实验三 等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点
蛋白质等电点测定实验报告
蛋白质等电点测定实验报告蛋白质等电点测定蛋白质等电点测定及性质实验一、目的：了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。
初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。
二、原理：固体颗粒在液体中为什么能够带电？当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液两相分别带有不同符号的电荷，由于电中性的要求，带电表面附近的液体中必有与固体表面电荷数量相等但符号相反的多余的反离子。
在界面上带电表面和反离子形成了双电层的结构。
在两种不同物质的界面上，正负电荷分别排列成的面层。
对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。
最早于1879年Helmholz提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chapman修正了平板型模型，提出了扩散双电层模型；后来Stern又提出了Stern模型。
根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用（例如范德华力）而和表面紧密结合，构成吸附层（或称紧密层、斯特恩层）。
其余的离子则扩散地分布在溶液中，构成双电层的扩散层（或称滑移面）。
由于带电表面的吸引作用，在扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。
离表面越远，过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。
紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体表面上。
其余反离子则构成扩散层。
滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。
滑动面至溶液本体间的电势差称为ζ电势。
固体颗粒带电量的大小及测量方式？ζ电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。
ζ电势的大小由Zeta电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高表明胶粒带电越多，扩散层越厚。
一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。
对于蛋白质分子来说：蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1～100微米。
等电聚焦电泳测定血清蛋白质等电点
等电聚焦电泳测定血清蛋白质等电点【实验原理】等电聚焦电泳是利用具有pH梯度的两性电解质为载体，分离等电点(pI)不同的蛋白质等两性分子的电泳技术。
在IEF电泳系统中，具有一个从阳极到阴极，pH值逐渐增大的连续而稳定的pH梯度，处于此系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI值与所处位点的pH值的差别带上正电或负电。
当蛋白质分子向相反电极移动的过程中，其逐渐靠近与其DI相同的pH位点，直至到达pH=pI，净电荷为零而停止移动，从而达到聚焦。
因此，将pI不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一段时间后，各组分会分别聚焦在各自pI相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。
根据电泳装置的不同，IEF可分为管型IEF和平板型IEF，本实验介绍管犁PAGE—IEF．【试剂与器材】1．凝胶贮备液称取丙烯酰胺(Acr)20g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0．8g，蒸馏水溶解后定容至100mL，过滤，将未溶物滤去，盛于棕色瓶中，4℃冰箱保存。
2．1％(V/V)TEMED溶液。
3．5g/L过硫酸铵称取过硫酸铵0．5g，溶于蒸馏水100mL，冰箱存放，每周新配。
4．40％两性电解质载体。
5．0．5mmol/L磷酸溶液量取85％磷酸16mL，加蒸馏水定容至500mL。
6．0．5mmol/L NaOH溶液称取NaOH10g，加蒸馏水溶解并定容至500mL。
7．1g/L考马斯亮蓝固定染色液称取考马斯亮蓝R250 lg，溶于含甲醇200mL、乙酸100mL和蒸馏水700mL的混合液中，过滤后备用。
8．酸性乙醇脱色液乙醇25份，蒸馏水25份，冰醋酸8份，混匀备用。
9．血清样本血清无须稀释，但最好透析去除离子。
10．电泳仪选用电子管或晶体管整流电源，电压0~600V，电流0~300mA。
11．电泳槽圆盘电泳槽及电泳玻管。
12．锥形瓶，250px长针头或腰椎穿刺针头，5mL或10mL注射器。
食品安全检测农药兽药残留土壤成分分析焦炭成分分析【操作步骤】1．凝胶制备取洁净干燥的电泳玻璃管2支，将管底用胶布封闭，垂直放置在电泳管架上。
测定蛋白质等电点：了解分析原理与实验方法的必备指南
测定蛋白质等电点：了解分析原理与实验方法的必备指南蛋白质是生物体内功能多样的重要分子，其性质与溶液中的pH值密切相关。
了解蛋白质的等电点对于理解其溶解性、稳定性和相互作用至关重要。
测定蛋白质的等电点可以帮助科学家们更好地理解蛋白质的特性，并在药物研发和生物工程等领域中发挥重要作用。
一、蛋白质等电点的原理。
蛋白质的电荷性质：蛋白质分子在不同pH值下带有正负电荷，这是由于其天然氨基酸残基上的带电基团。
等电点的定义：等电点是蛋白质溶液中净电荷为零的pH值，即带正电荷的氨基酸残基和带负电荷的氨基酸残基在该pH值下几乎相等。
二、测定蛋白质等电点的方法。
等电聚焦电泳（IEF）：利用电场将蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中分离，根据其在电场中迁移的速率确定等电点。
等电点电泳（IPG）：使用具有梯度pH值的聚丙烯酰胺凝胶，将蛋白质根据等电点在凝胶中定位。
pH梯度电泳：通过在凝胶中创建pH值梯度，使蛋白质在凝胶中以等电点静止。
三、蛋白质等电点分析的应用和局限性。
蛋白质溶解性和稳定性研究：等电点可以指导蛋白质的溶解条件和稳定性的优化。
蛋白质相互作用研究：等电点的差异可以用于研究蛋白质与其他分子的相互作用。
方法局限性：测定蛋白质等电点需要考虑样品纯度、离子强度和其他实验条件的影响。
测定蛋白质的等电点是研究蛋白质溶解性、稳定性和相互作用的重要手段。
了解蛋白质等电点的原理和常用方法对于科学家们理解蛋白质特性具有重要意义。
然而，我们也要认识到测定蛋白质等电点的方法存在一定的局限性，需要综合考虑实验条件和样品特性。
随着技术的不断发展，蛋白质等电点分析将为药物研发和生物工程等领域的进展提供更多的指导。
图1。
蛋白质等电点的测定
蛋白质等电点的测定蛋白质是生命体内构成最广泛的一类生物大分子，具有各种生物功能。
在生物体内，蛋白质具有正负电荷，并在不同PH值的溶液中表现出不同的电性质。
蛋白质在pH等于其等电点时，蛋白质的电荷处于中性状态，亦是纯蛋白质最稳定的情况，因此准确测定蛋白质等电点对于分离、纯化和鉴定蛋白质具有重要意义。
本文中将介绍三种测定蛋白质等电点的方法。
方法1. 等电点电泳法等电点电泳法是一种电泳分离方法，利用蛋白质在不同pH值下的电荷变化探测其等电点。
该方法的原理为将蛋白质经过电泳分离，直到电泳缓冲液pH等于蛋白质的等电点，此时蛋白质处于中性带中心。
与常规电泳仪不同的是，该仪器在酸性电极和碱性电极之间加入溶液，以确保酸碱缓冲系统能够维持所需的pH值。
等电点电泳法可以快速而准确地测定蛋白质等电点，但需要特殊仪器和耗时较长，且样品纯度较高。
方法2. 等电聚焦法等电聚焦法是一种电泳技术，利用在连续的pH梯度中，使具有等电点的蛋白质依次停止迁移，从而分离蛋白质。
该方法的原理是，利用蛋白质在不同pH值下的等电点特性，将样品置于pH梯度中，通过电压控制，使蛋白质在等电点处停止迁移，从而实现蛋白质分离。
等电聚焦法具有高分辨率和高分离效率，同时还可以同时分离出等电点相似但分子量不同的蛋白质，但样品量较小，需要特殊仪器和大量控制。
方法3. pH梯度管柱法pH梯度管柱法是一种可溶性蛋白质的标准测定方法，也是等电点法中最广泛应用的方法之一。
该方法的基本原理是，在含有不同pH值的缓冲液梯度的柱子上，蛋白质会在不同的pH值时呈现出不同的电荷状态。
在pH值等于其等电点时，蛋白质处于中性状态，停止迁移。
通过检测蛋白质在不同pH值下的吸收值，可以确定样品的等电点。
pH梯度管柱法的优点包括样品量较大，操作简单，数据可靠，但分辨率较低，需要特殊的柱子。
三种测定蛋白质等电点的方法各有侧重，实验操作难度大小也不同，一般来说，选择合适的测定方法应根据样品特点和实验条件。
等电点常用的检测方法
等电点常用的检测方法等电点是指溶液中离子总电荷为零时的pH值。
在生化学中，等电点的测定十分重要，可用于分离、检测和鉴定蛋白质等生物分子。
以下是关于等电点常用的10种检测方法的详细描述：1. 等电聚焦法等电聚焦法是一种基于电荷的分离技术，通过将带有不同电荷的生物分子置于电解质溶液中，利用电场分离它们。
该方法可以分离具有相似分子量和电荷的蛋白质，特别是针对等电点非常接近的蛋白质。
等电聚焦法结合其他技术，例如凝胶电泳、Western blot等，可用于确定蛋白质的丰度、结构和功能。
2. 弱离子交换层析法弱离子交换层析法是一种高效的蛋白质分离方法，该方法通过在弱酸或弱碱柱上吸附蛋白质，并根据其等电点的差异进行分离。
当蛋白质在强酸或强碱的pH值下具有相同的电荷时，会发生共存，并不会被分离。
弱离子交换层析法适用于寻找等电点相近的蛋白质分离。
3. 等电聚丙烯酰胺凝胶电泳法等电聚丙烯酰胺凝胶电泳法是将蛋白质样品置于凝胶上，然后通过改变凝胶pH的缓冲溶液来移动蛋白质并分离它们。
该方法利用凝胶pH等离子体电位变化来使蛋白质在凝胶中停止运动，从而将等离子体电位与蛋白质标记等电点pI相等。
由于该方法可以使用同一pH缓冲溶液进行多次聚焦，因此该方法的等电点分离效果比其他方法更加理想。
4. 细胞凝胶电泳法细胞凝胶电泳法是利用细胞的膜电位和pH等离子体电位差异分离细胞。
该方法可用于分离具有不同等电点的细胞，并且可以通过改变pH缓冲溶液的pH值来使分离更具特异性。
5. pH梯度制备法pH梯度制备法是一种制备带有不同pH的水溶液的方法，这些溶液可用于等电点分离、药物筛选、酶催化和蛋白质研究等领域。
该方法可以通过改变缓冲溶液的浓度和组成来控制pH梯度，以此选择性放大具有某些分子量或等电点的生物大分子。
6. 免疫层析法免疫层析法是以免疫反应为基础的方法，可以通过介导特异性抗体和抗原结合来分离目标生物分子。
该方法可以应用于从复杂混合物中纯化含有多种酶和受体的等离子体，其优点在于其针对性很高，可以选择性地分离几乎任何单一分子。
蛋白质两性性质及等电点的测定
蛋白质两性性质及等电点的测定蛋白质是生物体中极其重要的有机化合物，是构成生物体的基本组成部分之一。
蛋白质具有很多种类和功能，不同的蛋白质在生物体内发挥着不同的作用。
蛋白质的性质也因其结构而异，其中包括两性性质和等电点。
本文将介绍蛋白质的两性性质及等电点的测定。
一、蛋白质的两性性质蛋白质是由多肽链组成的，其分子中含有氨基酸残基。
这些氨基酸残基中的羧基（-COOH）和氨基（-NH2）可以参与酸碱反应，所以蛋白质具有两性性质，能够在不同的pH值下呈现不同的电离状态。
1. 在低pH值下，蛋白质中的羧基处于质子化状态，成为正电荷，而氨基则不受质子化，保持中性。
因此，在低pH值时，蛋白质呈正电荷状态，称为阳离子。
2. 在高pH值下，蛋白质中的氨基受到氢离子的质子化，成为正电荷，而羧基则不受质子化，保持中性。
因此，在高pH值时，蛋白质呈负电荷状态，称为阴离子。
3. 在等电点附近，蛋白质的质子化和去质子化同时发生，羧基和氨基的质子化程度相等，呈中性状态。
此时，蛋白质没有净电荷，称为等电点。
由于蛋白质的两性性质，可以影响其溶解性、折叠构象和相互作用等特性，对其功能和生物学作用具有重要影响。
二、蛋白质等电点的测定等电点是蛋白质具有中性状态的pH值。
测定蛋白质的等电点可以帮助我们了解其溶解性、电动力学性质和酸碱加工过程中的变化。
常用的测定等电点的方法有以下几种：1. pH梯度电泳法：这是一种常用且广泛应用的测定等电点的方法。
在一个pH梯度上进行电泳，当蛋白质离子迁移速率和电场力相等时，达到等电点。
可以通过在梯度上观察蛋白质带的形成和移动情况来确定等电点。
2. 等电聚焦电泳法：这是一种利用电场作用下蛋白质在凝胶上垂直移动的方法，根据蛋白质在凝胶中的移动速率和电场力相等时的pH值来测定等电点。
3. 等电点电位计法：该方法利用等电点时蛋白质没有净电荷的特性，使用电位计测量蛋白质在不同pH值下的电位变化，找出没有净电荷时的pH值，即为等电点。
蛋白质的等电点测定及性质实验
蛋白质的等电点测定及性质实验一、实验目的初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，并了解蛋白质的性质。
二、实验原理蛋白质分子是两性电解质，当调节溶液的酸碱度，使蛋白质分子上所带的正负电荷相等时，在电场中，该蛋白质分子既不向正极移动，也不向负极移动，这时溶液的pH值，就是该蛋白质的等电点（pI）。
不同蛋白质，等电点不同。
在等电点时，蛋白质溶解度最小，容易沉淀析出。
因此，可以借助在不同pH溶液中的某蛋白质的溶解度来测定该蛋白质的等电点。
在蛋白质溶液中加入一定浓度的中性盐，蛋白质即从溶液中沉淀析出，这种作用称为盐析。
盐析法常用的盐类有硫酸铵、硫酸钠等。
蛋白质的盐析作用是可逆过程。
由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解。
而重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。
三、试剂和器材⑴高筋面粉、低筋面粉。
⑵ 1mol/L醋酸。
（每组自配0.1mol/L醋酸、0.01mol/L醋酸）⑶ 0.5%酪蛋白溶液。
称取2.5克酪蛋白，放入烧杯中，加入40℃的蒸馏水，再加入50毫升1N 氢氧化钠溶液，微热搅拌直到蛋白质完全溶解为止。
将溶解好的蛋白溶液转到500毫升容量瓶中，并用少量蒸馏水洗净烧杯，一并倒入容量瓶。
在容量瓶中再加入1N醋酸溶液50毫升，摇匀，再加蒸馏水定容至500毫升，得到略显混浊的、在0.1N NaAc溶液中的酪蛋白溶液。
⑷鸡蛋白溶液。
将80mL鸡蛋清与800mL蒸馏水混合均匀后，用洁净的多层湿纱布垫在漏斗上过滤，滤液即为鸡蛋白溶液（不能有不溶性物悬浮）。
要现配现用，最好使用经过煮沸并封在容器中隔绝空气冷却的蒸馏水。
⑸质量分数为5%的CuSO4溶液。
（每排3组合配）⑹ (NH4)2SO4饱和溶液。
（确保有固体析出）⑺天平、水浴锅、移液管、试管等。
四、操作步骤1、蛋白质的等电点测定⑴取5支同种规格的试管，编号，按表1顺序精确加入各种试剂，特别注意0.5%酪蛋白溶液最后加入，然后逐一振荡试管，使试管混合均匀。
实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点
实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点一、实验目的了解等电聚焦的原理。
通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。
二、实验原理等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。
近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。
目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。
由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。
蛋白质分子是典型的两性电解质分子。
它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。
这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。
如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。
这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。
等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。
两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。
常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB公司生产的Ampholine 和Pharmalyte，价格昂贵。
国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。
两性电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。
等电点常用的检测方法
等电点常用的检测方法等电点是指在溶液或介质中，正负离子的浓度相等时的pH值。
在生物学研究中，等电点被广泛应用于蛋白质、细胞膜和DNA等生物大分子的研究中。
为了准确测定分子的等电点，科学家们开发了许多检测方法。
以下是一些常用的等电点检测方法。
1. 等电聚焦电泳法等电聚焦电泳法是一种基于电荷的分离技术，它使用特定的缓冲液体系和电场梯度，将混合的蛋白质在等电点处停留并分离。
这种方法通常用于检测蛋白质的等电点，其优点是操作简单、分离效果好、分离时间短。
2. 等电点电位仪法等电点电位仪法是一种基于电位的检测方法，它利用电位计测量溶液中蛋白质的等电点。
这种方法适用于检测高分子的等电点，如DNA和RNA等，它的优点是精度高、可靠性好。
3. 等电点扫描仪法等电点扫描仪法是一种基于光学的检测方法，它使用可见光和紫外线光谱技术，测量溶液中分子的吸收率和发射率，以确定分子的等电点。
这种方法适用于检测各种高分子的等电点，如蛋白质、DNA 和RNA等，其优点是准确度高、分析速度快。
4. 等电点显色法等电点显色法是一种基于化学反应的检测方法，它利用荧光染料和酸碱指示剂的颜色变化来测定分子的等电点。
这种方法适用于检测各种高分子的等电点，如蛋白质、DNA和RNA等，其优点是灵敏度高、测定精度高。
5. 等电点测定仪法等电点测定仪法是一种基于电泳和电学检测的方法，它利用电场和电荷的作用，将混合的分子在等电点处分离并检测。
这种方法适用于检测各种高分子的等电点，如蛋白质、DNA和RNA等，其优点是测定精度高、分离效果好。
以上这些方法都是常用的等电点检测方法，在生物学研究中都有广泛的应用。
不同的方法各有优缺点，选择适合自己研究的方法进行等电点检测，对于研究结果的准确性和科学价值都有着重要的意义。
实验报告等电点聚焦测蛋白质等电点
实验报告等电点聚焦测蛋白质等电点引言：蛋白质是生物体中一类重要的生物大分子，它们的功能和性质与其结构密切相关。
等电点是指蛋白质在溶液中存在时呈电荷中性的pH值。
当蛋白质的溶液中pH等于它的等电点时，蛋白质的正电荷和负电荷相等，从而净电荷为0。
等电点测定是一种常用的方法，用于确定蛋白质的等电点。
实验目的：1.掌握等电点聚焦技术的原理和操作方法。
2.利用等电点聚焦技术测定其中一种蛋白质的等电点。
材料与方法：1.实验仪器：等电点聚焦仪。
2.实验试剂：蛋白质样品、等电点聚焦凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、溶液缓冲液等。
3.样品制备：取适量的蛋白质样品，加入等电点样品溶液缓冲液，使其浓度适当。
4.等电点聚焦凝胶制备：根据实验需要，选择适当的pH梯度，制备等电点聚焦凝胶。
5.实验操作：将已制备好的等电点聚焦凝胶放置于等电点聚焦仪中，按照仪器操作说明进行调试和操作。
将样品加载到凝胶上，通过电场力使其在凝胶中聚焦移动，最终形成pH梯度。
根据蛋白质的等电点，蛋白质在凝胶中会聚焦在对应的位置。
6.凝胶分离与染色：等电点聚焦结束后，取出凝胶，根据需要进行分离和染色。
结果与讨论：等电点聚焦技术是一种高效、准确的测定蛋白质等电点的方法。
它利用电场力将蛋白质在凝胶中聚焦，根据蛋白质在不同pH条件下的电荷变化，最终确定其等电点。
该方法操作简便、结果可靠，适用于各类蛋白质的等电点测定。
结论：本实验利用等电点聚焦技术成功地测定了一种蛋白质的等电点，并通过凝胶分离和染色展示了等电点聚焦的结果。
等电点聚焦技术在蛋白质等电点测定中具有重要的应用价值，可以为蛋白质结构和功能的研究提供重要的参考。
[1]赵海洋.蛋白质等电点聚焦技术[J].广西科技大学学报，2024[2]张桂泉,王运青,刘晓东.蛋白质等电点聚焦的实验教学及质量考察[J].高等教育化学研究，2024。
等电聚焦实验报告
1. 了解等电聚焦电泳（IEF）的基本原理和操作步骤。
2. 学习利用等电聚焦电泳技术测定蛋白质的等电点（pI）。
3. 掌握实验操作技能，提高实验动手能力。
二、实验原理等电聚焦电泳（IEF）是一种利用pH梯度介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。
其基本原理是在一个具有pH梯度的介质中，蛋白质分子根据其等电点在电场作用下向相应pH位置移动，直至聚焦于该位置。
蛋白质分子是两性电解质，其等电点（pI）是指蛋白质分子在溶液中呈电中性时的pH值。
在pH低于蛋白质的pI时，蛋白质分子带正电荷；在pH高于蛋白质的pI 时，蛋白质分子带负电荷。
在等电聚焦电泳过程中，当蛋白质分子移动到与其pI相等的pH位置时，其净电荷为零，停止移动，从而实现蛋白质的分离和聚焦。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：毛细管电泳仪、恒温水浴、pH计、移液器、超纯水系统等。
2. 试剂：蛋白质样品、两性电解质载体、尿素、磷酸、氢氧化钠、乙酸等。
四、实验步骤1. 准备样品：取适量蛋白质样品，加入适量两性电解质载体，制成蛋白质溶液。
2. 制备pH梯度：根据蛋白质的pI值，配制相应的pH梯度介质，置于毛细管中。
3. 样品上样：将制备好的蛋白质溶液加入毛细管中，注意避免气泡产生。
4. 设置参数：根据仪器要求，设置电泳电压、温度、时间等参数。
5. 运行实验：开启毛细管电泳仪，开始电泳实验。
6. 数据采集：实验结束后，采集数据，分析蛋白质的等电点。
五、结果与分析1. 根据实验数据，绘制蛋白质的迁移曲线，分析其等电点。
2. 与理论值进行比较，评估实验结果的准确性。
1. 等电聚焦电泳是一种有效的蛋白质分离和鉴定技术，具有分辨率高、操作简便等优点。
2. 通过本次实验，掌握了等电聚焦电泳的操作步骤，提高了实验动手能力。
3. 在实验过程中，需要注意以下几点：a. 精确配制pH梯度介质，确保pH梯度均匀。
b. 避免气泡产生，影响实验结果。
c. 严格控制实验参数，确保实验结果的准确性。
蛋白质等电点测定实验报告
蛋白质等电点测定实验报告一、实验目的。
本实验旨在通过等电点测定方法，确定蛋白质在不同 pH 条件下的等电点，并了解蛋白质在等电点时的电荷状态，为进一步研究蛋白质的性质和功能提供实验数据。
二、实验原理。
蛋白质的等电点是指在特定 pH 条件下，蛋白质带有的正负电荷相互抵消，呈电中性的状态。
当 pH 值等于蛋白质的等电点时，蛋白质呈等电点状态。
在等电点附近，蛋白质的电荷状态发生变化，可通过等电点电泳或等电点测定方法进行测定。
三、实验步骤。
1. 制备蛋白质溶液，取一定量的蛋白质样品，溶解于不同 pH 值的缓冲液中，制备不同 pH 条件下的蛋白质溶液。
2. 进行等电点电泳，将制备好的蛋白质溶液加载到等电点电泳仪中，根据蛋白质的等电点进行电泳分离。
3. 测定蛋白质的等电点，根据电泳结果，确定蛋白质在不同 pH 条件下的等电点。
四、实验结果与分析。
通过实验测定，得到了蛋白质在不同pH 条件下的等电点数据。
根据实验结果，可以得出蛋白质在等电点附近呈电中性状态，电泳图上呈现水平移动的状态。
在等电点附近，蛋白质的电荷状态发生变化，呈现出不同的电泳迁移率。
实验结果表明，蛋白质在不同 pH 条件下具有不同的电荷状态，进一步说明了蛋白质的电荷性质与pH 值的关系。
五、实验总结。
通过本次实验，我们成功地测定了蛋白质在不同 pH 条件下的等电点，并了解了蛋白质在等电点时的电荷状态。
这些数据为我们进一步研究蛋白质的性质和功能提供了重要的实验基础。
同时，实验过程中也发现了一些问题，例如在制备蛋白质溶液时需注意 pH 值的准确性，以及在等电点电泳过程中需要控制好电泳条件，以确保实验结果的准确性。
综上所述，蛋白质等电点测定实验为我们深入了解蛋白质的电荷性质提供了重要的实验数据，为进一步研究蛋白质的性质和功能奠定了基础。
希望通过本次实验，能够对蛋白质等电点测定方法有更深入的了解，为相关领域的研究工作提供有益的参考。
检测蛋白质等电点的方法
检测蛋白质等电点的方法
以下是 8 条关于检测蛋白质等电点的方法：
1. 电泳法呀，哇哦，就像让蛋白质们来一场赛跑！比如在凝胶上，不同的蛋白质会根据它们的电荷特性以不同速度前进，是不是很神奇呀？
2. 盐析法呢，就好像把蛋白质放在一个特殊的“筛子”里，随着盐浓度的变化，能看出它们的沉淀情况，这可是个很妙的方法哟！比如说鸡蛋清遇到盐会发生的变化。
3. 等电聚焦法，嘿，想象一下蛋白质顺着电势梯度找到自己的“专属位置”，多有意思呀！像在专门为它们打造的小天地里各就各位。
4. pH 滴定法，这就像是精确地调整酸碱度来引出蛋白质的神秘反应呀！比如慢慢地滴加酸碱看看会发生什么。
5. 分光光度法，哇塞，通过光的变化来洞察蛋白质的秘密，多酷啊！就像是用光线当钥匙打开蛋白质秘密的大门。
6. 超滤法呢，也好有趣呀，把蛋白质和其他东西分离开，就像在一个大混合物里精准地捞出我们想要的，你说好玩不？就拿混合溶液来试试呀。
7. 离子交换层析法，嘿，这就如同让蛋白质在离子的世界里穿梭筛选，找出它们的归宿，是不是很特别呢！就像在一个离子构建的迷宫里探索。
8. 透析法，哇哦，让蛋白质在膜的两边来回穿梭，想想就很刺激呀！就如同让它们玩一场特殊的“穿越游戏”。
我觉得每一种方法都有其独特之处和魅力呀，关键是能帮助我们更好地了解蛋白质的性质呢！。
等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点
北京来亨科学仪器有限公司销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A1等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点一、实验原理蛋白质是两性电解质，当Ph>PI 时带负电荷，在电场作用下向正极移动；当PH<PI 时带正电荷，在电场作用下向负极移动；当pH＝PI 时净电荷为零，在电场作用下既不向正极也不向负极移动，此时Ph 就是该蛋白质的等电点。
各种PH 蛋白质的PI 不同，利用各种蛋白质PI 不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体，两性电解质载体在电场作用下，按各自PI 形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的PH 梯度。
北京来亨科学仪器有限公司销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A 2在电场作用下，蛋白质在此PH梯度凝胶中泳动，当迁移到PH值等于PI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带，这种分离蛋白质的方法称为聚丙烯酰胺等电聚焦电泳。
聚丙烯酰胺等电聚焦电泳操作简单，电泳时间短，分辨率高。
其应用范围广，可用于分离蛋白质及测定PI，也可用于临床鉴别诊断、农业、食品研究及动物分类等各种领域。
随着其他技术的不断改进，等电聚焦电泳也不断充实完善，从柱电泳发展到垂直板，又继而发展到超薄型水平板电泳等，还可与其他技术或SDS-PAGE结合，进一步提高灵敏度与分辨率。
二、实验用品（一）器材（1）垂直管电泳槽和玻管。
（2）恒压恒流电泳仪。
（3）酸度计（二）试剂（1）凝胶贮液：丙烯酰胺30g,甲叉双丙烯酰胺0.8g,加重蒸水使其溶解后定容至100ml，置棕色试剂瓶中，4℃贮存。
（2）10%TEMED:取10mlTEMED,加重蒸水至100ml,置棕色瓶内，4℃贮存。
（3）5%过硫酸胺：称AP1.0g,加重蒸水至10ml，当天配制。
（4）电极缓冲液。
5%磷酸溶液：量取58.8ml85%磷酸，定容至1000ml。
2%NaOH溶液：称20gNaOH，溶于蒸馏水并定容至1000ml。
北京来亨科学仪器有限公司销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A 3（5）两性电解质载体PH3~10。
等电聚焦电泳(IEF)分离蛋白及测定蛋白质等电点
一、原理等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是该分子的pI，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。
因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在pI处得以“聚焦”.二、仪器与试剂1．材料：蛋白样品2．试剂：聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP-40、teiton-100电极液：1M磷酸（阳极液）、1M氢氧化钠（阴极液）固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml染色液：0.35g考马斯亮蓝R－150溶于300ml脱色液中，加热到60－70℃，加入0.3g硫酸铜。
脱色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水样品缓冲液:1％Ampholine 、2％Triton X-100、9M尿素三、操作步骤：1, 样品制备：用IEF样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF样品缓冲液。
充分溶解后，离心去除不溶杂质。
2,制模具：洗干净两块IEF专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，两块玻璃板的硅化和反硅化面相对，放上夹条，夹子夹好。
3, 配胶：胶液组成：6ml胶母液（10％，19/1）6－8％尿素1ml Ampholine (pH3.5-10)60-80ul 10%AP5 ul TEMED4, 灌胶：配好的胶迅速灌入模具5, 电泳：等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。
在胶面两边各放一根浸透电极缓冲液的电极条。
实验报告等电点聚焦测蛋白质等电点
等电点聚焦测蛋白质等电点一．实验目的1.了解蛋白质的两性解离性质和等电点聚焦的原理；2. 学习测定蛋白质等电点的方法并掌握圆盘电泳技术。
二．实验原理等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，IEF实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是这种分子的pI。
聚焦在等电点的分子也会不断地扩散。
一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。
因此，这些分子总是处于不断地扩散和抗扩散的平衡之中，在pI处得以“聚焦”。
三．实验步骤1.凝胶制备按表1的比例配制4ml工作胶液，在真空干燥器中抽气10min。
每组4管，每管加胶液1.8ml。
混匀后立即注入到已准备好的凝胶管中，胶液加至离管顶部1cm处，在胶面上再覆盖3mm厚的水层，应注意不要让水破坏胶的表面，室温下放置20～30min即可聚合。
表1 凝胶工作液配比2.电泳吸去凝胶柱表面上的水层，将凝胶管垂直固定于圆盘电泳槽中。
于电泳槽下槽加入0.2％的500ml 硫酸作正极；上槽加入0.5％的800ml 乙醇胺作负极打开电源，将电压恒定为300V ，因为聚焦过程是电阻不断加大的过程，故聚焦电泳过程中，电流将不断下降，降至稳定时，即表明聚焦已完成，继续电泳约30min 后，停止电泳，全程约需3h 。
3.剥胶电泳结束后，取下凝胶管，用水洗去胶管两端的电极液，按照柱状电泳剥胶的方法取出胶条，以胶条的正极为“头”，负极为“尾”，正极端呈酸性，负极端呈碱性。
剥离后，量出并记录凝胶的长度。
4.固定取其中的凝胶条3根置于一个小培养皿内，倒入10%放在三氯乙酸固定液中固定，约半小时后，即可看到胶条内蛋白质的白色沉淀带。
蛋白质等电点测定实验报告
蛋白质等电点测定实验报告一、实验目的1、掌握蛋白质等电点的测定原理和方法。
2、加深对蛋白质两性解离性质的理解。
二、实验原理蛋白质是两性电解质，在溶液中会解离出带正电荷和带负电荷的离子。
当溶液的 pH 值达到某一特定值时，蛋白质所带的正电荷和负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的 pH 值即为该蛋白质的等电点（pI）。
在等电点时，蛋白质的溶解度最低，容易沉淀析出。
利用这一性质，可以通过调节溶液的 pH 值，使蛋白质沉淀，从而测定其等电点。
三、实验材料与设备1、材料酪蛋白2、试剂04mol/L 醋酸溶液01mol/L 醋酸溶液1mol/L 醋酸溶液01mol/L 氢氧化钠溶液3、设备酸度计离心机试管移液管四、实验步骤1、制备蛋白质溶液称取一定量的酪蛋白，用 01mol/L 氢氧化钠溶液溶解，配制成浓度为 1%的蛋白质溶液。
2、调节溶液 pH 值取 4 支试管，分别加入 4mL 上述蛋白质溶液。
向第一支试管中加入 04mol/L 醋酸溶液 1mL，摇匀后用酸度计测定溶液的 pH 值。
向第二支试管中加入 01mol/L 醋酸溶液 1mL，摇匀后测定 pH 值。
向第三支试管中加入 1mol/L 醋酸溶液 1mL，摇匀后测定 pH 值。
3、观察沉淀现象将上述试管静置 10 分钟，观察有无沉淀生成。
4、确定等电点出现沉淀的试管对应的 pH 值范围即为酪蛋白的等电点范围。
为了更精确地确定等电点，可在此范围内进一步细分 pH 值梯度，重复上述实验，直至找到沉淀最明显时对应的 pH 值，即为酪蛋白的等电点。
五、实验结果与分析实验结果记录如下表：｜试管编号|加入醋酸溶液浓度|加入醋酸溶液体积（mL）｜pH 值|沉淀现象|｜｜｜｜｜｜｜1|04mol/L|1|＿____|＿____|｜2|01mol/L|1|＿____|＿____|｜3|1mol/L|1|＿____|＿____|根据实验结果，分析得出酪蛋白的等电点范围为_____。
实验报告等电点聚焦测蛋白质等电点
等电点聚焦测蛋白质等电点一．实验目的1.了解蛋白质的两性解离性质和等电点聚焦的原理；2. 学习测定蛋白质等电点的方法并掌握圆盘电泳技术。
二．实验原理等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，IEF实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是这种分子的pI。
聚焦在等电点的分子也会不断地扩散。
一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。
因此，这些分子总是处于不断地扩散和抗扩散的平衡之中，在pI处得以“聚焦”。
三．实验步骤1.凝胶制备按表1的比例配制4ml工作胶液，在真空干燥器中抽气10min。
每组4管，每管加胶液1.8ml。
混匀后立即注入到已准备好的凝胶管中，胶液加至离管顶部1cm 处，在胶面上再覆盖3mm厚的水层，应注意不要让水破坏胶的表面，室温下放置20～30min即可聚合。
表1 凝胶工作液配比凝胶母液（丙烯酰胺30%：甲叉双丙烯1ml酰胺0.8%）10%过硫酸铵0.02ml水 2.68ml载体两性电解液0.15ml蛋白样品液0.1ml,0.05mlTEMED 0.02ml2.电泳吸去凝胶柱表面上的水层，将凝胶管垂直固定于圆盘电泳槽中。
于电泳槽下槽加入0.2％的500ml硫酸作正极；上槽加入0.5％的800ml乙醇胺作负极打开电源，将电压恒定为300V，因为聚焦过程是电阻不断加大的过程，故聚焦电泳过程中，电流将不断下降，降至稳定时，即表明聚焦已完成，继续电泳约30min后，停止电泳，全程约需3h。
3.剥胶电泳结束后，取下凝胶管，用水洗去胶管两端的电极液，按照柱状电泳剥胶的方法取出胶条，以胶条的正极为“头”，负极为“尾”，正极端呈酸性，负极端呈碱性。
实验三蛋白质等电点测定
• 1.
二、操作 蛋白质的盐析 不同浓度的盐析出不同的蛋 白质。如球蛋白可在半饱和 硫酸铵溶液中析出，而清蛋 白则在饱和硫酸铵溶液中析 出。 取一支试管：鸡蛋清液3ml+ 饱和硫酸铵液3ml，混匀后 静置数分钟，观察现象并记 录。然后倒出少量混浊液， 加少量水，沉淀是否溶解， 为什么？向管内添加硫酸铵 粉末到不再溶解为止，又有 何现象？加水，沉淀是否溶 解？记录并解释。
2. 不可逆沉淀反应 • 重金属离子沉淀蛋白质 取 1支试管，加鸡蛋清1ml+硝酸银 液1滴，观察现象并记录。加水， 沉淀溶解？解释。 • 有机酸沉淀蛋白质 取 1支试管，加鸡蛋清2ml+三氯乙 酸1ml，混匀，观察现象并记录。 加水，沉淀溶解？为什么？ • 乙醇引起的变性与沉淀 取 三支试管，编号。按表加入试剂。 混匀后，观察各管有何变化，记 录现象。放置片刻后，向各管中 加水8ml，然后在2、3号管中各 加1滴甲基红，再分别用0.1M的 醋酸和0.05M的碳酸钠中和。观 察各管颜色变化和沉淀的生成并 记录。每管再加0.1M的盐酸数滴， 有何现象发生？记录并解释全部 现象。
实验四
•
蛋白质的沉淀反应
一、原理 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成 为稳定的亲水胶体颗粒，具有胶体的所有性质。在一定的理化 因素影响下，蛋白质颗粒可因推动电荷和脱水而沉淀。 1. 可逆沉淀反应 蛋白质分子的结构没有发生变化，仅因为表面的水化层和双 电层遭到破坏而沉淀。如蛋白质的盐析作用和低温下乙醇的沉 淀作用。除去影响因素，蛋白质又可恢复天然性质。 2. 不可逆沉淀反应 影响因素除了破坏蛋白质的两外层之外，还使其内部结构发 生了改变，这种沉淀在除去影响因素也不能再溶解于原来的溶 剂中。蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在， 并不析出。如蛋白质的结絮作用。
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实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点一、实验目的了解等电聚焦的原理。
通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。
二、实验原理等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。
近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。
目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。
由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。
蛋白质分子是典型的两性电解质分子。
它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。
这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。
如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。
这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。
等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。
两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。
常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB公司生产的Ampholine 和Pharmalyte，价格昂贵。
国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。
两性电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。
若不同的pH值的两性电解质的含量与pI值的分布越均匀，则pH梯度的线性就越好。
对Ampholine两性电解质的要求是缓冲能力强，有良好的导电性，分子量要小，不干扰被分析的样品等。
在聚焦过程中和聚焦结束取消了外加电场后，如保持pH梯度的稳定是极为重要的。
为了防止扩散，稳定pH梯度，就必须加入一种抗对流和扩散的支持介质，最常用的这种支持介质就是聚丙烯酰胺凝胶。
当进行聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳时，凝胶柱内即产生pH梯度，当蛋白质样品电泳到凝胶柱内某一部位，而此部位的pH值正好等于该蛋白质的等电点时，该蛋白质即聚焦形成一条区带，只要测出此区带所处部位的pH值，即为其等电点。
电泳时间越长，蛋白质聚焦的区带就越集中，越狭窄，因而提高了分辨率。
这是等电聚焦的一大优点，不像一般的其他电泳，电泳时间过长则区带扩散。
所以等电聚焦电泳法不仅可以测定等电点，而且能将不同等电点的混合的生物大分子进行分184离和鉴定。
早期的等电聚焦电泳是垂直管式的，其特点是体系是封闭的，不与空气接触，可防止样品氧化。
近年来，又发展了超薄层水平板式等电聚焦电泳。
此法的优点是加样数量多，节省两性电解质，电泳后固定、染色、干燥都十分迅速简便，其最大优点是防止了电极液的电渗作用而引起正负两极pH梯度的漂变。
测定pH梯度的方法有四种：1. 将胶条切成小块，用水浸泡后，用精密pH试纸或进口的细长pH复合电极测定pH值，然后作图。
2. 用表面pH微电极直接测定胶条各部分的pH值，然后作图。
3. 用一套已知不同的pI值的蛋白质作为标准，测定pH梯度的标准曲线。
4. 将胶条于－70℃冰冻后切成1mm的薄片，加入0.5ml 0.01M KCl，用微电极测其pH。
三、仪器和用具1. 电泳仪2. 垂直管式园盘电泳槽一套3. 注射器与针头4. 移液管：10ml、5ml、2ml、1ml、0.1ml5. 小烧杯若干6. 培养皿一套7. 直尺8. 小刀9. 精密pH试纸和带细长复合pH电极的pH计10. 塑料薄膜和橡皮筋四、试剂1. 丙烯酰胺2. 甲叉双丙烯酰胺3. 两性电解质Ampholine（40%，pH3.5~9.5）4. 过硫酸胺（催化剂）5. TEMED（四甲基乙二胺）（加速剂）6. 磷酸7. NaOH8. 三氯乙酸（TCA）五、溶液配制1. 丙烯酰胺贮液（30%丙烯酰胺，交联度2.6%）：，30g丙烯酰胺和0.8g甲叉双丙烯酰胺溶于H2O，定容至100ml，滤去不溶物后存于棕色瓶，4℃可保存数月。
（全班公用）（另一配方为29.1g 丙烯酰胺和0.9g 甲叉双丙烯酰胺溶于H2O，定容至100ml，交联度为3.0%）。
2. 两性电解质Amphline（40%）的加入量为：50 l /ml 胶液。
3. 过硫酸胺：配成1mg/ml的浓度，当天配制，配100ml全班公用。
胶液中的加入185186 量为0.5mg/ml 胶液。
4. TEMED ：胶液中的加入量为1μl/ml 胶液。
5. 蛋白质样品：选用两种等电点相差较大的蛋白质，每根垂直管中每种蛋白质的加样量控制在<100μg 。
蛋白质样品配制成各为5mg/ml 的浓度。
配2.5ml 全班公用。
6. 固定液：10%的三氯乙酸，每组配50ml 。
7. 阳极电极液：0.1M H 3PO 43.4ml 浓磷酸（85%）加H 2O 至500ml ，每个电泳槽用500ml 。
8. 阴极电极液：0.5M NaOH2g NaOH 加H 2O 溶解至500ml ，每个电泳槽用500ml 。
六、操作步骤1. 配胶过硫酸铵是胶聚合的催化剂，因此最后加入，加毕，立即摇匀，因胶很快就会聚合，必须立即装管。
通常化学聚合的胶液，需在过硫酸铵加入前进行减压抽气处理，本实验将此抽气步骤省略并不影响实验结果。
2. 装管每个学生装两支管，每组装四支。
先用肥皂洗手，然后将圆盘电泳槽的玻璃管洗净，底端用塑料薄膜和橡皮筋封口，垂直放在试管架上，用移液管将配好的胶液移入管内，（每根玻璃管的容量约为1.5~1.8ml ）,液面加至距管口1mm 处，用注射器轻轻加入少许%100⨯⨯=胶液总体积贮液加入量丙烯酰胺贮液浓度胶浓度T %100⨯+=b a bC 甲叉双丙烯酰胺的量胶液中丙烯酰胺的量的量胶液中甲叉双丙烯酰胺交联度%6.2%1008.0308.0=⨯+=C 交联度187H 2O ，进行水封，以消除弯月面使胶柱顶端平坦。
胶管垂直聚合约30分钟，聚合完成时可观察到水封下的折光面。
3. 装槽和电泳用滤纸条吸去胶管上端的水封，除去下端的薄膜，水封端向上，将胶管垂直插入圆盘电泳槽内，调节好各管的高度，记下管号。
每支管约1/3在上槽，2/3在下槽。
上槽加入500ml 0.1M H 3PO 4，下槽加入500ml 0.1M NaOH ，淹没各管口和电极，用注射器或滴管吸去管口的气泡。
上槽接正极，下槽接负极，开启电泳仪，恒压160V ，聚焦2至3小时，至电流近于零不再降低时，停止电泳。
4. 剥胶取下胶管，用H 2O 将胶管和两端洗2次，用注射器沿管壁轻轻插入针头，在转动胶管和内插针头的同时分别向胶管两端注入H 2O 少许，胶条即自行滑出，若不滑出可用洗耳球轻轻挤出。
胶条置于小培养皿内，记住正极端为“头”，负极端为“尾”，若分不清时，可用pH 试纸鉴定，酸性端为正，碱性端为负。
5. 固定取2支胶条置于一个小培养皿内，倒入10%三氯乙酸溶液至没过胶条，进行固定，约半小时后，即可看到胶条内蛋白质的白色沉淀带。
固定完毕，倒出固定液，用直尺量出胶条长度“L 2”和正极端到蛋白质白色沉淀带中心（即聚焦部位）的长度“L ’”。
固定后的胶条可在康强860紫外/可见分光光度计上用280nm 或238nm 波长作凝胶扫描，然后用扫描图作相应的测量和计算。
6. 测定pH 梯度将放在另一个培养皿内未固定的胶条，用直尺量出待测pH 胶条的长度“L 1”。
按照由正极至负极的顺序，用镊子和小刀依次将胶条切成10mm 长的小段，分别置于小试管中，加入1ml H 2O ，浸泡半小时以上或过夜，用仔细校正后的带细长pH 复合电极的pH 计测出每管浸出液的pH 值。
七、数据处理1. 以胶条长度（mm ）为横座标，pH 值为纵座标作图，得到一条pH 梯度曲线。
所测每管的pH 值为10mm 胶条的pH 的混合平均值。
作图时将此pH 值取为10mm 小段中心即5mm 处的pH 值。
2. 用下式计算蛋白质聚焦部位至胶条正极端的实际长度L ：上式中： L’——量出蛋白质的白色沉淀带中心至胶条正极端的长度。
L 1——测pH 的胶条的长度 L 2——固定后胶条的长度3. 根据计算出的L ，由pH 梯度曲线上查出相应的pH 值，即为该蛋白质的等电点。
4. 画出固定后所测胶条的示意图。
八、附注21'L L L L ⨯=1.对两性电解质的要求两性电解质是等电聚焦的关键试剂，所以对两性电解质的质和量都要特别注意。
两性电解质含量以2%～3%较适合，能形成好的pH梯度。
由于载体两性电解质是由多乙烯多胺与丙烯酸进行加成反应生成的混合物，防止时间过长会分菌，分解变质，不能使用。
2.指教注意的问题（1）丙烯酰胺最好是重结晶的。
（2）过硫酸铵一定要新配制。
（3）所有水要用双蒸水。
（4）制胶时，玻璃板和模板必须水平放置。
（5）模板要平直光滑，不然灌胶时易溅漏。
3、防止烧胶（1）平板等点聚焦电泳的胶很薄（0.6mm），当问柳在8mA时，电压可上升到550V以上，由于阴极飘移，造成局部电流过大，胶承受不了而被烧断。
（2）防止烧胶的办法：注意观察，稳流8mA，电压上升到550V时，立即关电源。
用恒功率电泳仪，控制输出功率在指定范围。
在一定功率范围内，改进冷却条件，使因电流产生的热量及时散去。
（3）如果胶被烧了，可在烧断的位置换上一条宽的电极条压过断缝或在电源电极条内侧加一电极条，以此补救。
4.搅拌制作注意事项固定液可使蛋白质变性，不再扩散，故一定要多换一次；在电泳后取胶、固定、染色直至制干胶板都必须仔细，防止胶被损坏。
188。