第6章分子生物学研究法(下)
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➢ 转录组 广义上指在特定生理条件或环境下，一个 细胞、组织或生物体中转录出来的所有RNA的集 合，包括mRNA、rRNA、tRNA、sRNA。
➢ 狭义上特指细胞中转录出来的所有mRNA。 ➢ 通过特定生理条件下细胞内mRNA的丰度来描述
基因表达水平并外推到最终蛋白质产物的丰度， 是目前基因表达研究的基本思路。 ➢ 转录组研究的基本方法包括基因芯片技术和转录 组测序技术。
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3)转录组高通量测序(RNA-Seq) ➢ 原理：
✓所有的高通量测序技术都 能进行RNA测序。
✓ 对cDNA进行高通量测序， 以 获 得 来 不 同 mRNA 片 段 在特定样本中的含量。
✓各种类型的转录本都可以 进行高通量检测。
➢ 操作流程：
✓ 样品RNA准备 ✓ cDNA文库构建 ✓ DNA成簇扩增 ✓ 高通量测序 ✓ 数据分析
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1)表达序列标签测序(EST) ➢ 原理：
✓ EST是从一个随机选择的cDNA克隆进行5端和3端单 向一次测序获得的短的cDNA部分序列，代表一个完整 基 因 的 一 小 部 分 ， 在 数 据 库 中 其 长 度 一 般 从 20 到 7000bp不等，平均长度为360±120bp。
✓ EST 来 源 于 一 定 环 境 下 一 个 组 织 总 mRNA 所 构 建 的 cDNA文库，因此EST也能说明该组织中各基因的表达 水平。
➢ 目前，在基因序列中进行定点突变，主要采用两种 PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱变法。
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1)寡核苷酸定点突变 ➢ 原理：
✓ 合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，其中含有需要 改变的碱基，使其与带有目的基因的单链DNA配对。
✓ 合成的寡聚核苷酸引物除短的错配区外，与目的基因完 全互补。
✓ 用DNA聚合酶使寡聚核苷酸引物延伸，完成单链DNA的 复制。
定特定的DNA序列在染色体上的位置。
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➢ 原理：
✓ 利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性 或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体 上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分 子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色 体上的位置显示出来。
➢ 操作流程：
✓ 以经过标记的已知核酸分子为探针。 ✓ 以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子。 ✓ 在一定条件下使探针与靶核酸分子在原位发生杂交。 ✓ 再对其探测。
✓ 由此产生的双链DNA，一条链为野生型亲代链，另一条 为突变型子链。
✓ 将获得的双链分子通过转导导入宿主细胞，并筛选出突 变体，其中基因已被定向修改。
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➢操作流程：
✓合成一段含有需要改变碱基的寡聚核苷酸引物。 ✓ 构建含靶序列的单链重组 M13DNA。 ✓ 用DNA聚合酶延伸诱变寡 核苷酸引物，形成杂合双 链M13DNA。 ✓ 转染大肠杆菌，筛选携带 突变体克隆的M13噬菌斑。 ✓ 纯化突变体，序列序列分 析验证。
第6章分子生物学研究法(下)
第6章 分子生物学研究法(下)
——基因功能研究技术 6.1 基因表达研究技术 6.2 基因敲除技术 6.3 蛋白质及RNA相互作用技术 6.4 基因芯片及数据分析 6.5 利用酵母鉴定靶基因功能 6.6 其他分子生物学技术
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6.1 基因表达研究技术
6.1.1 转录组测序
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2)重叠延伸PCR诱变法 ➢ 原理：
✓ 对于两个具有部分重叠序列的DNA片段，在经过变性和 复性后，两个DNA片段之间通过同源序列形成部分杂合 的双链，在DNA聚合酶作用下，杂合双链可互为引物和 模板，引导DNA的合成，从而形成杂合DNA双链。
➢ 操作流程：
✓ 将DNA模板分别与引物对1和引物对2退火。 ✓ 通过PCR1和PCR2扩增出两种靶基因片段。 ✓ FMR2和RMF2片段在重叠区发生退火。 ✓ 用DNA聚合酶补平缺口，形成长链DNA，PCR3扩增。 ✓ 用引物F2和R2扩增出带有突变位点的全长DNA片段。
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6.1.3 原位杂交技术
➢ 原位杂交技术(ISH)是用标记的核酸探针，经放射 自显影或非放射检测体系，在组织，细胞、间期 核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的 一种手段。
➢ 原位杂交分为RNA原位杂交和染色体原位杂交。 ➢ RNA原位杂交 组织切片中，对特定基因的表达产
物(mRNA)在细胞水平上作出定性定量分析。 ➢ 染色体原位杂交也称为荧光原位杂交(FISH) 可确
➢ 操作流程：
✓ 以寡聚dT为引物反转录合成cDNA，用锚定酶酶切。 ✓ 将cDNA等分为A和B两部分，分别连接接头A或接头B。
每一种接头都含有标签酶酶切位点序列. ✓ 用标签酶酶切产生连有接头的短cDNA片段，混合并连接
两个cDNA池的短cDNA片段，构成双标签后，以引物A和 B扩增。 ✓ 用锚定酶切割扩增产物，抽提双标签片段并克隆、测序。 ✓ 对标签数据进行处理。
➢ 操作流程：
✓ 组 织 样 品 mRNA 的 提 取 → 逆 转 录 合 成 cDNA→ 构 建 cDNA文库→测序。
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2)基因表达系列分析(SAGE) ➢ 原理:
✓ SAGE是通过快速和详细分析成千上万个EST来寻找出表 达丰富度不同的SAGE标签序列。
✓ 通过限制性酶切可以产生非常短的cDNA标签，并通过 PCR扩增和连接，随后对连接体进行测序。
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6.1.2 RNA的选择性剪接技术
➢ RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个 mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。
➢ 选择性剪接可分为：平 衡剪切、5选择性剪切、 3选择性剪切、外显子 遗漏型剪切及相互排斥 型剪切。
➢ 常 用 RT-PCR 法 研 究 某 个基因是否存在选择性 剪切。
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6.1.4 基因定点突变技术
➢ 通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的 氨基酸序列，用于研究某个(些)氨基酸残基对蛋白 质结构、催化活性以及结合配体能力的影响。
➢ 基因定点突变也可用于改造DNA调控元件特征序列、 修饰表达载体、引入新的酶切位点等。
➢ 寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱基的寡聚 核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作用下启动DNA 分子进行复制。
➢ 狭义上特指细胞中转录出来的所有mRNA。 ➢ 通过特定生理条件下细胞内mRNA的丰度来描述
基因表达水平并外推到最终蛋白质产物的丰度， 是目前基因表达研究的基本思路。 ➢ 转录组研究的基本方法包括基因芯片技术和转录 组测序技术。
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3)转录组高通量测序(RNA-Seq) ➢ 原理：
✓所有的高通量测序技术都 能进行RNA测序。
✓ 对cDNA进行高通量测序， 以 获 得 来 不 同 mRNA 片 段 在特定样本中的含量。
✓各种类型的转录本都可以 进行高通量检测。
➢ 操作流程：
✓ 样品RNA准备 ✓ cDNA文库构建 ✓ DNA成簇扩增 ✓ 高通量测序 ✓ 数据分析
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1)表达序列标签测序(EST) ➢ 原理：
✓ EST是从一个随机选择的cDNA克隆进行5端和3端单 向一次测序获得的短的cDNA部分序列，代表一个完整 基 因 的 一 小 部 分 ， 在 数 据 库 中 其 长 度 一 般 从 20 到 7000bp不等，平均长度为360±120bp。
✓ EST 来 源 于 一 定 环 境 下 一 个 组 织 总 mRNA 所 构 建 的 cDNA文库，因此EST也能说明该组织中各基因的表达 水平。
➢ 目前，在基因序列中进行定点突变，主要采用两种 PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱变法。
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1)寡核苷酸定点突变 ➢ 原理：
✓ 合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，其中含有需要 改变的碱基，使其与带有目的基因的单链DNA配对。
✓ 合成的寡聚核苷酸引物除短的错配区外，与目的基因完 全互补。
✓ 用DNA聚合酶使寡聚核苷酸引物延伸，完成单链DNA的 复制。
定特定的DNA序列在染色体上的位置。
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➢ 原理：
✓ 利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性 或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体 上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分 子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色 体上的位置显示出来。
➢ 操作流程：
✓ 以经过标记的已知核酸分子为探针。 ✓ 以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子。 ✓ 在一定条件下使探针与靶核酸分子在原位发生杂交。 ✓ 再对其探测。
✓ 由此产生的双链DNA，一条链为野生型亲代链，另一条 为突变型子链。
✓ 将获得的双链分子通过转导导入宿主细胞，并筛选出突 变体，其中基因已被定向修改。
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➢操作流程：
✓合成一段含有需要改变碱基的寡聚核苷酸引物。 ✓ 构建含靶序列的单链重组 M13DNA。 ✓ 用DNA聚合酶延伸诱变寡 核苷酸引物，形成杂合双 链M13DNA。 ✓ 转染大肠杆菌，筛选携带 突变体克隆的M13噬菌斑。 ✓ 纯化突变体，序列序列分 析验证。
第6章分子生物学研究法(下)
第6章 分子生物学研究法(下)
——基因功能研究技术 6.1 基因表达研究技术 6.2 基因敲除技术 6.3 蛋白质及RNA相互作用技术 6.4 基因芯片及数据分析 6.5 利用酵母鉴定靶基因功能 6.6 其他分子生物学技术
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6.1 基因表达研究技术
6.1.1 转录组测序
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2)重叠延伸PCR诱变法 ➢ 原理：
✓ 对于两个具有部分重叠序列的DNA片段，在经过变性和 复性后，两个DNA片段之间通过同源序列形成部分杂合 的双链，在DNA聚合酶作用下，杂合双链可互为引物和 模板，引导DNA的合成，从而形成杂合DNA双链。
➢ 操作流程：
✓ 将DNA模板分别与引物对1和引物对2退火。 ✓ 通过PCR1和PCR2扩增出两种靶基因片段。 ✓ FMR2和RMF2片段在重叠区发生退火。 ✓ 用DNA聚合酶补平缺口，形成长链DNA，PCR3扩增。 ✓ 用引物F2和R2扩增出带有突变位点的全长DNA片段。
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6.1.3 原位杂交技术
➢ 原位杂交技术(ISH)是用标记的核酸探针，经放射 自显影或非放射检测体系，在组织，细胞、间期 核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的 一种手段。
➢ 原位杂交分为RNA原位杂交和染色体原位杂交。 ➢ RNA原位杂交 组织切片中，对特定基因的表达产
物(mRNA)在细胞水平上作出定性定量分析。 ➢ 染色体原位杂交也称为荧光原位杂交(FISH) 可确
➢ 操作流程：
✓ 以寡聚dT为引物反转录合成cDNA，用锚定酶酶切。 ✓ 将cDNA等分为A和B两部分，分别连接接头A或接头B。
每一种接头都含有标签酶酶切位点序列. ✓ 用标签酶酶切产生连有接头的短cDNA片段，混合并连接
两个cDNA池的短cDNA片段，构成双标签后，以引物A和 B扩增。 ✓ 用锚定酶切割扩增产物，抽提双标签片段并克隆、测序。 ✓ 对标签数据进行处理。
➢ 操作流程：
✓ 组 织 样 品 mRNA 的 提 取 → 逆 转 录 合 成 cDNA→ 构 建 cDNA文库→测序。
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2)基因表达系列分析(SAGE) ➢ 原理:
✓ SAGE是通过快速和详细分析成千上万个EST来寻找出表 达丰富度不同的SAGE标签序列。
✓ 通过限制性酶切可以产生非常短的cDNA标签，并通过 PCR扩增和连接，随后对连接体进行测序。
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6.1.2 RNA的选择性剪接技术
➢ RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个 mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。
➢ 选择性剪接可分为：平 衡剪切、5选择性剪切、 3选择性剪切、外显子 遗漏型剪切及相互排斥 型剪切。
➢ 常 用 RT-PCR 法 研 究 某 个基因是否存在选择性 剪切。
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6.1.4 基因定点突变技术
➢ 通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的 氨基酸序列，用于研究某个(些)氨基酸残基对蛋白 质结构、催化活性以及结合配体能力的影响。
➢ 基因定点突变也可用于改造DNA调控元件特征序列、 修饰表达载体、引入新的酶切位点等。
➢ 寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱基的寡聚 核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作用下启动DNA 分子进行复制。