cDNA文库构建原理以及技术路线
cDNA文库构建的具体步骤及详细说明

cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。
经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物,或者用随机引物,给所合成的cDNA 加上适当的连接接头,连接到适当的载体中获得文库。
其基本步骤包括:(1)mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA 文库的关键步骤之一。
(2)cDNA第一条链的合成。
(3)cDNA第二条链的合成。
(4)双链cDNA的修饰。
(5)双链cDNA的分子克隆。
(6)cDNA文库的扩增。
(7)cDNA文库鉴定评价。
一、Superscipt II—RT合成第一链1. 在一RNase-free的0.2 ml PCR管中加入x ul mRNA(大约500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul)(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAC TAGTCTCGAGTTTTTTTT TTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water(大于500 ng mRNA 分n管(500 ng/tube)合成第一链,第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成。
)。
2. 混匀后,70℃反应10分钟。
3. 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5 min。
4. 稍微离心一下,顺序加入以下试剂:(1)4 ul 5×first strand buffer(2)2 ul 0.1 M DTT(3)1 ul 10 mM dNTP(自己配制)5. 混匀,稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟。
6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT,混匀。
7. 42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶。
二、cDNA第二链的合成1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物-20℃冰箱中保存,待电泳检测。
cDNA 文库的构建
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第二节cDNA 文库的构建cDNA 文库中的外源 DNA 片段是互补 DNA (complementary DNA , cDNA)。
cDNA 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA 经体外反转录后形成的双链 cDNA 。
cDNA 文库代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因的群体,并不能包括该生物的全部基因,且这些基因在表达丰度上存在很大差异。
cDNA 文库的构建cDNA 文库的构建共分四步(图 8-2):第一,细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离;第二,第一链 cDNA 合成;第三,第二链 cDNA 合成;第四,双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。
图 8-2 : cDNA 文库构建流程图一、RNA 的分离cDNA 文库构建是以 mRNA 为起始材料的, mRNA 在总RNA 中所占比例很小,因此从总RNA 中富集mRNA 是构建cDNA 文库和其它应用所必需进行的步骤。
通过降低rRNA和tRNA 含量,可大大提高筛选到目标基因的可能性。
目前纯化mRNA 的方法都是在固体支持物表面共价结合固定一段由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸[ oligo(dT)]链,由它与mRNA 的Poly(A)尾巴杂交,从而吸附固定住mRNA ,进而将mRNA从其它组分中分离出来的。
1.mRNA 的完整性指导合成高分子量蛋白质的能力,指导合成目的多肽的能力,mRNA 的大小,总mRNA 制剂指导合成cDNA 第一链长分子的能力。
2.mRNA 的丰度高丰度mRNA :珠蛋白,免疫球蛋白,卵清蛋白,在特定细胞中占50-90% 。
低丰度mRNA :含量 0.5% 被称为低丰度或稀有mRNA 。
3.mRNA 的富集3.1按大小对 mRNA 进行分级分离3.2 cDNA 的分离级分离近年来多采用此方法,特别是大mRNA ,可避免降解mRNA , agarose 分离大小易辨。
cDNA文库构建简易流程
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1、紫茎泽兰第一链cDNA的合成取2 u1提取的紫茎泽兰mRNA,加入适量的CDSIII primer和SMART IV Oligo寡核苷酸以及其它相应试剂,在适当的条件下,经反转录酶进行反转录合成紫茎泽兰第一链cDNA.2、LD-PCR合成紫茎泽兰第二链cDNA取合成的紫茎泽兰第一链cDNA加入其它试剂,通过LD-PCR进行双链cDNA的合成3、紫茎泽兰双链cDNA的酶切及分离纯化双链cDNA经蛋白酶K消化去除DNA聚合酶活性,经氯仿:异戊醇抽提,酒精沉淀后,用限制性内切酶sfi I进行酶切消化。
酶切后,过CHROMA SPIN-400柱进行分级分离纯化,以去除小的片段和杂质,依次收集16管,经1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测后,收集cDNA 含量最高的几管。
4、双链cDNA片段的克隆和体外包装分级分离纯化的双链cDNA,定向克隆到试剂盒提供的经sfi I酶切的去磷酸化的入λTripIEx2载体上,在载体量不变的前提下,设定了3个连接梯度反应,连接结束后,3个连接产物分别用Promega公司的Packagene Lambda DNA受Packaging System包装,体外包装条件按试剂盒说明进行。
5、文库的滴定与重组率检测用常规方法检查文库的滴度。
3个连接反应包装后,分别取1ul用1X Lambda dilution buffer按1:10稀释,稀释后的入噬菌体裂解物再分别取0. 5ul 加入到150ul预先过夜培养的XL1-BLue菌液,在37 C进行20min的吸附后,再加入到1. 5m1熔化的LB/MgSO4顶层软琼脂,迅速混匀倒到预热至37℃的平板上,快速摇动平板使顶层软琼脂分布均匀,顶层软琼脂凝固后在37℃培养箱中倒置培养,每相隔一段时间后,检查噬菌斑生长情况。
根据长成的噬菌斑的数目进行文库的滴度计算,公式如下:文库的重组率则利用蓝白斑互选进行,在每1. 5m1的顶层琼脂加入50ul X-gal (20mg/ml) , 50ul IPTG (200mg/Ml),待噬菌斑长成后,统计蓝白斑的数量,算出重组率。
cDNA文库的构建
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cDNA文库的构建cDNA文库的构建基因文库的构建是现代生命科学研究中的一项重要技术。
自70年代初首例cDNA克隆问世以来,已用构建和筛选cDNA文库的方法克隆了很多基因。
通过构建cDNA文库能直接分离到生命活动过程中的一些调控基因及了解这些基因所编码的蛋白质的相互作用关系.因此cDNA文库的构建是基因克隆的重要方法之一,从cDNA文库中可以筛选到所需的目的基因,并直接用于该目的基因的表达。
它是发现新基因和研究基因功能的工具。
1.cDNA文库构建的原理真核生物基因的结构和表达控制元件与原核生物有很大的不同。
真核生物的基因是断裂的,在基因最后产物中表达的编码序列(外显子)被非编码序列(内含子)分隔开,需经RNA转录后加工过程才使编码序列拼接在一起。
真核生物的基因不能直接在原核生物中表达,只有将加工成熟的mRNA经逆转录合成互补的DNA (complementary DNA,cDNA)接上原核生物表达控制元件,才能在原核生物中表达。
而且,真核细胞的基因通常只有一小部分进行表达,由于mRNA的不稳定性,对基因表达和有关mRNA都常通过对其cDNA来进行研究。
为分离cDNA克隆或研究细胞的cDNA 谱,需要先构建cDNA文库。
所谓cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和。
cDNA文库应包含的克隆数目可由以下公式来计算:N=ln(1-p)/ln(1-1/n)式中:N-cDNA文库所包含的克隆数目;P-低丰度cDNA存在于库中的概率,通常要求其大于99%;1/n-每一种低丰度mRNA占总mRNA的分数。
2.构建cDNA文库的基本步骤构建cDNA文库的基本步骤有五步:①制备mRNA;②合成cDNA;③制备载体DNA;④双链cDN 的分子克隆;⑤对构建的cDNA文库进行鉴定,测定文库包含的克隆数,抽查克隆的质量和异质性,如果需要可适当扩增。
对cDNA的文库的要求:一是希望文库能包括各种稀有mRNA的cDNA克隆;二是克隆的cDNA应是全长的,避免丢掉5’端的序列。
cdna基因文库构建的基本路线
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cdna基因文库构建的基本路线以cdna基因文库构建的基本路线为标题的文章概述CDNA基因文库是基因组学研究中的一个重要工具,可以用于克隆和表达特定基因。
本文将介绍构建cdna基因文库的基本路线,包括RNA提取、逆转录、cDNA合成、文库构建和筛选等步骤。
第一步:RNA提取构建cdna基因文库的第一步是从所研究的生物样品中提取总RNA。
这可以通过使用商业化的RNA提取试剂盒或经典的酚-氯仿法等方法来实现。
在提取RNA的过程中,需要注意样品的保存和处理,以确保所提取的RNA完整无损。
第二步:逆转录逆转录是将RNA转化为相应的cDNA的过程。
逆转录反应通常使用逆转录酶(Reverse Transcriptase)进行,该酶能够将RNA模板上的信息转录成DNA。
在逆转录反应中,需要加入随机引物、dNTPs和逆转录酶,以及适当的缓冲液。
逆转录反应的温度和时间也需要根据具体的逆转录酶和反应体系进行优化。
第三步:cDNA合成在逆转录反应完成后,需要对产生的cDNA进行纯化。
一种常用的方法是通过酶切和连接反应,将cDNA连接到载体上,形成重组DNA,再通过转化等方法将其导入到大肠杆菌等宿主中。
在cDNA 合成的过程中,需要注意对cDNA的纯化和测序质量的控制,以确保所获得的cDNA具有高质量和完整性。
第四步:文库构建文库构建是指将cDNA插入到合适的载体中,形成cdna基因文库。
常用的载体包括质粒和噬菌体等。
在文库构建的过程中,需要对cDNA和载体进行受限酶切,然后使用DNA连接酶将其连接起来。
连接后的DNA需要进行转化,将其导入到适当的宿主细胞中,形成文库。
不同的文库构建方法有所差异,可以根据实验需求选择合适的方法。
第五步:筛选构建cdna基因文库后,需要对文库进行筛选,以寻找感兴趣的基因。
常用的筛选方法包括杂交筛选、PCR筛选和基于功能的筛选等。
根据所研究的基因或表达产物的特性,可以选择合适的筛选方法。
筛选后的阳性克隆可以进一步进行测序和鉴定,以确认所克隆的基因的准确性和完整性。
cdna基因文库构建的基本路线
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cdna基因文库构建的基本路线CDNA基因文库构建是一种常用的分子生物学技术,用于研究基因表达和功能的调查。
本文将介绍CDNA基因文库构建的基本路线,包括材料准备、RNA提取、反转录、合成cDNA、构建文库和筛选等步骤。
一、材料准备进行CDNA基因文库构建之前,需要准备一些实验材料和试剂。
主要包括:1. 细胞或组织样品:可以是人类、动物或植物的细胞或组织样品。
2. 细胞破碎液:用于细胞破碎和RNA保护,常用的有三种类型:TRIzol、RNeasy Mini Kit和RNAiso Plus。
3. 反转录试剂盒:包括反转录酶、随机引物、dNTPs等。
4. 克隆载体:用于构建基因文库的载体,常用的有质粒载体和噬菌体载体。
5. 细菌培养基和抗生素:用于细菌的培养和筛选。
二、RNA提取RNA提取是构建CDNA基因文库的第一步,目的是从细胞或组织样品中提取总RNA。
常用的提取方法有酚/氯仿法、硅胶膜法和磁珠法等。
提取的RNA应具有较高的纯度和完整性,以保证后续的反转录和文库构建质量。
三、反转录反转录是将提取的RNA转录成cDNA的过程。
在这一步中,需要将RNA模板与反转录酶、随机引物、dNTPs等反转录试剂一起反应,合成cDNA。
反转录的条件包括温度、时间和反应体系等,需要根据试剂盒的说明进行操作。
四、合成cDNA合成cDNA是将反转录得到的第一链cDNA转录成双链cDNA的过程。
一般采用PCR扩增的方法,在反应中加入适量的引物和dNTPs,进行多轮扩增,最终得到足够量的双链cDNA。
合成cDNA的条件包括PCR扩增的循环数、温度和时间等。
五、构建文库构建基因文库是将合成的cDNA插入到克隆载体中的过程。
常用的构建方法有限制性内切酶法、T/A克隆法和引物扩增法等。
在构建文库的过程中,需要将双链cDNA与克隆载体进行连接,形成重组DNA。
连接后的重组DNA可以通过转化到适当的宿主细胞中,得到大量的重组质粒。
六、筛选构建完基因文库后,需要进行筛选以获得感兴趣的基因。
《cDNA文库构建》
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基因库是指某一生物群包选取其中任何一个基因克重组体形式贮存起来; ☆ 是理课件
(1)细菌人工染色体(bacterial artificial chromosomes, BACs, fosmids)
基础:大肠杆菌F质粒 导入宿主:电转化 载体筛选:显性选择标记重组筛选:插入片段
大小供体DNA大小:>300kbp主要应用:大基因 组分析评论:低频率的重排和嵌合分子。载体 在每个细胞中维持一个或、噬菌体、粘粒和人工染色体 根据构建过程中是否对克隆进行过全长选择分为
普通cDNA和全长cDNA 依据第一链反转录引物不同分为随机引物c的构建整理课件主要内容
基因的概念及意义 cDNA基因的类型 几种cDNA的介绍 SMAR物类型全部基因的 集合,这些基因以克隆的形式存在(人工构建)。
点和端粒
中不相连的连续片段);
不稳定(自发缺失);
很难与酵母染色体分离;
PAC(P1 人工染色体) 细菌噬菌体 P1
100~300kb 稳定,但在细菌外难以维
BAC(细菌人工染色体) F 质粒
300kb
持
MACs(哺乳类人工染色 基于 Epstein-Barr 病 >300kb
体)
毒的游离载体
人类人工游离染色体(human artificial episomal chromosome,HAEC)是一类发展 中的 MACs,它来自于 Epstein-Barr 病毒
整理课件
根据基因类型(重组DNA片段的供体) 基因组 和cDNA1、基因组
★ 基因组(gene library):用重组DNA
技术,将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA切割成一定大 小的片段,并与合适的载体重组后,然后转移到适当的宿主 细胞中,通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系(克 隆),这些存在于所有重组P1载体和P1人工染色体(P1 artificial chromosomes, PACs)
cDNA文库构建原理以及技术路线
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CDNA文库1. CDNA文库中重组DNA片断得原始供体来源与细胞中表达出得mRNA,将某一特定类型细胞表达得mrna经反转录酶催化形成与之互补得CDNA,重组克隆后得到得CDNA文库有各自不同得适合范围。
CDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组得表达状态以及表达基因得功能鉴定方面具有特殊得优势,从而使它在个体发育,细胞分化,细胞周期调控2. CDNA文库得质量(1)文库的代表性CDNA文库的代表性是指文库中包含得重组CDNA分子是否能完整地反映出来原细胞中表达地全部信息(即mrna种类),它是体现文库质量地最重要标本。
文库地库容量,它是指构建建出地原始CDNA文库中包含地独立地重组子克隆数。
具备完全好代表性地CDNA文库需要满足地库容量取决与来源细胞中表达出地基因序列地总复杂程度。
具体来就是来源细胞中表达出地mrna种类和每种MRNA序列地拷贝数N=ln(1-p)/ln(1-n/t),P为文库中包含细胞中任何一种mrna序列信息地概率,通常设为99%,N为文库中P概率出现细胞中任何一种mrna序列理论上应具有地最少重组克隆数,n为细胞中最稀少地mrna序列地拷贝数,t为细胞中表达出地所有mrna地总拷贝数,以人类细胞为列,人类基因组携带地遗传基因总数约为100000种,具体到某一特定类型地细胞中,表达出地基因种类仅为基因组全部基因地15%。
因此对于巨大部分地人类细胞,每个细胞内具体表达地mrna种类约为15000种,全体mrna序列地总拷贝约为500000个,而细胞中稀少地mrna种类地拷贝数平均为8个。
因此,用人类细胞来构建CDNA文库时候,要以99%概率保证文库中包含有细胞表达地任何一种mrna地序列信息,构建出地原始CDNA文库理论上应具有地最少独立克隆数为N=ln(1_99%)/ln(1-8/500000)=2.9*10(5)一个具有完好代表性地CDNA文库至少具有10(6)以上的库容量3.MRNA是由5‘端非编码区,中间地编码序列和3’端非翻译区。
[转载]基因文库构建的过程、原理及方法
![[转载]基因文库构建的过程、原理及方法](https://img.taocdn.com/s3/m/75baf7f9162ded630b1c59eef8c75fbfc77d94c1.png)
[转载]基因⽂库构建的过程、原理及⽅法原⽂地址:基因⽂库构建的过程、原理及⽅法作者:蓝茶基因⽂库构建的过程、原理及⽅法1 cDNA ⽂库的构建1.1 cDNA ⽂库构建的基本原理与⽅法cDNA ⽂库是指某⽣物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA ⽚段与某种载体连接⽽形成的克隆的集合。
经典 cDNA ⽂库构建的基本原理是⽤ Oligo(dT) 作逆转录引物,或者⽤随机引物,给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头,连接到适当的载体中获得⽂库。
其基本步骤包括:RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法,盐酸胍—有机溶剂法,热酚法等等,提取⽅法的选择主要根据不同的样品⽽定),要构建⼀个⾼质量的 cDNA ⽂库,获得⾼质量的 mRNA 是⾄关重要的,所以处理 mRNA 样品时必须仔细⼩⼼。
由于 RNA 酶存在所有的⽣物中,并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境,因此建⽴⼀个⽆ RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。
在获得⾼质量的 mRNA 后,⽤反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链, cDNA 第2链的合成(⽤RNA 酶 H 和⼤肠杆菌 DNA 聚合酶 I,同时包括使⽤ T4 噬菌体多核苷酸酶和⼤肠杆菌 DNA 连接酶进⾏的修复反应),合成接头的加⼊、将双链 DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插⼊⽚断,扩增 cDNA ⽂库、对建⽴的 cDNA ⽂库进⾏鉴定。
这⾥强调的是对载体的选择,常规⽤的是λ噬菌体,这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端,可⽤来构建柯斯质粒,这种质粒能容纳⼤⽚段的外源 DNA。
1.2 cDNA 全长⽂库经典 cDNA ⽂库的构建虽然⾼效、简便,但⽂库克隆的⽚段⼀般较⼩,单个克隆上的 DNA⽚段太短,所能提供的基因信息很少,⼤多需要⼏个克隆才能覆盖⼀个完整的全基因的 cDNA。
为了克隆到真正的 cDNA 全长,建⽴富含全长的 cDNA⽂库具有重要意义。
简述cdna文库的构建过程

从RNA转录到cDNA:构建cdna文库的全过程cDNA文库是研究生命科学的一个重要工具。
在研究基因表达、肿瘤学、医学遗传学等方面,cDNA文库都有着重要的应用价值。
cDNA文库的构建过程是一个复杂而细致的工作,需要精确的实验操作和仔细的分析。
本文将从RNA提取、反转录、PCR扩增等方面全面介绍cDNA 文库构建的全过程。
第一步:RNA提取与质量检测cDNA文库的构建前提是需要RNA,因此首先需要从细胞或组织中提取RNA。
RNA提取是一个关键的步骤,需要注意的是,样本中的RNA 应该要完整、高纯度、无分解。
提取的RNA要经过质量检测,主要检测指标为RNA完整性和质量。
第二步:RNA反转录RNA反转录是将RNA转录成cDNA的过程。
该步骤中需要用到反转录酶、dNTPs以及随机引物等试剂。
将RNA与反转录试剂混合,进行酶促反应,即可将RNA转录成cDNA。
此外,为了避免DNA组合不完整,要进行加热反应。
反转录后的cDNA还需进行纯化和浓缩。
第三步:PCR扩增得到纯化后的cDNA样品,需要进行PCR扩增。
根据实验设计的需要,设计引物,进行PCR扩增。
PCR扩增主要有两步,第一步是降温,使引物与cDNA结合;第二步是升温,进行DNA链的扩增。
扩增完毕后,进行等电泳检测,筛选出符合条件的基因,即可进行下一步操作。
第四步:构建文库接下来是将PCR扩增的产物进行纯化和接头处理,使其成为适合测序的文库。
一般都是采用pUC 18或pGEM T系列质粒作为载体,将PCR产物与载体进行连接,构建cDNA文库。
文库构建完成后,还需进行质控、存储和测序等后续处理。
总之,cDNA文库的构建需要有系统性的实验设计、操作及仔细的数据记录,每一个步骤都需要严格掌控。
只有将每一个步骤都做好,才能得到合格的cDNA文库,为后续的实验提供有力支撑。
cDNA文库的构建方法与原理

c D N A文库的构建方法与原理蛋白质是细胞的功能分子:它们构成结构和调控分子,动力和泵蛋白,酶和受体。
然而,如果仅用传统的生化方法确定某一特异蛋白的全序列,或制备足够量的蛋白进行操作和鉴定都是使人厌烦且昂贵的步骤。
基因克隆和遗传工程对生化领域有很大贡献。
如果只限于将基因组DNA作为材料来源,由于其中仅2%被认为可能编码蛋白质,那么确定蛋白质序列仍然是令人生畏的工作。
其他部分包括结构和调节因子、内含子、非编译外显子和重复及功能未知的非编码序列。
如果分析仅局限在编码序列,那么确定基因产物序列所需的努力就会大大的降低。
因此分子生物学主要原则之一是mRNA作为蛋白质合成的模板,所以mRNA是确定蛋白质序列的理想底物。
不幸的是,现有通用的克隆载体没有一个能容纳mRNA分子作为插入片段。
因此,产生表达序列文库的一个基本步骤是将mRNA分子转变成双链DNA。
来自mRNA分子的DNA拷贝称cDNA,由来自细胞或组织mRNA种类的DNA拷贝组成的文库称为cDNA文库。
1.基本原理cDNA(Complementary DNA)是以mRNA为模板,在反转录酶作用下合成的互补DNA,它的顺序可代表mRNA序列。
cDNA文库的构建是指将cDNA与克隆载体DNA体外重组,然后去转化克隆载体DNA 的宿主细胞,从而得到一群含重组DNA的细菌或噬菌体克隆的过程。
这些序列来自并代表一定组织或细胞类型特定发育或分化阶段的整个mRNA群体。
其过程可概括为:(1)通过反转录酶将各种mRNA转变在cDNA;(2)cDNA与合适的载体重组并导入到宿主中。
cDNA基因文库具有许多优点和特殊用途:首先,cDNA克隆以mRNA为起始材料,这对于有些RNA病毒来说非常适用,因为它们的增殖并不经过DNA中间体,研究这样的生物有机体,cDNA克隆是唯一可行的方法。
第二,cDNA基因文库的筛选简单易行,恰当选择mRNA的来源,使所构建的cDNA基因文库中,某一特定序列的克隆达到很高的比例,简化了筛选特定基因序列克隆的工作量。
cDNA文库的构建

PCR基因扩增
• 目的:增加目的DNA的数量
过程:
• 1、将PCR使用的药品、试剂从冰箱取出,冰浴放置。按照 PCR反应体系加药品,加药完毕后,用微型离心机离心数秒, 使所加药品混匀。
• 2、PCR反应体系
• 在0.2ml PCR管内配制25ml反应体系
• 3、PCR反应程序: • 预变性 • 变性 • 退火 • 延伸 • 再延伸
• (4)PCR反应完成后的样品4℃下短时间保存。-20℃下可 以保存数周。
双链cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入 大肠杆菌中繁殖
• 将合成的双链重组到质粒载体或噬菌体载体上,转化大肠 杆菌寄主细胞增殖.
• 1,同聚物加尾法 • 利用小牛胸腺末端转移酶在双链cDNA和质粒载体的3'-端
都加上一个互补的同聚片段,通过退火使两个连接片段成 重组质粒,再将重组质粒转化受体细胞. • 同聚物加尾法克隆双链cDNA • 2,接头-衔接头法 • 3,mRNA-cDNA克隆法
蓝白斑筛选:• 找出需构建的目的(3)cDNA第二条链的合成。
(4)双链cDNA的修饰。
(5)双链c提取与分离 B. 第一链cDNA的合成 C. 第二链cDNA的合成 D. 双链cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入大肠杆菌中
• 2、在锥瓶的瓶口用玻璃纸封口,留有一定空隙。然后在 微波炉中加热溶解琼脂糖。加热时,当溶液沸腾后,请 戴上防热手套,小心摇动锥瓶,使琼脂糖充分均匀溶解。
• 3、使溶液冷却至50℃-60℃左右,在此时按照1 μL / 10 mL的比例加入4S green染料,并充分混匀。
构建cdna文库的基本步骤

构建cdna文库的基本步骤《构建cDNA文库的基本步骤》引言:cDNA文库的构建是基因组研究中重要的实验技术之一,它可以利用转录酶逆转录RNA为cDNA,然后将其插入适当的载体中,最终形成一个具有表达能力的基因文库。
本文将介绍构建cDNA文库的基本步骤。
一、总RNA的提取首先,需要从细胞或组织中提取总RNA,并保证RNA的完整性和纯度。
常用的提取方法包括酚/氯仿法、硅胶柱法等。
提取得到的总RNA可以用琼脂糖凝胶电泳进行分离和检测。
二、逆转录反应逆转录反应是将RNA逆转录为cDNA的过程。
在逆转录反应中,需使用逆转录酶、引物和核苷酸等。
逆转录酶能合成第一链cDNA,引物通常采用寡聚dT引物或随机引物。
三、DNA合成和连接在逆转录反应后,需要使用DNA聚合酶和核苷酸进行第二链cDNA的合成。
然后,将合成的cDNA连接到选择的载体上,常见的载体有质粒、噬菌体等。
连接过程一般采用连接酶催化反应。
四、转化和筛选将连接好的载体转化到合适的宿主细胞中,可以通过热冲击法、电穿孔法等方法进行转化。
之后,将转化后的细胞涂在筛选板上,并在含有抗生素的培养基上筛选,筛选出含有目标基因的克隆。
五、鉴定和分析最后,对构建好的cDNA文库进行鉴定和分析。
可以利用限制性内切酶等方法进行单克隆检测和鉴定,也可以通过PCR扩增目标基因进行进一步分析。
结论:构建cDNA文库是一项关键的技术,它为基因组研究提供了丰富的资源。
通过提取总RNA、逆转录反应、DNA合成和连接、转化和筛选,最终可以得到一个具有表达能力的cDNA文库。
这些步骤的顺利进行和准确操作,对于后续的基因组研究具有重要意义。
cdna文库的构建步骤
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CDNA文库的构建步骤一、引言在分子生物学和基因组学研究中,建立cDNA文库是一项重要的实验技术。
cDNA文库是从mRNA中合成的互补DNA(cDNA)的集合,它能够反映细胞中mRNA的表达情况。
本文将详细探讨cDNA文库构建的步骤和流程。
二、cDNA文库构建步骤2.1 RNA提取与纯化在构建cDNA文库之前,首先需要提取和纯化所需基因表达的RNA,这是启动构建cDNA文库的关键步骤。
1.准备细胞样本或组织样本。
2.使用适当的方法(例如TriZol法、RNA纯化试剂盒)提取总RNA。
3.通过离心等手段去除DNA和蛋白质等杂质。
4.使用酶切RNA的方法去除rRNA等非编码RNA。
2.2 逆转录合成cDNA逆转录是将RNA转录成cDNA的过程,这是构建cDNA文库的关键步骤之一。
1.准备RNA模板和引物,引物可以是随机引物或特定引物。
2.将RNA样本与引物混合,在特定条件下进行反应。
3.添加逆转录酶(如Reverse Transcriptase),逆转录酶能合成cDNA的互补序列。
4.根据反应体系的要求进行反应,通常涉及温度和时间的控制。
5.利用热敏聚合酶(如Taq DNA Polymerase)可加热光敏不稳定的逆转录酶,从而停止逆转录反应,并保持产物的合成。
2.3 cDNA文库构建cDNA文库的构建涉及PCR扩增、酶切、连接和转化等步骤,下面详细介绍。
2.3.1 PCR扩增1.准备扩增反应液:包括cDNA模板、引物(正向引物和反向引物)、dNTPs和聚合酶等。
2.设置PCR扩增条件,包括温度、循环数和时长等。
3.进行PCR扩增反应,其中cDNA模板将作为DNA合成的起始物,引物将提供扩增的特异性。
2.3.2 酶切1.使用限制性内切酶对扩增产物和载体进行酶切。
2.确定酶切产物的大小和酶切位点。
2.3.3 连接1.准备连接试剂盒和连接系统。
2.混合酶切产物和合适的载体,进行连接反应。
3.控制反应条件,如温度和时间。
cdna文库的构建
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cdna文库的构建
首先需要提取出RNA分子的互补DNA(cDNA),然后将其克隆到载体上,形成一个cDNA文库。
具体的步骤如下:
1. RNA提取:从组织或细胞中提取RNA。
2. 逆转录:利用逆转录酶将RNA转变成cDNA。
逆转录酶可以用几种不同的方法,包括反转录PCR方法和反转录特异性引物的方法。
3. 双链cDNA合成:将一端的oligo dT引物与头部的mRNA 低复杂度区域杂合,随后,通过使用逆转录酶(polymerase)来合成第一条链,然后再合成第二条链,以得到双链cDNA。
4. 手工或机器克隆:将cDNA克隆到载体中。
手工克隆使用限制性内切酶和连接酶来插入cDNA,而机器化克隆则使用高通量自动克隆技术。
5. 图书馆筛选:初步筛选文库,以分离包含所需基因的克隆。
6. 验证和测序:最后,通过验证所得克隆的插入片段的尺寸和序列,并使用测序技术对其进行测序。
总的来说,构建cdna文库需要耗费较多的时间和精力,但它
是研究基因表达的重要手段。
对于生物学、医学、农业等领域的研究都具有非常重要的意义。
cdna文库构建过程
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cdna文库构建过程
cdna文库构建过程
cdna文库构建是一种从逆转录提取mRNA,并将其转化成可用于克隆的DNA片段的方法,并将其用于测序等分子生物学研究。
下面の流程介绍了cdna文库构建的步骤:
1. 样本准备:收集合适的活菌样本,细胞经过lysis处理,可以获得核酸提取液,用于cdna文库构建。
2. 微小RNA提取:将液体样本经过cDNA合成,利用内源Oligo dT链条的帮助,在rRNA与mRNA之间断开,就可以获得微小RNA。
3. cdna合成:将液体样本经过反转录,也就是mRNA转化为cDNA,就可以获得cdna文库。
4. 再次纯化:将cdna文库经过再次纯化,去除反转录产物及其他污染源,经过QC后,就可以开始克隆。
5. cDNA克隆:将cdna文库再次纯化的片段植入到克隆载体上,就可以获得cDNA克隆文库。
6. 测序:最后将克隆文库经过测序,就可以获得cdna序列,进行进一步的分子生物学研究。
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CDNA文库
1. CDNA文库中重组DNA片断得原始供体来源与细胞中表达出得mRNA,将某一特定类型细胞表达得mrna经反转录酶催化形成与之互补得CDNA,重组克隆后得到得CDNA文库有各自不同得适合范围。
CDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组得表达状态以及表达基因得功能鉴定方面具有特殊得优势,从而使它在个体发育,细胞分化,细胞周期调控
2. CDNA文库得质量
(1)文库的代表性
CDNA文库的代表性是指文库中包含得重组CDNA分子是否能完整地反映出来原细胞中表达地全部信息(即mrna种类),它是体现文库质量地最重要标本。
文库地库容量,它是指构建建出地原始CDNA文库中包含地独立地重组子克隆数。
具备完全好代表性地CDNA文库需要满足地库容量取决与来源细胞中表达出地基因序列地总复杂程度。
具体来就是来源细胞中表达出地mrna种类和每种MRNA序列地拷贝数
N=ln(1-p)/ln(1-n/t),P为文库中包含细胞中任何一种mrna序列信息地概率,通常设为99%,N为文库中P概率出现细胞中任何一种mrna序列理论上应具有地最少重组克隆数,n为细胞中最稀少地mrna序列地拷贝数,t为细胞中表达出地所有mrna地总拷贝数,以人类细胞为列,人类基因组携带地遗传基因总数约为100000种,具体到某一特定类型地细胞中,表达出地基因种类仅为基因组全部基因地15%。
因此对于巨大部分地人类细胞,每个细胞内具体表达地mrna种类约为15000种,全体mrna序列地总拷贝约为500000个,而细胞中稀少地mrna种类地拷贝数平均为8个。
因此,用人类细胞来构建CDNA文库时候,要以99%概率保证文库中包含有细胞表达地任何一种mrna地序列信息,构建出地原始CDNA文库理论上应具有地最少独立克隆数为
N=ln(1_99%)/ln(1-8/500000)=2.9*10(5)
一个具有完好代表性地CDNA文库至少具有10(6)以上的库容量
3.MRNA是由5‘端非编码区,中间地编码序列和3’端非翻译区。
非翻译区地序列特征对基因地表达具有重要地调控作用,其中编码产生地蛋白质产物都具有在结构上相对独立地结构域,存在与同一分子上地结构域对体现出蛋白产物在细胞中所行使地生物学功能。
因此要从CDNA文库中分离获得目的基因完整地序列信息和功能信息,要求文库中地重组CDNA片断应尽可能完整获得目的基因结构
4.构建文库的载体系统
(1)入噬菌体载体系统是在CDNA文库构建中最早使用地载体系统,在载体本身地设计方面已经相当成熟,其主要优点是插入片断地装载容量大,适合与全长CDNA地克隆。
重组子经专门地体外包装系统包装成有感染力地噬菌体颗粒,对宿主大肠杆菌地转染效率高,通常1ugCNDA构建出地CDNA文库,转染宿主菌后,都可以得到10(6)-10(7)以上地原始库容量,同时对重组克隆是否含有CDNA文库地插入片断地实际情况,有较好地质量控制指标,因此用这类载体地系统构建地CDNA文库质量高,代表性好,此外这类载体系统构建出地CDNA文库以重组噬菌体颗粒形式存在,这些重组噬菌体颗粒地感染活性在4度环境比较稳定,非常适合长期保存,但是可以采用地文库筛选方法很有限,文库中地CDNA 片断在宿主细胞无法功能性表达。
(2)质粒载体系统
可以功能性筛选:利用基因在体内体现其生物学活性所依据地生化基础,从文库中分离鉴定
出目的基因地一种文库筛选策略,基础就是蛋白质-蛋白质,蛋白质-核算,相互作用,可以使用任何一种生物分子作为耙分子,通过从表达地CDNA文库中检测出与耙分子发生相互作用地编码产物,就能从文库中分离出这一功能地目的基因,并对于如何鉴定和开发利用这一基因地功能(1)文库中CDNA编码序列能在宿主细胞中功能表达,产生具有天然构想地编码产物。
(2)检测出目的功能表形地同时,能直接获得编码这一表型地基因型。
缺点:库容量小,1ug双联DNA构建出地质粒文库,原始克隆数只有10(6)以下
5.构建CDNA文库地主要步骤
(1)制备MRNA样品
其3端具有长度20-250个腺甘酸组成地poly(A)尾巴,通过偶联与固相介质地olige(dt)寡核甘酸退火,RNA中地MRNA成分通过其3端poly(A)与olgo(dt)互补杂交固定在固相介质上地MRNA地其他成分分离,再次洗脱下来
(2)合成第一条联:
1. Oligo(dt)引导地CDNA合成方法:由12-20个脱氧胸腺嘧啶核甘酸组成地人工合成地寡核甘酸片断,与mrna3末端地poly(A)退火后,即可用做引物,引导翻转录以MRNA为模板合成互补CDNA,用oligo(dt)核甘酸做引物好处就是翻转路反应基本限定以MRNA为模板,因此混有少量地RRNA没有什么严重,缺点是只能从模板mrna3端起始引发CDNA合成,所以用oligo(dt)引导会缺少5端序列信息,为了减少对于poly尾巴的合成,一种方法就是锚锭的oligo引物,这种oligo引物3端倒数1-2位是随机型的,合成的3端随机的混合引物群体,引发特定位置的反转录
2,随机引物合成,优缺点相反
(2)双联DNA的转换合成
1,自身引导合成法:
反转录酶催化的反转录结束以后,通常会合成出新的单联CDNA3端反转录形成的具有部分双联结构的发夹环形式,利用这一特点,在完成CDNA第一条联很成并与模板MRNA分离以后,就利用发夹环中双联部分继续作为引物,引导DNA聚合酶以CDNA为模板,合成出互补的第二条联CDNA,反映结束以后,用S1核酸酶讲解去除发夹环的单联部分,即可得到双联形式的CDNA片断,缺点S1核酸酶对发夹环要求严格,很少用
2.联置换法
首先利用大肠杆菌RNAaseH将杂交双联中MRNA模板联在内部发生随机降戒,形成多段短的仍与CDNA第一联保持互补杂交的RNA片断,这些互补RNA片断可以被大肠杆菌DNA聚合酶用做引物,引导合成出与CDNA第一条联互补的第二条联CDNA,这种合成反映在第一条联CDNA模板多处引发,随着合成引物延伸,除了5端RNA引物以外,所有RNA片断均被新合成的互补联所置换,通过DNA连接酶的作用,降模板上分段合成互补联连接成一条完整的DNA联,最后通过分离去除残留的5端RNA片断,并用T4聚合酶削平3端突出的单联形式DNA,就可以得到一个双联形式的CDNA片断,缺点:得不到来源MRNA5端信息
(4)CDNA克隆
提高文库片断与载体的连接效率,通常做法是给平端的双联DNA片断添加衔接头,衔接头是人工合成含有某种限制型内切酶位点的短的DNA的片断或是一端为某种限制酶黏性末端的双联DNA片断。
为了避免CDNA片断内部出现可能的酶切位点,在添加衔接头之前,文库CDNA应该甲基化处理,以修饰内部可能出现的酶切位点。
采用普通添加衔接头,CDNA文库与载体的插入方向是随机的,这种克隆对于非表达型CDNA文库筛选没有影响,但是对于表达文库,只有1/6的插入片断具有正常的表达可
能型,,克服这一问题就是采用CDNA文库定向克隆策略。
一种做法是在引导CDNA第一条联合成的寡核甘酸引物5端预先设计一种酶切位点,在双联CDNA合成完成以后,再次添加另一种限制型内切酶酶切位点的衔接头,采用两种酶进行双酶切以后就可以使得CDNA 文库得到不同黏性末端。
另外设计特定序列衔接头
(5)入如何构建全长CDNA文库
1.Olgo(dg)引导CDNA第二联合成
在第一条联反转录完成以后,可以利用核甘酸末端转移酶在MRAN-CDNA杂交体的CDNA 联3端添加上多个DC残基,产生出一段oligo(dc)序列,通过碱性蔗糖密度剃度离心,使得MRNA-CDNA杂交双联分离,并回收单联CDNA加入过量的oligo(dg)作为引物,通过olgo(dg)与CDNA第一条联3端的oilgo(dc)序列退火杂交,从而引导完整的CDNA第二条联3.载体引导合成
4.首先用平端限制酶使得克隆载体线性化,利用核甘酸末端转移酶在载体链条联的3端分别加上一段oligo(dt)序列,处理后的载体与MRNA退火,载体的oligo(dt)和MRNA的POLY(A)互补,作为反转录酶的引物,引导合成出CDNA第一条联,并通过末端转移酶在CDNA3端添加一段oilgo(dg)序列,讲解去除模板mrna,,经碱性蔗糖密度分路回收质粒两条联,这两条联的3端都连上一条新的合成的CDNA第一条联。
分别用这两种单联DNA,与分子数绝对过量的,3端加入有olgo(dc)序列,经变性处理的同一载体DNA混合退火,通过载体间的互补联以及oligo(dg)/oilgo(dc)杂交,形成环状,带有大缺口(相应应对CDNA第一条联部分)的双联DNA分子,最后使用klenow酶将缺口填补的同时,合成CDNA第二条联,形成完整的环状双联重组载体,可以直接转化大肠杆菌,。