗粒内部，只能 沿着凝胶颗粒的空隙随溶剂流动，流程短而移动速度快， 先流出层析柱；小分子组分由于其分子直径小于网孔结 构的孔径，可进入凝胶颗粒内部，流程长而移动速度慢， 比大分子物质后流出层析柱，分子大小不同的混合物因 此得到分离。
（1）说明凝胶层析的原理 （2）层析柱中的“纹路” 、气泡和凹凸不平 的床表面对层析效果有何影响？ （3）连接高位贮液瓶与层析柱之间的U形导 管，有防止层析床液体流干的作用，说明其 原理。 （4）恒压贮液瓶为何能保证操作压的恒定？
其实，世上最温暖的语言，“ 不是我爱你，而是在一起。” 所以懂得才是最美的相遇！只有彼此以诚相待，彼此尊重， 相互包容，相互懂得，才能走的更远。 相遇是缘，相守是爱。缘是多么的妙不可言，而懂得又是多么的难能可贵。否则就会错过一时，错过一世！ 择一人深爱，陪一人到老。一路相扶相持，一路心手相牵，一路笑对风雨。在平凡的世界，不求爱的轰轰烈烈；不求誓 言多么美丽；唯愿简单的相处，真心地付出，平淡地相守，才不负最美的人生；不负善良的自己。 人海茫茫，不求人人都能刻骨铭心，但求对人对己问心无愧，无怨无悔足矣。大千世界，与万千人中遇见，只是相识的 开始，只有彼此真心付出，以心交心，以情换情，相知相惜，才能相伴美好的一生，一路同行。 然而，生活不仅是诗和远方，更要面对现实。如果曾经的拥有，不能天长地久，那么就要学会华丽地转身，学会忘记。 忘记该忘记的人，忘记该忘记的事儿，忘记苦乐年华的悲喜交集。 人有悲欢离合，月有阴晴圆缺。对于离开的人，不必折磨自己脆弱的生命，虚度了美好的朝夕；不必让心灵痛苦不堪， 弄丢了快乐的自己。擦汗眼泪，告诉自己，日子还得继续，谁都不是谁的唯一，相信最美的风景一直在路上。 人生，就是一场修行。你路过我，我忘记你；你有情，他无意。谁都希望在正确的时间遇见对的人，然而事与愿违时， 你越渴望的东西，也许越是无情无义地弃你而去。所以美好的愿望，就会像肥皂泡一样破灭，只能在错误的时间遇到错的人。 岁月匆匆像一阵风，有多少故事留下感动。愿曾经的相遇，无论是锦上添花，还是追悔莫及；无论是青涩年华的懵懂赏 识，还是成长岁月无法躲避的经历……愿曾经的过往，依然如花芬芳四溢，永远无悔岁月赐予的美好相遇。 其实，人生之路的每一段相遇，都是一笔财富，尤其亲情、友情和爱情。在漫长的旅途上，他们都会丰富你的生命，使 你的生命更充实，更真实；丰盈你的内心，使你的内心更慈悲，更善良。所以生活的美好，缘于一颗善良的心，愿我们都能 善待自己和他人。 一路走来，愿相亲相爱的人，相濡以沫，同甘共苦，百年好合。愿有情有意的人，不离不弃，相惜相守，共度人生的每 一个朝夕……直到老得哪也去不了，依然是彼此手心里的宝，感恩一路有你！
血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离
定方向移动的液体或气体。柱层析中流动相一般被称为洗脱 剂。它也是层析中的重要影响因素之一。
并使各组分以不同速度移动，从而的到分离。
实验原理
层析法的特点：
➢具有极高的分辨效力 ➢具有极高的分析效率 ➢具有极高的灵敏度
➢应用广泛
影响凝胶柱层析的主要原因有？
①层析柱的选择与装填 层析柱的大小应根据分离样品量的 多少及对分辨率的要求而定。凝胶柱填装后用肉眼观察应 均匀、无纹路、无汽泡。
②流动相――洗脱液的选择：是含有一定浓度盐的缓冲液， 目的是为了防止凝胶可能有吸附作用。其选择主要取决于 待分离样品，一般来说只要能溶解洗脱物 质，并不使其变 性的缓冲液都可用于凝胶层析。
③加样量：加样量的多少应根据具体的实验而定：一般分 级分离时加样量约为凝胶柱床体积的1％－5％，而分组分 离时加样量约为凝胶柱床体积的 10%-25%.
④ 凝 胶 再 生 ： 葡 聚 糖 凝 胶 再 生 使 用 NaOH （ 0.2M ） 和 NaCl(0.5M)混合液处理。
2、层析柱的预备
用清洗剂将层析柱仔细清洗干净。清洗过程中不能使用 毛刷，以免擦伤层析柱内壁，影响层析分离效果。固定好 层析柱各处的接口，用水检查层析柱各处的接口密封性。 将清洗后的层析柱垂直固定在铁架台上。自柱底端出口的 聚乙烯管内注入溶液以除去柱管内和尼龙网底部的气泡， 待气泡排出后，使溶液在底部留至3~5cm高即关闭出水口。
30kD)
●蛋白质纯化过程中的除盐
常用的凝胶是葡聚糖凝胶G-25
●蛋白质分子量的测定
●研究蛋白质二聚体或寡聚体的存在与否
实验原理
按动相形式不同：液相层析和气相层析。
葡聚糖凝胶层析
葡聚糖凝胶层析一、实验目的1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。
二、实验原理凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。
对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。
分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。
一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。
这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
三、仪器、材料和试剂1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。
2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。
四、实验步骤1、装柱将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。
2、上样装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。
3、洗脱和收集打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。
4、样品的检测收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。
五、实验结果及分析1、实验结果：2、蛋白质样品洗脱曲线：收集样品时设置的时间为3min每管，收集得到每管的体积为1.4ml，则计算：流速=每管体积/每管时间=1.4/3=0.47ml/min。
实验6 凝胶层析法脱盐和分离蛋白质
实验6 凝胶层析法脱盐和分离蛋白质（一）原理凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。
脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。
前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。
所以，要根据具体情况选择使用。
前实验中样品体积较小，凝胶达滤后样品体积不会太增加，所以选用凝胶过滤法。
（二）试剂与器材（1）Sephadex G-25。
（2）0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液。
（3）奈氏（Nessler）试剂：于500ml锥形瓶内加入碘化钾150g，碘110g，汞150g及蒸馏水100ml。
用力振荡7～15min，至碘的棕色开始转变时，混合液温度升高，将此瓶浸于冷水内继续振荡，直到棕色的碘转变为带绿色的碘化钾汞液为止。
将上清液倾入2000ml量筒内，加蒸馏水至2000ml，混匀备用。
（4）20%（W/V）磺基水杨酸溶液。
（5）1.5cm×20cm层析柱。
（6）黑、白比色磁盘。
（三）操作（1）取层析柱1支（1.5cm×20cm），垂直固定在支架上，关闭下端出口。
将已经溶胀好的Sephadex G-25中的水倾倒出去，加入2倍体积的0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，并搅拌成悬浮液，然后灌注入柱，打开柱的下端出口，继续加入搅匀的Sephadex G-25，使凝胶自然沉降高度到17cm左右，关闭出口。
待凝胶柱形成后，在洗脱瓶中加入0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液以3倍柱体积的磷酸盐缓冲流过凝胶柱，以平衡凝胶。
（2）凝胶平衡后，用皮头滴管除去凝胶柱面的溶液，将盐析所得全部IgG样品加到凝胶柱表面，打开柱下口，控制流速让IgG样品溶液慢慢浸入凝胶内。
凝胶柱面上加一层的0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，并用此缓冲液洗脱，控制流速为0.5ml/min左右。
凝胶层析脱盐实验报告
一、实验目的1. 了解凝胶层析法的原理及操作步骤。
2. 掌握凝胶层析脱盐实验的基本操作，学会使用凝胶层析柱进行蛋白质的脱盐纯化。
3. 通过实验验证凝胶层析法在脱盐过程中的效果。
二、实验原理凝胶层析法是一种利用凝胶的分子筛作用，将混合物中的组分按分子大小进行分离的方法。
凝胶层析脱盐实验主要是通过凝胶的分子筛作用，将含有盐的蛋白质溶液中的盐分与蛋白质分离，从而达到脱盐的目的。
三、实验材料与仪器1. 材料：- 凝胶层析柱（1.5cm×20cm）- Sephadex G-25凝胶- 0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液- 样品（含盐蛋白质溶液）2. 仪器：- 电子天平- 移液器- 烧杯- 漏斗- 铁架台- 铅笔四、实验步骤1. 准备凝胶层析柱：- 将凝胶层析柱垂直固定在支架上，关闭下端出口。
- 将Sephadex G-25凝胶用0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液充分溶胀，然后倾倒至层析柱中，使其自然沉淀至柱底。
2. 准备样品：- 用移液器准确吸取一定量的含盐蛋白质溶液，加入适量的0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液进行稀释，使其浓度适宜。
3. 加样：- 将准备好的样品沿层析柱的上端缓慢加入，注意不要扰动凝胶层。
4. 层析：- 打开层析柱下端出口，用0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集洗脱液。
5. 收集与鉴定：- 收集洗脱液，观察洗脱液的颜色变化，判断脱盐效果。
- 取一定量的洗脱液进行SDS-PAGE电泳分析，观察蛋白质的迁移情况，进一步验证脱盐效果。
五、实验结果与分析1. 观察洗脱液的颜色变化：- 在凝胶层析脱盐实验过程中，随着洗脱液的收集，洗脱液的颜色逐渐变浅，说明盐分逐渐被洗脱。
2. SDS-PAGE电泳分析：- 通过SDS-PAGE电泳分析，观察蛋白质的迁移情况，发现脱盐后的蛋白质样品中，目标蛋白质的条带明显，说明脱盐效果良好。
六、实验结论通过凝胶层析脱盐实验，我们成功地将含盐蛋白质溶液中的盐分与蛋白质分离，实现了脱盐的目的。
sephadex-g-25凝胶层析
sephadex-g-25凝胶层析
Sephadex-G-25是一种分子筛分离剂，被广泛应用于生物分离、纯化和分析中。
它由交联的单元（2-hydroxyethyl）-丙烯酸酯（HEAE）构成，具有孔径大小为13 Å的特定结构，可选择性地分离分子量在1000至7000道尔顿之间的物质。
Sephadex-G-25凝胶层析是分离生物大分子（如蛋白质、核酸）的一种重要方法。
该方法利用了Sephadex-G-25凝胶的孔径大小，故可以实现不同分子量的物质的分离和纯化。
该方法可以在条件温和的情况下进行，避免了大分子的变性和失活。
因此，
Sephadex-G-25凝胶层析在生物学和生物化学领域中的应用非常广泛。
1.样品的制备
需要分离和纯化的生物大分子（如蛋白质或核酸）需要经过前处理，如酶解、离心或去除阻碍分离的物质。
在将样品注入凝胶柱之前，需要对Sephadex-G-25凝胶进行活化。
具体步骤为应用蒸馏水对凝胶进行输液和振荡，并将其放置一段时间，然后将缩水乙醇注入凝胶中，以交换和去除凝胶中的余量乙醇。
3.注入样品
4.洗涤
通过向凝胶柱中加入洗液（如缓冲液）来去除未结合的样品和其他杂质。
5.洗提
6.收集
最后，将纯化的样品收集起来，以便进一步的研究和应用。
总之，Sephadex-G-25凝胶层析是一种简单、快速、有效且具有选择性的生物分离方法，被广泛用于生物大分子的分离和纯化。
Sephadex G-25凝胶层析说课材料
层析柱的预备 ↓
装柱 ↓
平衡 ↓
加样与洗脱 ↓
实验操作
（1）凝胶处理。将Sephadex G-25凝胶干粉放入过量水 中
浸泡24h或沸水水浴2h。浸泡后，搅动凝胶在静置，待 凝胶
沉积后，倾去上层细粒悬液，如此反复多次。
（2）层析柱的预备。用清洗剂将层析柱仔细清洗干净。 固
定好层析柱各处的接口，用水检查层析柱各处的接口密 封性。
将清洗后的层析柱垂直固定在铁架台上。自柱底端出口 的聚
乙烯管内注入溶液以除去柱管内和尼龙网底部的气泡， 待气
泡排出后，使溶液在底部留至3 ~5cm高即关闭出水口。
（4）平衡。装好后，使层析床稳定5~10min，然后接上高位 贮液瓶，打开出口活塞，调节高位贮液瓶的高度，控制流速 为1mL/min。用2倍于床体积的洗脱液进行平衡，使层析床稳 定。 （5）加样与洗脱。打开平衡好的层析柱底端出口，使柱内 溶液流至与床表面相切时关闭出口。将吸有0.5mL样品的加 样滴管在床表面上1mm处沿管内壁轻轻转动加样，加完后， 打开底端出口使样品流至床表面，关闭出口，用少量洗脱液 小心清洗管内壁1~2次，使样品流至床表面，然后将洗脱液 加至距床表面2~3cm高，接上高位贮液瓶并调好流速即开始 洗脱。 （6）收集与测定。收集时可用自动部分收集器或手工操作， 每管接洗脱液3mL，直至第二个洗脱峰降至基线附近。收集 后用721E型分光光度计在451nm波长处以洗脱液为空白，对 每管收集液进行光吸收测定。以收集管数为横坐标，吸光度
脱过程中，混合物样品流经凝胶柱，大分子物质因 其直
径大于凝胶网孔的孔径，不能进入凝胶颗粒内部， 只能
沿着凝胶颗粒的空隙随溶剂流动，流程短而移动速 度快，
先流出层析柱；小分子组分由于其分子同混合物上柱； 2 洗脱开始，小分子扩散进人凝胶 颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3 大小分子分开： 4大分子行程 较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中
实验三 凝胶层析法脱盐和分离蛋白质(0806)
实验三Sephadex G-25凝胶层析法脱盐和离子交换柱层析分离菠萝蛋白酶一、Sephadex G-25凝胶层析法脱盐（一）目的和要求掌握凝胶层析法的原理及操作技术。
（二）原理凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。
脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。
前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。
凝胶过滤（gel filtration），又称为凝胶层析（gel chromatography）、分子筛过滤（molecular sieve filtration）、凝胶渗透层析（gel osmotic chromatography）等。
它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。
其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。
凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。
网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。
人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。
凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。
分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。
这样被分离物质即被按分子的大小分开。
用Sephadex+G-25+凝胶过滤层析脱盐和缓冲液置换应用报告
产品资料
图 8. 用Sephadex G-25填装INdEX柱的示意图。
1. INdEX/Sephadex G-25 使用 6 mm 手动生产用脱盐系统请向安玛西亚公司各办事处查询——
香港：(852) 2811 7575；北京：(010) 8838 5742；上海：(021) 6445 5290；广州：(020) 8732 0255。
图 6. Sephadex G-25 SF从标记了 125I的胰岛素中去除胰岛素 和氯氨T。
2. L生化制剂样品: 用Sephadex G-25 (超细) 填充的BPG 450柱纯化植物中抽提的过敏源，去除低分子量杂质(7)。 柱体积 25 L，样品体积可高达24% 柱体积。流速66 cm / hr。柱床高 15 cm，循环时间很短，仅 17 分钟；样品 稀释仅 1.4 倍。以上两个例子可见用 Sephadex G-25 脱 盐，短层析柱一样能达到很好的效果，并可缩短生产 周期，增加产量。
表 1. 用Sephadex G-25大规模脱盐的例子
柱尺寸
粒度
(长×内径，厘米)
应用
上样 (%) 一次操作 参考文献 时间 (分)
15×45
超细 过敏源抽提物中等纯化
24
17
7
60×40
粗
杂交细胞培养物上清
20
54
11
100×40
粗
白蛋白脱盐
25
27
9
60×60
粗
血浆蛋白t脱盐
15
20
12
100×180
1. 300 ml重组蛋白样品: 酒精酵母表达的重组过氧化物歧 化酶 (rhSOD) 用 1.1 L Sephadex G-25 (超细) 在十厘米 内径的BPG 100柱中进行初步下游纯化,去除了影响下 一步层析的低分子量杂质 (7)。样品体积达 300 ml (即 27% 柱体积)，流速 60 cm / hr，一个周期 30 分钟，样 品稀释 1.2 倍。再用阴离子交换层析和凝胶过滤层析纯 化至 99% 纯度。用自动层析系统循环工作，16 小时可
凝胶过滤层析实验步骤
凝胶过滤层析实验步骤
凝胶过滤层析实验步骤：
①选取合适粒径交联度的凝胶介质如Sephadex G-25根据分子量范围决定；
②准备柱子前需用大量蒸馏水浸泡凝胶颗粒直至完全膨胀恢复活性；
②装柱时缓缓倾倒凝胶悬浮液沿柱壁旋转使之内层密实无明显气泡夹杂；
④平衡过程中用磷酸盐缓冲液PBS以恒定流速洗涤直至流出液pH值稳定；
⑤样品制备时需离心去除沉淀溶解于少量缓冲液中保证浓度适中；
⑥上样后立即开启蠕动泵控制流速让样品均匀分布避免形成沟道效应；
⑦收集各个分数时预先准备好试管架编号记录每管对应体积位置；
⑧检测分子量分布可通过紫外检测器或其他合适手段监测洗脱峰；
⑨对于感兴趣峰段合并浓缩后可通过SDS-PAGE电泳进一步验证纯度；
⑩实验结束后拆卸清洗层析柱防止残留物质影响下次使用效果；
⑪根据实验目的选择合适分子筛范围重复上述过程直至达到分离目标；
⑫数据分析时注意计算保留时间体积并与标准曲线对比确定各组分分子量。
用Sephadex+G-25+凝胶过滤层析脱盐和缓冲液置换应用报告
应用报告
凝胶过滤 (或称分子筛) 层析是一种由限制分子通过多孔 基质，按分子大小分离混合分子的技术 (1,2)。一般生物大 分子的分子量比盐等小分子大许多倍，用凝胶过滤方法为 生物产品脱盐十分简单、可靠 (3)。由于层析方法可透过紫 外和电导检测器监控整个层析脱盐的过程、产品的纯度和 回收率，又可以连续自动进样和收集，自动化程度高，容 易放大 (4)。所以，从 60 年代初开始，随着层析介质技术的 不断发展，Sephadex G-25 系列凝胶过滤介质被越来越多 地用于从实验室到工业规模的脱盐、小分子去除及缓冲液 置换 。 (8-10)
HiTrap 脱盐和 Sephadex G-25 其它实验室常规工作应用 (6) 1. 亲合层析洗脱液中所含的在紫外有强烈吸收的小分子会
干扰往后的检测工作。如组氨酸融合蛋白，需用咪唑从 螯合了镍离子的层析介质上洗脱，Sephadex G-25 可以 将咪唑去除。 2. 在生物分子偶联反应中去除小分子反应副产物。 3. 终止酶反应，去除小分子辅助因子、抑制剂等。 4. 从标记生物分子中去除游离的同位素标记，如 125I, Chloramine T (见图6) 5. 在进行阴离子交换层析前，从培养基中去除苯酚红。
图 6. Sephadex G-25 SF从标记了 125I的胰岛素中去除胰岛素 和氯氨T。
2. 6 L生化制剂样品: 用Sephadex G-25 (超细) 填充的BPG 450柱纯化植物中抽提的过敏源，去除低分子量杂质(7)。 柱体积 25 L，样品体积可高达24% 柱体积。流速66 cm / hr。柱床高 15 cm，循环时间很短，仅 17 分钟；样品 稀释仅 1.4 倍。以上两个例子可见用 Sephadex G-25 脱 盐，短层析柱一样能达到很好的效果，并可缩短生产 周期，增加产量。
Sephadex G-25 凝胶过滤层析脱盐技术
ห้องสมุดไป่ตู้实验试剂
1. 0.01mol/L,pH8.6 Tris-HCl缓冲液
2. 蛋白质样品溶液（含Nacl)
实验材料及仪器
微孔滤膜（0.22μ m)、 一次性滤器 、 注射进样器、AKTAprime蛋白质纯化系统、HiTrap Desalting prepacked column (26mL)（Pharmacia, GE Healthcare)
凝胶过滤层析其它应用。1、用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。2、测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的的分子量。3、高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液。
凝胶过滤层析脱盐。高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25％-30％。
部分收集器
实验原理
凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下来速度慢，而大分子物质却被排除在外部，下来的速度快，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
葡聚糖凝胶G-25的使用方法
葡聚糖凝胶柱的使用方法：(1) 预处理称取Sephadex G-25（50－100目）约5g，加入蒸馏水100ml，置室温下3h进行溶胀。
(2) 装柱凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。
柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。
然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。
同时大开下口慢速流出蒸馏水。
装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。
否则，必须到出重装，装好后，用蒸馏水平衡2－3h即可加样品分离。
(3) 加样加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐（或留一极薄液层）为止。
然后，由柱的上端加水解液2ml，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2－3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。
(4) 洗脱与收集洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。
本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8－1.0ml/min。
洗脱液的收集采用分管连续顺序收集，每管收集3ml，共收集10管。
据经验，4或5号管核苷酸浓度最大，可作为层析鉴定的样品液。
但因层析柱长度的差异，管号会有变化，必要时可用紫外检测A260nm，找出浓度最大的管号。
(5) 凝胶的再生和回收凝胶柱使用一次后，必须反冲疏松一次，平衡后再使用。
若使用数次，就需要再生处理。
用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。
若实验完毕，将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干，再用95%乙醇洗两次，在60℃烘箱中烘干，回收保存。
实验五. 葡聚糖凝胶层析【实验目的】1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。
2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。
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（4）平衡。装好后，使层析床稳定5~10min，然后接上高位 贮液瓶，打开出口活塞，调节高位贮液瓶的高度，控制流速 为1mL/min。用2倍于床体积的洗脱液进行平衡，使层析床稳 定。 （5）加样与洗脱。打开平衡好的层析柱底端出口，使柱内 溶液流至与床表面相切时关闭出口。将吸有0.5mL样品的加 样滴管在床表面上1mm处沿管内壁轻轻转动加样，加完后， 打开底端出口使样品流至床表面，关闭出口，用少量洗脱液 小心清洗管内壁1~2次，使样品流至床表面，然后将洗脱液 加至距床表面2~3cm高，接上高位贮液瓶并调好流速即开始 洗脱。 （6）收集与测定。收集时可用自动部分收集器或手工操作， 每管接洗脱液3mL，直至第二个洗脱峰降至基线附近。收集 后用721E型分光光度计在451nm波长处以洗脱液为空白，对 每管收集液进行光吸收测定。以收集管数为横坐标，吸光度
实验原理
凝胶层析柱中装填着许多直径小于1mm的凝胶颗 粒，
颗粒内部不是实心的，而是呈三维多孔网状结构。 在洗
脱过程中，混合物样品流经凝胶柱，大分子物质因 其直
径大于凝胶网孔的孔径，不能进入凝胶颗粒内部， 只能
沿着凝胶颗粒的空隙随溶剂流动，流程短而移动速 度快，
先流出层析柱；小分子组分由于其分子直径小于网
（1）葡聚糖凝胶Sephadex G-25 （2）血红蛋白与核黄素的混合液 （3） 洗脱液：0.05mol /L磷酸缓冲液 （pH=7.3）或生理盐水
操作流程
凝胶处理 ↓
层析柱的预备 ↓
装柱 ↓
平衡 ↓
加样与洗脱 ↓
实验操作
（1）凝胶处理。将Sephadex G-25凝胶干粉放入过量水 中
浸泡24h或沸水水浴2h。浸泡后，搅动凝胶在静置，待 凝胶
Sephadex G-2析的原理 （2）掌握柱层析的基本装置 （3）熟悉凝胶层析的操作过程
常用的层析方法：凝胶层析、离子交换层 析、亲和层析、吸附层析、分配层析。
本次试验用的是凝胶层析，凝胶层析的固 定相是凝胶颗粒，流动相是单一缓冲液或盐 溶液，利用的是混合物中各种成分大小不同 这种原理特性来分离混合物。
思考题
（1）说明凝胶层析的原理 （2）层析柱中的“纹路” 、气泡和凹凸不平 的床表面对层析效果有何影响？ （3）连接高位贮液瓶与层析柱之间的U形导 管，有防止层析床液体流干的作用，说明其 原理。 （4）恒压贮液瓶为何能保证操作压的恒定？
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沉积后，倾去上层细粒悬液，如此反复多次。
（2）层析柱的预备。用清洗剂将层析柱仔细清洗干净。 固
定好层析柱各处的接口，用水检查层析柱各处的接口密 封性。
将清洗后的层析柱垂直固定在铁架台上。自柱底端出口 的聚
乙烯管内注入溶液以除去柱管内和尼龙网底部的气泡， 待气
泡排出后，使溶液在底部留至3 ~5cm高即关闭出水口。
原理示意图
l 分子大小不同混合物上柱； 2 洗脱开始，小分子扩散进人凝胶 颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3 大小分子分开： 4大分子行程 较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中
实验器材与试剂
（一）器材 1.2cm×40cm层析柱、1mL微量可调式移
液器、721E型分光光度计、恒压贮液瓶、 自动部分收集器 （二）试剂
注意事项
（1）各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，否 则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应无液体，并随 着柱下口溶液的流出不断有气泡产生，则表示恒压瓶不漏气。 操作过程中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏 气之处，应仔细检查并加以纠正。 （2）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝 胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液 体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。