染色质免疫共沉淀(ChIP)实验具体方法及步骤

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染色体免疫共沉淀

染色体免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是基于体内分析发展起来的方法，也称结合位点分析法，在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。

这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰。

ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。

它的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。

实验步骤：第一步：用甲醛把细胞内的DNA结合蛋白与DNA交联起来具体步骤与注意事项1. 准备好一盘细胞量达到1 x 106的培养皿（注意：培养细胞时要适当处理细胞使得目的基因处于被转录的状态）2. 于培养基中加入适量的甲醛，使甲醛终浓度达到1%，37℃下交联10分钟。

（注意：交联的时间太短或太长都会影响最终的结果）3. 尽量的去掉培养基，然后用加了蛋白酶抑制剂的预冷PBS清洗细胞两次；4. 把细胞刮下，置于离心管中，4°C 2000 rpm 离心4分钟；5. 去掉上清液，加入200微升裂解液（注意：每1 x 106个细胞加200微升裂解液），冰上裂解10分钟；第二步：用超声波的方法把DNA破碎成合适的大小（250bp至800bp），因为在第一步中用甲醛交联了细胞内的大分子，所以结合蛋白质的DNA片段相对没那么容易被打断。

具体步骤与注意事项6. 用超声波破碎细胞裂解液中的DNA至DNA的长度为250bp至800bp（注意：整个操作过程必须在冰上进行，破碎中途不断的跑胶检测DNA分子长度是否达到250bp至800bp）第三步：用特异性抗体与DAN结合蛋白结合，用免疫沉淀的方法法分离出复合体。

纯化出复合体中的小片段DNA具体步骤与注意事项7. 把破碎好的细胞裂解液置于冰冻离心机中4°C 13000 rpm 离心10分钟，再把上清转移到2ml的离心管中；8. 用CHIP稀释液把细胞裂解液稀释10倍，并将此液称为原液（注意：稀释后取出200微升原液作为Input样品）；9. 为了更好的去掉结果背景，往原液中加入75微升的蛋白A/G琼脂糖珠，4°C孵育30分钟，再稍微离心一下，收集上清液（以下称为A液）；10. 把A液分为两份，一份加入结合目的基因的蛋白的抗体，一份加入Fl ag标签抗体，4°C孵育过夜；11. 分别加入40微升的蛋白A/G琼脂糖，4°C摇晃孵育1小时；（注意：孵育的时间不能太长，而且摇晃的速度要快）12. 700 至1000 r pm 4°C冰冻离心1分钟，去掉上清，反复清洗琼脂糖珠四次（注意：务必把上清液彻底的去掉，否则残留的上清液会造成假阳性）；第四步：用PCR扩增特异DNA序列，以确定目的基因是否与抗原蛋白结合并最终被沉淀下来。

染色质免疫共沉淀XChIP实验设计

染色质免疫共沉淀 X ChIP 实验设计ChIP是一种强大的确定蛋白或者组蛋白修饰在基因组上定位的实验方法。

染色质被分离出来后采用抗体与抗原的结合来判定目的蛋白是否结合在特定的DNA序列上或者判定目的蛋白结合位点在全基因组范围的分布(微阵列或DNA序列)。

这种方法具有空间性与时效性。

该实验设计为如何在细胞中进行ChIP实验提供了详细的步骤。

1交联和细胞收获。

甲醛可以将蛋白质交联到DNA上。

交联结果的好坏决定于交联时间的把握。

-30分钟。

过度的交联会减少抗原的结合性和我们建议样品交联的时间一般为2超声断裂的效率。

抗原决定簇也会被掩盖。

加入甘氨酸可以消除甲醛使交联反应终止。

1.准备两个长满细胞的150cm2的细胞培养皿(1*107-5*107个细胞/皿)。

将甲醛直接滴入PBS洗过的细胞培养皿中，使其终浓度为0.75%，然后在室温缓慢旋转10分钟，使蛋白和DNA发生交联。

2加入甘氨酸使其终浓度为125mM,在室温晃动孵育5分钟。

3使用10ml预冷PBS清洗细胞2次4使用细胞刮将细胞收获放入5ml预冷PBS中，并转入50ml的管子。

5.在皿里加入3mlPBS，将剩余的细胞转移到50ml管子里6 1，000g离心5分钟7.将上清倒去，使用FA裂解液将沉淀重悬浮(1x107cells/750μl).初始细胞要有1*107-5*107个，采用终浓度为0.75%甲醛和如上描述的甘氨酸处理。

预冷PBS洗3次，1，000g离心5分钟，沉淀用FA裂解液重悬浮。

2。

超声破碎超声裂解细胞悬液可以将DNA均一的打断成500-1000bp的片段。

不同的细胞系需要不同的超声时间才能达到最优效果。

交联细胞要通过时间梯度的超声来选择最优超声条件。

样品通过时间梯度，DNA的分离如部分3所描述。

片段大小序在1.5%的琼脂糖凝胶上检测分析。

如图一所示图一:2超声破碎后，8，000g，30秒，4?C,离心。

将上清移入新的管子中。

开始准备进行染色质免疫共沉淀(IP)。

染色质免疫沉淀技术（ChIP）实验流程（转）

染⾊质免疫沉淀技术（ChIP）实验流程（转）⼀. 实验前准备：1. 实验设计与分组2. 实验试剂、耗材、仪器准备3. 试剂盒：Pierce™ Agarose chip Kit⼆. 实验开展：(以哺乳动物贴壁细胞为例)A. 交联与细胞裂解1. ⽤15cm培养⽫培养细胞，细胞量达80%-90%，细胞数量约为1x107 个，待⽤。

以下步骤基于1次ChIP试验2. 交联：向每个含有培养液的培养⽫中，加⼊16%的甲醛，使甲醛终浓度为1%. 轻轻晃动培养⽫, 使混匀, 室温孵育10min. (交联时间很重要，过长影响ChIP结果，过短交联不完全，产⽣假阳性)3. 终⽌交联：向上述培养⽫中，加⼊10X的⽢氨酸溶液使其终浓度为1X的。

混匀，室温孵育5min。

4. 吸出培养⽫中含有甲醛-⽢氨酸的混合培养基。

⽤1倍体积预冷的PBS清洗细胞两次。

5. 在1ml预冷的PBS加10ul的Halt Cocktail。

然后将此混合液加⼊清洗后细胞中，再⽤细胞刮搜集细胞，将细胞悬浮液⽤移液器转移到1.5m的微管离⼼管中。

6. 将搜集的细胞于3000g离⼼5min。

除去PBS，将细胞沉淀物保存在-80°，或者直接进⾏⼀下步骤：酶解附：蛋⽩量检测：WBB. 酶解断裂染⾊质1. 准备好上述交联好的细胞。

如果是冻存的，需在冰上解冻。

2.加100ul含蛋⽩酶抑制剂的Lysis Buffer 1⾄细胞沉淀物中吹打混匀，涡漩离⼼管15s，置于冰上孵育10min;9000g离⼼3min，弃除上清。

3. 加0.25ul的Micrococcal Nuclease (ChIP级) (10 U/µL)，涡漩离⼼管，在37°⽔浴锅温浴15min，每5min 颠倒混匀;4. 加10µl的MNase stop 溶液终⽌反应，短暂涡漩混匀，冰上孵育5min。

5. 9000g离⼼5min，去上清，重新获得核酸复合物。

6. ⽤50µl的含(蛋⽩酶/磷酸蛋⽩酶)抑制剂的Lysis Buffer 2重悬核酸复合物，置于冰上15min，每5min涡旋15s。

染色质免疫共沉淀(ChIP)实验具体方法及步骤

染色质免疫共沉淀（ChIP）实验具体方法及步骤在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。

目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天）1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。

2. 37℃孵育10 min。

3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。

450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。

混匀后，在室温下放置5 min即可。

4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。

预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。

6. 倒去上清。

按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。

使得细胞终浓度为每200ul含2x106个细胞。

这样每100 ul溶液含1x106个细胞。

再加入蛋白酶抑制剂复合物。

假设MCF7长满板为5x106个细胞。

本次细胞长得约为80%。

即为4x106个细胞。

因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。

将2管混在一起，共800 ul。

7. 超声破碎：VCX750，25%功率，4.5 s冲击，9 s间隙。

共14次。

二、除杂及抗体哺育（第一天）1. 超声破碎结束后，10 000 g 4℃离心10 min。

去除不溶物质。

2. 留取300ul做实验，其余保存于-80℃。

3. 300 ul中，100 ul加抗体做为实验组；100 ul不加抗体做为对照组；100 ul加入4 ul 5 M NaCl（NaCl终浓度为0.2 M），65℃处理3 h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。

chip-seq过程

chip-seq过程Chip-seq（染色质免疫沉淀测序）是一种常用的基因组学技术，它可以用来研究蛋白质与DNA之间的相互作用。

本文将详细介绍chip-seq的过程及其应用。

一、引言Chip-seq是一种结合了染色质免疫沉淀（ChIP）和高通量测序（sequencing）的技术，用于研究特定蛋白质与DNA之间的相互作用。

通过该技术，我们可以确定蛋白质与DNA的结合位点，并进一步了解这些结合位点在基因调控中的作用。

二、实验步骤1. 交联：首先，将细胞或组织交联，使DNA与蛋白质相互交联形成复合物。

这一步骤可以使用甲醛等交联剂进行。

2. 染色质免疫沉淀：将交联后的细胞或组织进行裂解，使DNA与蛋白质分离。

然后，使用特异性抗体与目标蛋白质结合，形成抗原抗体复合物。

接着，使用磁珠或琼脂糖柱等材料，将抗原抗体复合物与其他非特异性结合的蛋白质和DNA分离。

3. 反交联：将抗原抗体复合物中的DNA与蛋白质进行反交联，使其分离。

这一步骤可以通过高温或酶切等方法进行。

4. DNA纯化：将反交联后的DNA进行纯化，去除杂质。

可以使用酚/氯仿等方法进行DNA的提取和纯化。

5. DNA测序：将纯化后的DNA进行高通量测序。

通过测序，可以得到大量的DNA片段序列。

6. 数据分析：对测序得到的数据进行分析，包括数据过滤、比对和富集分析等。

通过对数据的分析，可以确定蛋白质与DNA的结合位点，并推测这些结合位点在基因调控中的功能。

三、应用1. 确定转录因子结合位点：转录因子是调控基因表达的关键蛋白质，chip-seq可以用来确定转录因子与DNA的结合位点。

通过分析转录因子的结合位点，我们可以了解基因调控网络的组成和功能。

2. 研究组蛋白修饰：组蛋白修饰是一种重要的基因调控机制，chip-seq可以用来研究组蛋白修饰与DNA的相互作用。

通过分析组蛋白修饰的分布情况，我们可以了解基因的激活或抑制状态。

3. 鉴定染色体可及性：染色体的可及性是指染色体上的DNA片段是否容易被蛋白质结合。

免疫共沉淀实验流程--chip

染色体免疫共沉淀（Chip）实验报告步骤一：样品准备试剂和仪器：Biopulverizer(biospec)37% formaldehyde甘氨酸(Glycine)PBSprotease inhibitors步骤二：细胞交联1. 向客户提供的细胞沉淀中加入1ml 细胞培养基，混匀细胞后转移到15ml离心管中。

2. 向15ml离心管中加入270ul 37%甲醛溶液，使得甲醛的终浓度为1%，室温温育10min。

3. 向反应体系中各加入505ul 2.5M甘氨酸到终浓度为125mM，室温温育5min以终止交联反应。

4. 135x g，4°C离心10min，去上清，并用冰冷的10ml 1XPBS迅速漂洗两次。

5. 吸净PBS后，加入1ml PBS+protease inhibitors混合液，并转移到1.5ml离心管中。

800Xg，4°C离心5min，小心去掉上清。

步骤三：细胞裂解试剂:裂解缓冲液1: 50mM Hepes-KOH pH7.5; NaCl 140mM; EDTA 1mM; glycerol 10%;NP-40 0.5%;Tritonx -100 0.25%。

裂解缓冲液2: 10mM Tris-HCl pH8.0; NaCl 100mM; EDTA 1mM pH8.0; Na-Deoxycholate 0.1% Protease inhibitors。

步骤:1. 加入蛋白酶抑制剂(终浓度为1x) 到所有的裂解缓冲液中。

2. 用1ml的裂解缓冲液1重悬上述处理的样品，4°C旋转混合10min后，800g，4°C离心5min，弃上清。

3. 用300ul 裂解缓冲液2重悬样品，冰上放置30min。

步骤四：超声破碎ＤＮＡ仪器:Bioruptor(Diagenode)步骤:(1)、将超声仪器Bioruptor 调到中档“Mid”(M)。

(2)、在超声池中注入一定量的冰水。

染色体免疫共沉淀(chip)步骤

染色体免疫共沉淀(chip)步骤
染色体免疫共沉淀（ChIP）是一种常用的实验技术，用于研究染色体上特定蛋白质与DNA的相互作用。

以下是染色体免疫共沉淀的基本步骤：
1. 交联：将细胞或组织与形成蛋白质-DNA复合物的交联剂（如甲醛）处理，使蛋白质与DNA之间形成致密的交联。

这一步骤有助于保持蛋白质与DNA的相互作用并固定其在细胞或组织中的位置。

2. 细胞破碎和核裂解：将交联后的细胞或组织进行破碎和核裂解，以释放细胞内的染色质。

这可以通过机械方法（如超声波处理）或化学方法（如利用细胞裂解缓冲液和蛋白酶进行破碎）完成。

3. 免疫共沉淀：在破碎的细胞或组织提取物中，加入特异性抗体，该抗体可以与目标蛋白质结合。

免疫抗体与目标蛋白质形成免疫复合物，并与形成蛋白质-DNA复合物的目标区结合。

4. 洗涤：通过一系列洗涤步骤，去除非特异性和非特定结合的蛋白质和核酸，以减少背景信号的干扰。

5. 解交联：通过加热或酶处理等方法，解除细胞或组织中的蛋白质-DNA交联，并将DNA释放出来。

6. DNA提取：通过加入DNA提取缓冲液和有机溶剂，从溶液中沉淀出DNA，并用适当的方法进行纯化和浓缩。

7. 分析：对提取的DNA进行进一步的分析，可使用PCR、测序等技术，以检测免疫共沉淀的蛋白质与目标DNA的相互作用。

这些步骤旨在允许研究人员从细胞或组织中获得特定蛋白质与DNA的结合信息，并进一步了解基因调控、表观遗传学等相关的生物学过程。

实际操作时，具体的步骤和条件可能会因实验目的和样本类型而有所不同。

因此，在进行染色体免疫共沉淀实验时，建议参考相关文献和实验室经验，以确保实验的准确性和
可重复性。

组织染色质免疫沉淀技术(chip)-步骤

Chip步骤组织裂解：1.新鲜组织。

切成1-3 mm3小块。

2.转移组织到50ML试管里。

加入10 ml of 1X PBS.3.加甲醛至终浓度为1%。

室温下转动15—20mins。

（10ul）4.加2.5 M Glycine至终浓度为0.125 M(终止交联)。

4°C下转动10mins。

（0.5ml）5.100 g, 4°C 离心样本5mins。

6.弃上清，取沉淀。

用45 ml 冰冻1X PBS和25 ml 冰冻1X PBS各洗一次。

离心弃上清。

7.再加入2 ml 冰冻1X PBS。

匀浆机裂解组织。

1000 rpm，4°C ，离心5 min。

弃上清。

8.细胞裂解液重悬细胞。

加入蛋白酶抑制剂PMSF (10 ul per ml), aprotinin (1 ul per ml) andleupeptin (1 ul per ml).冰上孵育10-15mins9.5,000 rpm ，4°C离心5分钟。

取沉淀10.细胞核裂解液重悬细胞加入（8）中的蛋白酶抑制剂。

冰上孵育10-20mins。

11.接下来就进去超声过程了。

（接下来第一天的5）第一天1.细胞中加入1%的甲醛，8ml的培养液加入216 ul的甲醛，37度十分钟。

2.配制含有蛋白酶抑制剂的PBS 20 ml和含有蛋白酶抑制剂的SDS溶液1ml3.将细胞拿出来，迅速的移除含甲醛的培养基，加入含蛋白酶抑制剂的PBS洗两遍。

胰酶消化20秒，加入含蛋白酶抑制剂的PBS 1ml。

用细胞刮刀把细胞刮下，收集到1.5ml的离心管里面。

4.4度2000rpm离心10min，弃上清液，加入200ul含蛋白酶抑制剂的ＳＤＳ溶液。

吹打重悬细胞，冰上孵育１０分钟。

5.超声切割ＤＮＡ，总切割时间４min30sec，超声10sec,间隙10sec。

6.4度13000rpm离心10min，转移上清液到一个新的2ml的离心管，弃沉淀。

（原创）染色质免疫共沉淀（CHIP）

（原创）染色质免疫共沉淀（CHIP）说明：以下实验方法使用了millipore公司的ChromatinImmunoprecipitation (ChIP) Assay Kit （Catalog #17-295）。

第一天（一）细胞的甲醛交联与超声破碎。

1、取出三个10cm平皿均匀种下细胞，在转录的最佳条件下培养，三个分别用来计数、对照、实验，待细胞数目达到约1×106时，直接加入270 μl 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有10 ml）；2、37℃孵育10min；3、吸尽培养基，用冰冷的PBS（临用之前加入蛋白酶抑制剂PMSF使终浓度达到1mM）清洗细胞2次；4、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中，预冷后2000rpm 4℃离心 5min收集细胞；同时将SDS LysisBuffer从冰箱中取出平衡至室温；5、倒去上清，加入200 μl SDS LysisBuffer（对应细胞数为1×106，可以按照实际细胞数进行倍增）裂解细胞，并保证加入蛋白酶抑制剂PMSF，冰上孵育10 min；6、超声破碎：VCX750，25%功率，4-5S冲击，9S间隙。

共14次，使DNA断裂成200-1000bp的片段，（第一次试验前可以加入8μl 5 M NaCl，65℃水浴4 h解交链，然后提取DNA进行电泳检测，以获得最适的超声破碎条件）。

（二）除杂及抗体哺育。

7、超声破碎结束后，13000 rpm 4℃离心10 min，转移上清至2 ml离心管中，取做实验，其余可以保存于-80℃冰箱中；8、300 μl中，100 μl加抗体作为实验组；100 μl不加抗体做为对照组；100 μl加入4 μl 5 M NaCl（NaCl终浓度为0.2M），65℃处理4 h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果；9、在100 μl的离心上清液中，加入900 μl ChIP DilutionBuffer 和20 μl的50×PIC，再各加入60 μl ProteinA Agarose。

染色质免疫共沉淀技术

染色质免疫共沉淀技术染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是一种广泛应用于生物学研究的技术，它可以用来检测蛋白质与染色质之间的相互作用。

该技术能够帮助研究人员确定蛋白质在基因表达中的作用，以及探究细胞的调节机制。

本文将详细介绍染色质免疫共沉淀技术的原理、步骤、优缺点和应用。

一、原理染色质免疫共沉淀技术是基于抗体特异性识别蛋白质的原理。

在该技术中，首先将抗体与磁珠或琼脂糖等载体结合，形成免疫复合物。

接着，将该免疫复合物加入到含有细胞或组织的裂解液中，使其与目标蛋白结合。

随后，使用磁力或离心等手段将免疫复合物与与其结合的蛋白、核酸等分离出来。

最后，利用PCR、微阵列芯片等技术对分离出来的蛋白、核酸等进行检测和分析。

二、步骤染色质免疫共沉淀技术的步骤主要包括：1. 细胞或组织的裂解：将细胞或组织加入到含有蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、盐和缓冲液等的裂解液中，使其破裂并释放出蛋白、DNA等。

2. 免疫复合物的制备：将抗体与磁珠或琼脂糖等载体结合，形成免疫复合物。

3. 免疫复合物与目标蛋白的结合：将免疫复合物加入到裂解液中，与目标蛋白结合。

4. 免疫复合物的分离：使用磁力或离心等手段将免疫复合物与与其结合的蛋白、核酸等分离出来。

5. 分析：利用PCR、微阵列芯片等技术对分离出来的蛋白、核酸等进行检测和分析。

三、优缺点染色质免疫共沉淀技术具有以下优点：1. 高特异性：该技术可以通过抗体特异性识别蛋白质，具有高特异性。

2. 高灵敏度：该技术可以检测到极低浓度的蛋白质。

3. 可重复性：该技术具有较高的可重复性，可以用于多次实验。

4. 可广泛应用：该技术可以应用于不同种类的细胞和组织。

然而，染色质免疫共沉淀技术也存在以下缺点：1. 受抗体质量限制：抗体的质量、特异性和亲和力等因素会影响该技术的结果。

2. 受组织分解程度限制：组织分解不彻底会导致目标蛋白无法完全释放，从而影响该技术的结果。

3. 受背景干扰影响：免疫复合物的制备和分离过程中，可能会出现背景干扰，影响结果的准确性。

ChIP具体操作流程

ChIP具体操作流程ChIP（染色质免疫沉淀）是一种用于研究染色质蛋白质与DNA相互作用的实验方法。

下面是ChIP的具体操作流程：1.细胞或组织处理：a.培养或收集要研究的细胞或组织。

b.如有需要，对细胞或组织进行处理，如刺激、药物处理等。

2.交联：a.向培养细胞或组织中加入足量的交联剂，如甲醛，使染色质与蛋白质交联。

b.在室温下轻轻摇动培养细胞或组织，使交联剂充分混合。

3.停止交联：a.加入甘氨酸或甘氨酸盐酸盐来中和剩余的交联剂。

b.在室温下继续摇动培养细胞或组织。

4.细胞或组织裂解：a.用裂解缓冲液裂解交联细胞或组织，释放出染色质。

b.在冰上孵育细胞或组织，使细胞或组织裂解。

5.染色质切割：a.使用限制性内切酶或超声波将染色质切割成较小的片段。

b.在室温下孵育样品，使切割反应进行。

6.免疫沉淀：a.加入特异性抗体（抗目标蛋白）到裂解的细胞或组织中，与目标蛋白结合。

b.在4℃下孵育样品，使抗体与目标蛋白结合。

c.加入蛋白A/G琼脂糖磁珠，使其与抗体-蛋白质复合物结合。

d.在4℃下孵育样品，使磁珠与抗体-蛋白质复合物结合。

7.洗涤：a.使用洗涤缓冲液洗涤磁珠，去除非特异性结合的蛋白质和DNA。

b.重复洗涤步骤，至少洗涤3次。

8.去交联：a.加入适量的去交联缓冲液，去除染色质与蛋白质的交联。

b.在65℃下孵育样品，使染色质与蛋白质解交联。

9.DNA纯化：a.使用DNA提取试剂盒提取免疫沉淀后的DNA。

b.按照提取试剂盒的操作手册进行操作。

10.DNA定量和质检：a.使用紫外可见光谱仪或荧光光度计测量提取的DNA的浓度。

b.使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的大小和纯度。

11.DNA分析：a.使用PCR、实时荧光PCR、测序等方法对ChIP后的DNA进行分析。

b.根据需要选择适当的方法进行进一步的分析。

需要注意的是，不同实验室可能会有一些微小的差异或优化步骤，这些步骤可能根据具体实验要求而有所不同。

此外，ChIP实验是一个复杂的过程，需要仔细操作和严格控制实验条件，以确保结果的准确性和可重复性。

染色质免疫共沉淀技术原理

染色质免疫共沉淀技术原理一、前言染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是生物学研究中常用的一种方法，它通过利用抗体特异性识别染色质上的特定蛋白质，进而从复杂的细胞核提取物中富集这些蛋白质，并对其进行鉴定和分析。

本文将详细介绍染色质免疫共沉淀技术的原理。

二、实验步骤1. 交联首先，需要对活细胞进行交联处理，以稳定染色质和蛋白质之间的相互作用。

常用的交联剂有甲醛和二氧化硅等。

2. 染色质片段化接下来，需要将交联后的细胞进行裂解，并将DNA片段化。

这可以通过超声波或者限制性内切酶等方法实现。

3. 免疫共沉淀然后，在裂解液中加入与目标蛋白特异性结合的抗体，并进行免疫共沉淀。

在共沉淀过程中，目标蛋白和与其结合的DNA片段会被富集到抗体上。

4. 分离DNA片段接下来，需要将DNA片段从抗体上分离出来。

这可以通过加入盐或者进行热处理等方法实现。

5. 鉴定和分析最后，对富集的DNA片段进行鉴定和分析。

这可以通过PCR扩增、测序或者芯片技术等方法实现，以确定目标蛋白在染色质中的作用位置和作用方式。

三、原理解析1. 抗体选择ChIP技术的核心是抗体的选择。

抗体需要特异性识别目标蛋白，并保持其活性。

通常情况下，使用多个不同来源的抗体可以提高富集效率和准确性。

2. 交联原理交联是通过甲醛或二氧化硅等化学物质与细胞核内的DNA、蛋白质发生共价结合而实现的。

交联后的染色质会更加稳定，避免了在裂解过程中DNA和蛋白质之间失去相互作用。

3. 片段化原理染色质片段化是为了将长链DNA切成适当大小的小片段，以便于后续步骤中与抗体结合并富集目标蛋白。

超声波法利用高频声波震荡使DNA分子破碎，而限制性内切酶法则利用特定的酶切割位点切割DNA分子。

4. 免疫共沉淀原理免疫共沉淀是利用抗体与目标蛋白之间的特异性结合，将目标蛋白及其相关DNA片段从裂解液中富集到抗体上。

这一步骤需要注意选择合适的抗体和免疫共沉淀条件，以提高富集效率和准确性。

5. DNA片段分离原理将DNA片段从抗体上分离出来是为了进一步进行后续鉴定和分析。

染色质免疫沉淀技术

染色质免疫沉淀技术介绍染色质免疫沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是一种用于研究染色质上特定蛋白质与DNA的相互作用的实验方法。

通过该技术，我们可以确定某个蛋白质在染色质上的结合位点，进而探究基因表达调控、表观遗传学和疾病发生等重要生物学问题。

ChIP的原理ChIP技术的基本原理是利用特异性抗体与目标蛋白质结合，然后通过免疫沉淀的方式将蛋白质及其结合的DNA分离出来。

具体步骤如下：1. 交联首先，将细胞或组织进行交联，使得染色质上的蛋白质与DNA形成稳定的结合。

常用的交联剂包括甲醛和二氧化硅。

2. 细胞裂解将交联后的细胞或组织进行裂解，释放出染色质。

3. DNA切割使用限制性核酸内切酶或超声波等方法将染色质切割成小片段。

切割后的DNA片段长度通常在200-1000碱基对之间。

4. 免疫沉淀将特异性抗体与目标蛋白质结合，形成抗原-抗体复合物。

然后将抗原-抗体复合物与染色质中的目标蛋白质结合的DNA片段一起免疫沉淀。

5. 分离DNA通过洗涤等步骤将非特异性结合的DNA片段去除，保留与目标蛋白质结合的DNA片段。

6. 解交联去除染色质与蛋白质的交联，使得DNA片段恢复单链状态。

7. DNA纯化将解交联后的DNA片段进行纯化，去除杂质。

8. DNA分析通过PCR、测序等方法对免疫沉淀得到的DNA片段进行分析，确定目标蛋白质结合的DNA序列。

应用ChIP技术在生命科学研究中得到了广泛应用，尤其是在以下领域：1. 基因表达调控通过ChIP技术，可以确定转录因子与染色质上的结合位点，进而揭示基因的调控机制。

研究人员可以通过ChIP-Seq等方法，高通量地鉴定转录因子结合位点，从而识别出与特定基因调控相关的转录因子。

2. 表观遗传学ChIP技术可以用于研究染色质修饰与基因表达调控之间的关系。

例如，通过ChIP-Seq可以鉴定出与DNA甲基化和组蛋白修饰相关的位点，进一步探究这些修饰与表观遗传学调控的机制。

染色质免疫共沉淀ChIP中文操作流程

染色质免疫共沉淀ChIP中文操作流程1.细胞中加入1%的甲醛，8ml的培养液加入216 ul的甲醛，37度十分钟。

2.配制含有蛋白酶抑制剂的PBS 20 ml和含有蛋白酶抑制剂的SDS溶液1ml3.将细胞拿出来，迅速的移除含甲醛的培养基，加入含蛋白酶抑制剂的PBS洗两遍。

胰酶消化20秒，加入含蛋白酶抑制剂的PBS 1ml。

用细胞刮刀把细胞刮下，收集到1.5ml 的离心管里面。

4.4度2000rpm离心10min，弃上清液，加入200ul含蛋白酶抑制剂的ＳＤＳ溶液。

吹打重悬细胞，冰上孵育１０分钟。

5.超声切割ＤＮＡ，总切割时间４min30sec，超声10sec,间隙10sec。

6.4度13000rpm离心10min，转移上清液到一个新的2ml的离心管，弃沉淀。

7.稀释超声后的上清液到10X的CHIP稀释液，200ul的上清液加入1.8ml的CHIP稀释液，达到最终体积2ml。

8.为去除非特异性，加入75ul的Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry，4度旋转30分钟。

9.1000rpm离心3min沉淀Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry，收集上清液。

10.上清液加入1抗，4度振荡过夜。

11.加60ul的Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry，沉淀抗体/抗原复合物，4度旋转一小时。

12.1000rpm 4度3min收集沉底，移除上清液，开始洗脱过程。

13.低盐免疫复合物洗脱液，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀14.高盐免疫复合物洗脱液，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀15.Licl免疫复合物洗脱液，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀16.TE Buffer，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀，两次17.现在得到的是protein A/antibody/histone/DNA complex，新制备elution buffer (1%SDS,0.1M NaHCO3)。

染色体免疫沉淀 ChiP

ChIP实验流程如下图所示，具体操作步骤包括：
第一步、细胞的甲醛固定
交联所用的甲醛终浓度约为1%，而交联时间需要预实验来确定。

交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失。

交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。

甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。

通常的交联条件为室温10 min。

第二步、超声波断裂染色质
甲醛交联后的染色质对限制酶和DNase I高度抵抗，因此通常使用超声使得染色质断裂。

超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。

所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的超声程序，保证低温。

总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。

打断后的染色质片段的长度主要集中在200-1000bp左右(可以用琼脂糖凝胶电泳来鉴定)。

第三步、用特异性抗体与目的蛋白结合，免疫沉淀蛋白和DNA复合物。

抗体的量要进行优化，防止非特异的结合。

用Protein-A/G Sepharose回收免疫沉淀复合体。

经过洗涤除去非特异结合的染色质。

第四步、65℃解交联蛋白质和DNA复合物，消化蛋白质，纯化富集的DNA。

在免疫沉淀复合体中加人不含DNase的RNase和蛋白酶K，65℃保温6h以上，使交联逆转。

交联逆转后用QIAquick DNA cleanup system纯化回收DNA。

纯化的DNA极少，可用NanoDrop® ND-1000仪定量。

染色质免疫共沉淀实验方法

染色质免疫共沉淀实验方法
染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是一种用于研究染色质调控因子与DNA结合的实验技术，主要用于研究转录因子与DNA结合位点的相互作用。

以下是染色质免疫共沉淀实验的主要步骤：
1. **样品准备**：对细胞进行特殊处理，使之成为适合进行基因转录的“活动”状态，然后进行细胞裂解，使染色体变得更为疏松，同时加入抗体。

2. **免疫沉淀**：将处理过的细胞裂解物与特异性抗体混合，利用免疫沉淀将与该抗体结合的DNA片段富集。

3. **DNA回收**：利用纯化的ChIP-enrich样品中是否含有待检定的靶基因的DNA片段。

4. **基因组DNA的回收和鉴定**：通过PCR或测序等方法对ChIP产物进行检测，鉴定是否存在靶基因的DNA片段。

如果存在，即可说明该转录因子能够结合到该基因的DNA上。

5. **基因组DNA的再次检测**：可以通过QPCR或高通量测序等方法，进一步验证ChIP实验结果的准确性。

需要注意的是，在实验过程中，抗体的选择非常重要，通常使用针对蛋白质的特异性抗体，如针对转录因子的抗体。

同时，实验需要严谨的操作流程和质量控制，以确保实验结果的准确性。

此外，染色质免疫共沉淀技术也可通过使用特异性核酸探针或引物进行高通量测序的方法进行大规模基因组研究。

以上内容仅供参考，建议咨询专业人士以获得更准确的信息。

CHIP染色质免疫共沉淀实验 Protocol

CHIP染色质免疫共沉淀实验是一种在全基因组水平上研究蛋白质与DNA相互作用的技术方法。

其实验原理是基于抗原抗体反应的特异性，从而实现对DNA结合蛋白及其DNA靶标的富集。

实验所需试剂和耗材包括：细胞培养及提取试剂、生物素标记试剂盒、抗体、蛋白质A琼脂糖珠、Triton X-100、ECL显影液等。

实验仪器包括：二氧化碳培养箱、倒置显微镜、离心机、染色质免疫沉淀仪等。

实验准备工作的要点包括：首先，要确认所用试剂和耗材的型号和保质期；其次，要确保细胞株和抗体的选择合适；最后，准备好实验所需的仪器设备并调试至最佳状态。

实验方法主要包括以下步骤：1.将细胞进行培养并提取染色质。

2.在染色质中加入对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，并用Triton X-100将抗原抗体混合物进行稀释。

3.在混合物中加入蛋白质A琼脂糖珠，以便吸附多余的抗体和未结合的蛋白质。

4.用洗涤液洗涤沉淀物，去除未结合的蛋白质和抗体，最后用变性液洗脱DNA。

5.用电泳法和显影法检测提取出的DNA片段。

注意事项包括：要保持细胞生长状态良好，并确保抗原抗体反应的时间和温度准确适宜；在加入蛋白质A琼脂糖珠后，要充分混匀以避免影响实验结果；最后，要注意控制好电泳参数和显影条件以保证结果的准确性和可靠性。

常见问题及解决方法包括：如果抗原抗体反应不充分，可以尝试增加抗体浓度或延长反应时间；如果未结合的蛋白质不能被有效清除，可以尝试增加洗涤次数或更换洗涤液；如果电泳条带不清晰或出现异常，可以尝试调整电泳参数或更换电泳液。

总之，CHIP染色质免疫共沉淀实验是一种研究蛋白质与DNA相互作用的有效方法，需要注意保持细胞生长状态良好、准确控制抗原抗体反应条件、充分洗涤未结合的蛋白质等关键点。

同时，针对实验中可能遇到的问题，要积极采取相应的解决方法，以保证实验结果的准确性和可靠性。

染色质免疫共沉淀(ChIP)实验

染色质免疫共沉淀（ChIP）染色质免疫共沉淀可以：（1）组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”；（2）转录调控分析；（3）药物开发研究；（4）DNA损失与凋亡分析。

1实验方法原理：在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。

目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

2实验材料、试剂、仪器耗材：细胞样品甲醛、甘氨酸、PBS、SDS、Lysis Buffer、洗脱液、RNaseA、蛋白酶K、omega胶回收试剂盒等离心管、超声仪、电泳仪、离心机等3实验步骤：一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天）1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。

2. 37℃孵育10 min。

3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。

450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。

混匀后，在室温下放置5 min即可。

4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。

预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。

6. 倒去上清。

按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。

使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。

这样每100 ul溶液含1×106个细胞。

再加入蛋白酶抑制剂复合物。

假设MCF7长满板为5×106个细胞。

本次细胞长得约为80%。

即为4×106个细胞。

因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。

ChIP_原理及实验方法

ChIP_原理及实验方法ChIP（Chromatin Immunoprecipitation）是一种常用的分子生物学实验技术，用于研究蛋白质与染色质之间的相互作用。

它可以帮助我们了解基因的表达调控机制，以及特定蛋白质在染色质上的分布情况。

本文将详细介绍ChIP的原理及实验方法。

一、原理ChIP实验的基本原理是通过交联染色质上的蛋白质与DNA分子，然后用特异性抗体将蛋白质-DNA复合物沉淀下来，最后通过PCR或测序等方法检测目标DNA序列的富集情况。

ChIP实验的步骤包括：交联、裂解、免疫沉淀、洗涤和DNA分离等。

具体步骤如下：1.交联：将细胞或组织进行交联，使得染色质上的蛋白质与DNA形成稳定的交联复合物。

常用的交联剂包括甲醛和二甲亚砜。

交联后，用甲醛或二甲亚砜进行破交联，使得蛋白质与DNA分离。

2.裂解：将细胞或组织裂解，释放出染色质，并将染色质切割成适当的片段。

常用的裂解方法包括机械裂解、酶裂解和超声波裂解等。

3.免疫沉淀：将特异性抗体与染色质中的目标蛋白质结合，形成蛋白质-DNA复合物。

免疫沉淀的条件需要优化，包括抗体浓度、缓冲液成分和温度等。

4.洗涤：将免疫沉淀得到的蛋白质-DNA复合物进行洗涤，去除非特异性结合的蛋白质和杂质。

5.DNA分离：将洗涤后的蛋白质-DNA复合物进行解交联，并纯化出目标DNA序列。

常用的方法包括蛋白酶K处理、蛋白质酶解和PCR等。

二、实验方法ChIP实验的方法流程如下：1.细胞或组织处理：根据研究目的，选择合适的细胞系或组织样本，并进行相应的处理。

例如，可以添加药物、诱导表达或处理刺激等。

2.交联：将细胞或组织用1%甲醛溶液交联15-30分钟，停止交联反应，然后加入0.125M甘氨酸进行孵育10分钟。

3.裂解：将细胞或组织裂解，释放出染色质。

可使用适当的细胞裂解缓冲液，如SDS缓冲液、NP-40缓冲液或胶体缓冲液。

4. 切割染色质：使用限制性内切酶或超声波等方法将染色质切割成适当的片段。