免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理.
免疫组化实验报告范文
免疫组化实验报告范文一、实验名称。
免疫组化（Immunohistochemistry）实验。
二、实验目的。
1. 学习和掌握免疫组化的基本原理和实验操作流程。
2. 通过免疫组化染色方法，检测组织切片中的特定蛋白表达情况。
三、实验原理。
免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究。
简单来说，就像是给我们想要找的蛋白分子安上一个“小标签”，这个“小标签”还能发出信号让我们看到，这样就能知道这种蛋白在组织里到底在哪里，多还是少啦。
四、实验材料。
1. 组织样本：[具体组织名称]的石蜡切片。
2. 试剂。
一抗（针对目标蛋白的特异性抗体）。
二抗（与一抗特异性结合，并且带有标记物的抗体，这里我们用的是[标记物类型，比如辣根过氧化物酶标记]）。
DAB显色剂（辣根过氧化物酶的底物，能在酶的催化下产生棕色沉淀，这样就能显示出目标蛋白的位置啦）。
抗原修复液（用于暴露被石蜡包埋过程中可能被掩盖的抗原表位）。
封闭液（防止非特异性结合，一般是用血清）。
PBS缓冲液（用于清洗切片，就像给切片洗个澡，把不需要的东西冲走）。
3. 仪器设备。
光学显微镜。
恒温箱。
移液器。
五、实验步骤。
# （一）石蜡切片脱蜡至水。
1. 把石蜡切片放到二甲苯Ⅰ中浸泡10分钟，这时候切片就像是在“泡澡”，二甲苯就像强力清洁剂，把石蜡都溶解掉。
然后再放到二甲苯Ⅱ中浸泡10分钟，确保石蜡去得干干净净。
2. 经过二甲苯的洗礼后，切片再依次放入100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中各浸泡5分钟，就像从高浓度的酒慢慢过渡到低浓度的酒里，最后再用蒸馏水冲洗，这个过程就像是给切片逐渐“解酒”，让它慢慢适应水环境。
# （二）抗原修复。
1. 将切片放入盛有抗原修复液的容器中，放到微波炉里加热。
这个过程可有点像给蛋白分子做“按摩”，让那些被石蜡藏起来的抗原位点暴露出来。
免疫组化技术及注意事项
免疫荧光染色法常用的有直接法和间接法
延髓A2区中Fos和TH荧光染色
大 脑 神 经 干 细 胞
亲和组织化学法
是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力 为基础。
这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体) 在细胞或亚细胞水平的定位。
常用的有：亲和素-生物素-过氧化物酶复合物 技术 (ABC法)、链亲和素-生物素-过氧化物酶
抗体的实际使用范围：IHC-P, IHC-Fr, ICC, IF, IP, WB, E
特异性，交叉反应 一抗、二抗都能找到对应动物源后再订购
索取抗体
一般已发表文献中描述的抗体，只需向作者礼 貌地提出申请均能获得，只有当多抗已用尽或 供应非常短缺，作者才会婉转拒绝。
制备抗体 多克隆抗体的制备 多克隆抗肽的抗血清是用天然蛋白抗原或肽 -载体蛋白偶联物作为抗原来制备得来的。 可应用肌肉注射和皮下组织注射免疫法制备 抗血清，然后用亲和层析法进行特异性抗体 纯化 制备抗肽抗体的流程图
脑立体定位 冰冻切片
减少冰晶:速冻或20~30%蔗糖溶液4 ℃脱水 防止切片脱落：清洗载玻片，粘附剂处理
脑切片染色：中性红、焦油紫、苏木精等
中 性 红 染 色 的 大 鼠 脑 切 片
2.2 免疫组化的方法
贴片法： 孵育盒放平，防止切片干涸
漂片法：轻摇小瓶或培养板，使切片充分接触抗 体，冲洗充分
2.3 抗体最佳稀释度确定
直接测定法：用已知阳性抗原切片进行免疫染色，标 准是该浓度可使抗原特异且明显染色但背景无染色
一抗稀释度 1:100 1:500 1:1000 1:2000 1:3000
阴性对照
特异性染色 ++++ ++++ ++++ +++ ++ (-)
免疫学方法
免疫学方法免疫学是研究生物体对抗外源性病原体和异物的免疫应答机制的科学。
免疫学方法是研究免疫学过程和免疫学问题的一种手段，主要包括免疫学实验方法、免疫学检测方法和免疫学治疗方法等。
本文将从这几个方面对免疫学方法进行介绍。
一、免疫学实验方法。
1. 免疫细胞分离和培养。
免疫细胞分离和培养是研究免疫细胞生物学特性的重要方法。
通过离心、梯度离心、磁珠分选等技术，可以分离出各种免疫细胞，如T细胞、B细胞、巨噬细胞等，并进行体外培养，用于进一步的实验研究。
2. 免疫组化技术。
免疫组化技术是利用抗体与抗原特异性结合的原理，通过染色或荧光标记等方法来检测组织中特定抗原的分布和表达情况。
这项技术在病理诊断、免疫细胞定位等方面有着广泛的应用。
3. 免疫沉淀技术。
免疫沉淀技术是利用抗体与抗原特异性结合的原理，通过将抗体与抗原结合后沉淀下来，从而分离出特定的蛋白质或复合物。
这项技术在蛋白质相互作用、蛋白质结构分析等方面有着重要的应用。
二、免疫学检测方法。
1. ELISA法。
ELISA法是一种常用的免疫学检测方法，通过将待检样品中的抗原或抗体与固相载体上的特异性抗体或抗原结合，再加入酶标记的二抗或底物，通过酶的催化作用产生可检测的信号，从而进行定量或半定量的检测。
2. 免疫印迹法。
免疫印迹法是通过将待检样品中的蛋白质分离、转膜到膜上，然后用特异性抗体结合，最后通过化学发光或染色等方法来检测特定蛋白质的存在和表达水平。
3. 流式细胞术。
流式细胞术是一种利用流式细胞仪对细胞进行快速、高通量的检测和分析的方法，可以用于细胞表面标记物的检测、细胞周期分析、细胞凋亡检测等。
三、免疫学治疗方法。
1. 免疫抑制剂。
免疫抑制剂是一类能够抑制免疫系统功能的药物，常用于器官移植术后的免疫抑制治疗，以防止移植物排斥反应。
2. 免疫增强剂。
免疫增强剂是一类能够增强免疫系统功能的药物或治疗方法，常用于免疫功能低下或免疫缺陷性疾病的治疗，以增强机体抵抗能力。
免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理.
免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组化实验所用的抗体有哪些？免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。
单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。
多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
免疫组化常用的染色方法有哪些？根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。
这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。
抗体交叉反应的原因：指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。
产生的原因有以下几个方面：1. 抗原特异性指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子，它引起动物产生针对多种抗原分子特异性的相应抗体。
免疫组化和荧光
①防止标本从玻片上脱落；
②除去妨碍抗原-抗体结合的类脂，使抗
注意事项 原抗体结合物脱易水于用获梯得度良乙好醇的（染由色低结到果高；）充分脱
标 脱 脱 抗 细 灭 血 一 抗 切本水蜡原胞活清抗体片固、和修通内封和稀清定石水复透源闭二释洗防蜡化性抗液染溶目目止包过浓组。液造一中的标荧一生织织苏的成来有埋氧度是蛋光般气上浅D切木新背异后源交形白素和化和用泡滴A为染数3注②③④均片素旧景性续的叉成进提Bm中，一由过作得制物孵了色）意温冲P可使脂核上复、的染显用结，反为织不的原1抗抗钠i细行前n抗B性方滴于程用细0防 ， 尤 ： 柔 洗以抗质内有染目深色色一*T果血应了中全多抗体体防片酶育S0胞定衰3抗体树 法 封组中，胞r可③般时的止所为①冲的由体而，剩时标次浅较i时致的清的后抗易而次体稀稀腐t轮位退体稀o和时胶是片织，从内以固用即一以重单洗时PD能使故余间抗，和强间。n假中位面原出产回反释释剂廓，。就释H等直液中发而抗A溶定4可生间X抗适要独，间够抗在的要原而特而不一阳动点的等现生收应液液、和，经B%能液-封接，部生失原解的冲1、当，冲防要充体细位看的一孵异本是般性物发抗结局非利不用中B物多离从常0顺的片在然分了去决细标洗S二地一洗止足分及胞点当定0抗育性底固室；自生体合灶特用佳一除聚子而用利PA素、，载后抗蛋抗定胞本.抗加般，切够要一温地大免可时位孵一条染着定温封身结等反性异较，H而般P稳其甲强更苏水要进蛋避玻一原白原族测膜易B值等强在防片，，抗度进分疫以的等育抗件色色的1闭的合试应反性好终4定P中醛度好木、干入S白0免片手在之性重率4℃、于B可试清一止的才包孵、入子组与室情后孵决的较，血抗；剂。应背。而-剂外54的地素对净胞3S酶产组拿甲间；新。过m℃细保能剂洗抗交脱能括育抗胞结化一温况的育定深浅特0清体但能若和景正出等即，使对复组和内kim醛交通暴夜效胞n存偏残（孵叉落彻孵温体内构时抗、，清条。等一，不够脱浸着因现组可还用织锋氢较3i灭与一或联过露n和1果核。酸留延育反。底育度浓7进的尤非洗件通般预能充蜡洗色为假份，加。化和要利0则好活相℃般多及抗，从育最膜固m，而长前应可洗时有度行物为特均在透是先与分和不。这阴，但了氢要完。可。内应31聚醛原提i冰时佳片、定而引时的造用去n间：有结质推异为免0液0和能一与水全种性对专叠灭求全否以二源左抗m甲基修高~箱间；等细剂使起间清成浸结、关4合进荐性5疫。二和抗组化 ，原结抗用氮3活。浸则适抗i性右原℃次醛的复抗n拿过孵0。胞的抗非和洗污洗合温，反入使结组如抗组来因果-体的化时蜡，当m一P，结、1*固封，原出长育器选特增是染方的度一5应胞用合化ThO同织源，。i间、容延般n而合室mr。定闭使检后易时膜择D异多。式物和般；i。浆，，反t短切易长i室o0。温n一3引间上一性次；质抗3过一和这应n.。点73片裂封温、7般起：的℃%X。体氧般胞样中℃，时片闭或3-3过脱这复浓化最71%可刀和时℃-氧片与温2度氢重过以片脱间h，化。孵，氧，
免疫组织化学染色
免疫组织化学染色（IHC）定义：免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
免疫组化原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原-一抗-二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
免疫组化检测标本1、组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片；2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片。
免疫组化操作步骤①石蜡切片制作1、固定：取组织，用PBS冲洗，放入4% 多聚甲醛溶液内固定12 h。
2、脱水：倒去固定液，用蒸馏水冲洗3次，再用50%酒精冲洗2次，用酒精逐级脱水，70%酒精1 h，80%酒精1 h，95%酒精1 h，无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各1 h3、透明：1:1无水乙醇二甲苯溶液30 min，二甲苯溶液中10 min（组织块透明即可）。
病理报告提示做“免疫组化”，这是怎么回事
病理报告提示做“免疫组化”，这是怎么回事病理报告是判断患者肿瘤性质的关键依据，采取什么样的治疗方法、应用哪些治疗药物等都需要按照病理报告的结果来进行。
而在有些患者的病理报告中常常会提示到做“免疫组化”，“免疫组化”是什么？为什么要做“免疫组化”呢？下面就让我们一起来探讨探讨。
1什么是“免疫组化”“免疫组化”的全称是“免疫组织化学”，其最早于20世纪70年代就被运用在病理诊断当中了，具体指的是根据免疫学中抗原与抗体的特异性结合原理，采用一定的检测技术与方式对患者的组织细胞进行综合性的研究。
这个过程中所采用的技术方式为利用显色剂如荧光素、同位素等对细胞抗体进行显色标记，然后根据一定的标准确定细胞内多肽与蛋白质等抗原的性质，主要研究内容包括定位、定性和相对定量三个方面。
在病理报告中提示患者做“免疫组化”，主要是为了更进一步诊断与明确患者的病情，并为患者的疾病治疗、预后等环节提供参考，这一诊断技术的广泛运用充分体现了人们在肿瘤疾病研究中取得的进步成就，也代表了病理诊断水平的提升。
2“免疫组化”在病理诊断中的具体应用（1）诊断与鉴别诊断恶性肿瘤“免疫组化”可以帮助医生和患者诊断与鉴别诊断恶性肿瘤，患者检查出患得肿瘤后要想弄清楚它究竟是恶性的还是良性的，就需借助“免疫组化”技术进行诊断，在过去只依靠病理切片的观察来做判断，存在一定的不准确性，且对复杂性肿瘤无法做出准确诊断，而通过“免疫组化”不仅可以实现良性与恶性的诊断，而且还可以鉴别诊断出是淋巴癌、恶性黑色素瘤、小细胞癌等具体情况。
（2）病理分型“免疫组化”可以帮助医生和患者对肿瘤进行病理分型，由于临床上一些肿瘤的组织形态较为相似，如果仅用病理切片进行鉴别诊断容易出现判断失误，而通过免疫组化技术能够精准区分肿瘤类型，如对淋巴瘤和软组织肿瘤的区分等，从而为后续治疗方案以及预后措施的选择提供参考。
（3）明确恶性肿瘤组织来源“免疫组化”可以帮助医生和患者明确恶性肿瘤组织的真正来源，找到转移癌的病灶位置。
免疫组化的原理及操作规程
免疫组化的原理及操作规程免疫组化，即免疫组织化学染色技术，是一种利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（如荧光素、酶、金属离子、同位素等）显色，从而确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）的定位、定性及相对定量的研究方法。
该技术广泛应用于临床病理诊断、生物医学研究以及药物开发等领域。
本文将详细介绍免疫组化的原理及操作规程。
一、免疫组化的原理免疫组化的基本原理是抗原与抗体的特异性结合。
抗原是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）发生特异性结合的物质。
抗体是机体的免疫细胞在抗原刺激下产生的具有特异性识别能力的免疫球蛋白。
在免疫组化中，通常将目标抗原（如某种蛋白质或多肽）作为待检测物，通过特定的抗体与之结合，再利用标记技术使抗体可视化，从而实现对目标抗原的定位、定性和定量研究。
免疫组化的标记技术主要有直接法和间接法两种。
直接法是将标记物（如荧光素、酶等）直接标记在抗体上，使其与目标抗原结合后直接显色。
间接法则是利用未标记的抗体（一抗）先与目标抗原结合，然后再通过标记的二抗（与一抗特异性结合的抗体）与一抗结合，最终实现显色。
间接法具有更高的灵敏度和灵活性，因此在实际应用中更为常见。
二、免疫组化的操作规程免疫组化的操作规程主要包括以下几个步骤：1. 标本处理：根据实验需求选择合适的组织标本，并进行固定、脱水、包埋等处理，制备成组织切片或细胞涂片。
固定是为了保持组织或细胞的形态结构，防止抗原丢失；脱水则是为了去除组织中的水分，便于后续操作；包埋则是将组织块包裹在支持物（如石蜡）中，便于切片。
2. 抗原修复：由于固定和脱水等处理过程可能导致抗原表位的遮蔽或改变，因此在进行免疫组化染色前，需要对抗原进行修复。
常用的修复方法包括热修复、酶修复和酸修复等。
具体方法应根据实验需求和抗原性质进行选择。
3. 阻断内源性酶活性：为了避免组织内源性酶对后续显色反应的干扰，需要使用相应的阻断剂（如过氧化氢）对内源性酶活性进行阻断。
免疫组化原理及应用
象PAP法那样由抗酶血清制备而成，所以背景着色减少，
敏感性更高。
HRP HRP
ABC法：
HRP biotin
ABC复合物 马抗兔（二抗）
兔抗x（一抗）
⑥S-P法：是在ABC法的基础上进行了改进，第一、第二步
与ABC法相同，在第三步，将链酶卵白素直接与酶耦合在
一起，减少了操作步骤，进一步增加了灵敏度，现被广泛
应用。
HRP
HRP
S-P法：
SA
酶链卵白素
HRP
BT
羊抗鼠IgG（二抗）
BT 鼠抗x（一抗）
（三）具体操作步骤
以S-P法为例：
1. 石蜡切片脱蜡至水；
2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，（如需采用抗原修复，可 在此步后进行）；
3. 3活%性H；2O2室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的
4. 5-10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。 倾去血清勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液， 37℃孵育1-2小时或 4 ℃过夜；
HRP HRP
PAP法：
HRP
兔PAP复合物（三抗）
羊抗兔IgG （二抗）
兔抗 x
（一抗）
⑤ABC法：很早以前，人们就注意到给动物饲以大量的鸡蛋
白，会引起明显的“维生素H缺乏症”。经研究发现，在
鸡蛋白中含有一种碱性蛋白，分子量为68000，称卵白素
（avidin）。一个avidin分子上有4个biotin（生物素）结合
—HRP(FITC)
直接法：
②间接法：也称二步法。第一步用的是不标记的第一抗体， 第二步用标记有酶或荧光素的抗第一抗体同种动物IgG的 抗体。本方法的优点是在检测各种不同抗原时，只要第一 抗体是免疫同一类动物产物的抗体，均可应用相同的第二 抗体，不象直接法那样需对各种抗体逐个标记。此外由于 第一抗体的一个分子作为抗原可结合多个第二抗体分子， 故敏感性较直接法大为提高。
免疫组化染色原理
免疫组化染色原理免疫组化染色（Immunohistochemistry，简称IHC）是一种利用抗体与抗原间的特异性反应，通过对组织切片进行染色来检测和定位特定分子的方法。
它在病理学和生物医学研究中广泛应用。
免疫组化染色的原理基于抗原与抗体的特异性结合。
首先将待检测的组织切片进行固定和脱水处理，使得细胞结构的完整性得以保存。
然后，对切片进行抗原修复，以使被检测的抗原重新展开和暴露，以增强抗体的结合。
接下来，将特异性抗体加入样品中，并在恰当的温度和时间下进行孵育，使抗体与待检测的抗原发生结合。
为了检测抗原-抗体结合的位置，可以利用荧光染料或酶标记技术，使配体与抗体结合后的阳性信号得以观察。
在免疫组化染色中，常用的抗体标记方法包括酶标记、免疫荧光、金标记等。
酶标记法的原理是将酶标记的二抗与抗原-一抗复合物结合，然后通过染色底物使酶呈色，形成可见的颜色反应产物。
免疫荧光法则是使用荧光标记的二抗与抗原-一抗复合物结合，然后利用荧光显微镜观察荧光信号的分布，从而实现对抗原位置的定位。
金标记法则是将金标记的二抗与抗原-一抗复合物结合，然后使用增强剂，使金颗粒在光学显微镜下可见。
免疫组化染色可以用于检测和定位多种分子，例如细胞膜蛋白、核蛋白、细胞因子等。
它在病理诊断领域中被广泛应用，可以用于判断肿瘤类型、分子亚型和分级，以及评估免疫治疗的效果。
此外，免疫组化染色也在生命科学研究中发挥重要作用，帮助揭示细胞和组织的分子机制，探究疾病发生发展的机理。
总而言之，免疫组化染色利用抗体与抗原的特异性结合原理，通过染色方法可检测和定位特定分子在组织中的存在和分布。
它在病理学和生物医学研究中的广泛应用，为疾病诊断和相关研究提供了重要的实验手段。
免疫组化原理及步骤
免疫组化原理及步骤免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种利用抗体与抗原特异性结合的原理来检测组织中特定蛋白质的方法。
它在病理诊断、生物医学研究和药物研发等领域具有广泛的应用价值。
本文将介绍免疫组化的原理及实验步骤，希望能对相关领域的研究者和实验人员有所帮助。
免疫组化的原理主要基于抗体与抗原的特异性结合。
在免疫组化实验中，首先需要选择与目标蛋白特异性结合的一抗和二抗。
一抗与目标蛋白结合后，通过二抗与一抗结合，形成复合物，再通过酶标记或荧光标记的二抗来检测目标蛋白的表达情况。
免疫组化的关键在于选择合适的抗体，确保其对目标蛋白的特异性结合，从而实现对目标蛋白的定位和定量分析。
免疫组化实验的步骤通常包括组织标本的处理、抗原修复、蛋白质阻断、抗体染色、显色反应和显微镜观察等。
首先，组织标本需要进行脱水、蜡包埋和切片等处理，以保证标本的完整性和稳定性。
接下来是抗原修复步骤，通过高温、酶解或酸碱处理等方法，使组织中的蛋白质发生构象变化，从而有利于抗体的结合。
然后进行蛋白质阻断，通过使用牛血清白蛋白（BSA）或牛血清等，阻断非特异性结合位点，减少背景信号的干扰。
随后是抗体染色，将一抗和二抗依次加入标本中，使其与目标蛋白特异性结合。
再进行显色反应，根据酶标记或荧光标记的二抗，观察目标蛋白的表达情况。
最后通过显微镜观察，对标本进行定量分析和图像获取。
在进行免疫组化实验时，需要注意一些关键问题。
首先是抗原修复的选择，不同的抗原修复方法对不同类型的组织标本有不同的影响，需要根据实际情况进行选择。
其次是抗体的选择，需要确保抗体的特异性和敏感性，避免出现假阳性或假阴性结果。
此外，实验过程中需要严格控制各个步骤的时间和温度，避免影响实验结果的准确性。
最后，在观察和分析实验结果时，需要结合相关的对照组进行比较，以确保实验结果的可靠性。
总之，免疫组化作为一种重要的实验方法，在病理诊断和生物医学研究中有着广泛的应用前景。
免疫组化结果判定标准
免疫组化结果判定标准免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种利用抗体与抗原特异性结合的原理，通过染色反应来检测组织中特定蛋白质的方法。
它在病理诊断、疾病发病机制研究和药物靶点筛选等领域有着广泛的应用。
然而，免疫组化结果的判定标准对于结果的准确性和可靠性至关重要。
首先，免疫组化结果的判定标准应包括阳性和阴性对照。
阳性对照是用已知表达目标蛋白的组织作为对照，而阴性对照则是用不表达目标蛋白的组织作为对照。
这样可以确保实验条件的准确性，避免假阳性和假阴性结果的出现。
其次，判定标准还应考虑到染色的强度和分布。
染色强度一般分为强阳性、中阳性、弱阳性和阴性，而染色分布则包括细胞膜、细胞浆和细胞核等。
对于不同的标记物，其染色强度和分布的判定标准可能会有所不同，需要根据具体情况进行调整。
另外，对于免疫组化结果的判定标准还应考虑到组织学特征。
不同的组织在形态学上有着不同的特点，可能会对染色结果产生影响。
因此，在判定标准中需要考虑到组织的特异性，避免将正常组织误判为阳性或将肿瘤组织误判为阴性。
此外，对于免疫组化结果的判定标准还应考虑到实验操作的一致性和重复性。
在进行免疫组化实验时，需要严格控制实验条件，确保每次实验的操作流程和条件一致。
同时，还需要进行重复实验来验证结果的可靠性，避免由于偶然因素导致的结果偏差。
总的来说，免疫组化结果的判定标准对于结果的准确性和可靠性至关重要。
在制定判定标准时，需要考虑到阳性和阴性对照、染色强度和分布、组织学特征以及实验操作的一致性和重复性等因素。
只有制定科学合理的判定标准，才能保证免疫组化结果的准确性和可靠性，为临床诊断和科研工作提供可靠的依据。
免疫组化的原理及试验步骤
免疫组化的原理及实验步骤一免疫组化的原理免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
二免疫组化的实验步骤固定１．浸入式：将组织样本直接放入固定液（4%的多聚甲醛等固定液）内，4℃浸泡2小时，不超过12小时２. 灌注式：主要适用于脑部组织，用从心室灌注生理盐水排空血管中血液后灌注固定液切片1.石蜡切片：(1) 使用从低浓度到高浓度的乙醇使组织脱水；(2)将组织浸入二甲苯中透明；(3)在溶蜡箱中，组织被石蜡包埋；(4)将包埋好的蜡块冷却后固定于切片机上，切成薄片，并将薄片贴于玻片上；(5)用二甲苯脱蜡并重新从高到底浸泡乙醇；注意：石蜡切片制备好后还需要进行抗原修复以解开被甲醛交联的抗原决定簇上的氨基或羧基，常用方法有微波热修复，煮沸热修复，酶消化方法２. 冰冻切片：将固定的组织放入液氮或干冰-丙酮中迅速冷却，然后切片机切片，并将片贴于玻片上封固1.防止脱片，可以使用树脂胶或多聚赖氨酸进行黏附。
2.避免内源性过氧化酶的影响，可以用3%双氧水处理15min,(针对用过氧化酶标记的抗体)3.避免内源生物素的影响，可以鸡蛋清或卵白素进行封闭；4.避免非特异性染色，可以用二抗来源的血清进行封闭染色1.滴加稀释后的一抗，4℃过夜，PBS或者脱脂牛奶洗5min 3次；2.滴加稀释后的二抗，37℃孵育30min,PBS或者脱脂牛奶洗5min 3次；显色：选择与二抗配套的显色系统，进行反应，PBS终止反应后，用苏木素村然胞核，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，37℃干燥48小时，显微镜下观察。
免疫组织化学
免疫组织化学简介免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
主要过程免疫组织化学的全过程包括：1.抗原的提取与纯化；2.免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；3.将显色剂与抗体结合形成标记抗体；4.标本的相关操作免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
免疫组化技术近年来得到迅速发展。
50年代还仅限于免疫荧光技术，50年代以后逐渐发展建立起高度敏感，且更为实用的免疫酶技术。
仪器设备1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅试剂1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。
2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。
3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。
4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。
5）酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。
b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
免疫组化 HE染色
过夜。 • 5、PBS冲洗，5min×3次。 • 6、滴加适当比例稀释的生物素标记二抗，37℃孵育10-30min；或滴
加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10-20min。 • 7、PBS冲洗，5min×3次。 • 8、滴加SABC-FITC,37℃孵育10-30min，PBS冲洗5min×3次。 • 9、抗荧光萃灭封片液 封片，荧光显微镜观察。
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石蜡切片免疫组化DAB显色
血涂片，细胞，冰冻切片免疫组化
1、冰冻切片4-8µm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内， 或进行短暂预固定后储存于-20℃冰箱。
2、室温放置30min后，放入4℃丙酮或者4%多聚甲醛固定10-30min。 PBS冲洗5min×3次。
3、30%过氧化氢1份+纯甲醇50份混合，室温浸泡30min，以灭活内源性 过氧化物酶。蒸馏水洗2次。
5min×4次。 • 4、抗荧光萃灭封片液 封片，荧光显微镜观察。
冰冻切片荧光免疫组化
• 1、冰冻切片4-8µm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰 箱内，或进行短暂预固定后储存于-20℃冰箱。
• 2、室温放置30min后，放入4℃丙酮或者4%多聚甲醛固定10-30min。 PBS冲洗5min×3次。
2、我们现阶段主要要做的组织免疫组化有石蜡切片、冰冻切片免疫组 化以及荧光免疫组化。细胞免疫组化有细胞爬片、细胞印片和细胞涂 片免疫组化和荧光免疫组化。
3、免疫组化过程中抗原修复有高压修复法、酶修复、微波修复，其中 微波修复抗原对提高免疫组化阳性检出率非常有效。
免疫组化HE染色FISHISH演示文稿
免疫组化切片组织前期处理
1、组织块大小应限于2cm×1.5cm×0.2cm 。 2、应用于光镜的免疫组织化学染色的切片厚度一般要求5μm左右，神经
5min×4次。 • 4、抗荧光萃灭封片液 封片，荧光显微镜观察。
冰冻切片荧光免疫组化
• 1、冰冻切片4-8µm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰 箱内，或进行短暂预固定后储存于-20℃冰箱。
• 2、室温放置30min后，放入4℃丙酮或者4%多聚甲醛固定10-30min。 PBS冲洗5min×3次。
3、免疫组化过程中抗原修复有高压修复法、酶修复、微波修复，其中 微波修复抗原对提高免疫组化阳性检出率非常有效。
4、高压修复和微波修复法中常用的缓冲液有0.01M柠檬酸缓冲液、1mM 的EDTA（pH8.0）。
6、酶标抗体系统中的酶与显色剂、复染液的合理选用：
（1）辣根过氧化物酶系统（HRP）显色剂一般用DAB、AEC,DAB显色液一 般染色部位为棕黄色，AEC显色液一般染色部位为红色；而HRP系统常 用的复染液为苏木素，将细胞核染成蓝色。
6、组织透明：我们一般采用二甲苯透明，30-60min即可。
5、石蜡切片：浸蜡、包埋过程中，石蜡应保持在60℃以下，以熔点低的 软蜡较好,浸蜡时间1－4小时 。
6、冰冻切片：组织采用液氮法包埋。将未固定的组织放入OCT包埋剂中 对组织进行液氮包埋，包埋后放在-80度冰箱中贮存或者对其进行切 片。或者将组织置于20%-30%蔗糖溶液中1-3天，利用高渗吸收组织 中水分，减少组织含水量，再放入OCT包埋剂中进行包埋。
免疫组化报告如何看，这篇文章教你看懂
免疫组化报告如何看，这篇文章教你看懂我们知道，病理检查是医生临床诊疗的重要标准，尤其是对肿瘤患者来说，免疫组化报告结果，更是对肿瘤诊断、治疗、预后分析的主要参考，很多人在拿到报告单以后，看着各种符号与英文缩写，会陷入茫然，不清楚其表示的含义。
那么今天，就为大家简单科普一下，免疫组化报告应该怎样看。
1.什么是免疫组化？免疫组化，是应用抗原与抗体特异性结合的原理，通过显色剂，使标记抗体显色，确定细胞组织内抗原，而后进行定性定量与定性分析研究，也可以被称为免疫组织化学技术。
大多数情况下，免疫组化报告上的英语缩写，都是表示已经标记出的特异性抗原，也就是抗体。
那么我们为什么要做免疫组化呢？具体有几点：1.诊断、鉴别特性肿瘤，对患者的个人疾病情况进行一定的初步判断。
2.一些恶性肿瘤在形成以后，很有可能会发生转移，免疫组化可以确定原发部位，方便医生拟定治疗方案。
3.针对特殊类型的肿瘤，进行病理分型。
4.可以及时发现微小转移灶，这有助于医生更好的确定手术方案，保证手术成功。
5.更好的确定肌肉、韧带等一些软组织肿瘤的组织学分类，是进一步诊断的重要依据。
1.免疫组化检查与各自代表的意义目前，临床上关于免疫组化的系列检查有很多，无法意义列举，就主要为大家科普一下卵巢癌的检查内容，卵巢癌的免疫组化检查主要分为两种：第一种，恶性肿瘤的Ki-67和p53常规检查，根据已有的一些研究成果以及相关研究表明，肿瘤复发、转移可能性，主要取决于Ki-67和p53两项数值，但与肿瘤组织分型，并不存在密切关联。
以中分化腺癌为例，当Ki-67和p53超过50%，预后不佳；当Ki-67和p53较低，预后稍好。
受人群体质影响，预后不佳、预后稍好通常只是从理论上来进行判断的，具体还需要通过对患者进行详细检查，来最终确认。
第二种，耐药预后标记全套4项：P-gp，GSTπ，TOPOⅡ，Ki-67，这里所说的耐药，通俗来说，就是当你的耐药性较强时，药物为你带来的治疗效果就越弱，是一种反比的状态。
免疫组化原理及步骤
免疫组化原理及步骤免疫组化是一种常用于研究细胞和组织中蛋白质的定位、表达及定量的方法。
其原理基于抗原与抗体之间的特异性结合。
在进行免疫组化实验时，通常需经历如下步骤：1. 取样与制片：从待研究的组织或细胞中取得样本，并将其固定在载玻片或切片上，以便后续的实验处理。
2. 抗原恢复：某些样本经过固定处理后，可能会造成抗原的损失或掩盖。
因此，为了使抗原能更好地被抗体识别，常需要进行抗原恢复的步骤。
一般而言，常用的抗原恢复方法包括加热处理、酶解或化学处理等。
3. 阻断非特异性结合：为了避免非特异性的结合，需使用一些非特异性抗体或蛋白质（如牛血清白蛋白、胶原蛋白等）来阻断待测抗体结合样本中的非特异性位点。
4. 抗体标记与孵育：选择特异性与待测抗原结合的一抗体，并将其标记上可视化信号或发光染料等。
在将该标记抗体和样本一同孵育的过程中，待测抗原会与一抗体发生特异性结合。
5. 洗涤：通过洗涤步骤，去除与抗体无关的非特异性结合物，以减少背景信号的干扰。
6. 可视化和显色：对于免疫组化实验，最终需要将特异性结合的抗原或抗体定位，并使其可视化。
这可以通过结合染色剂、酶标记或荧光标记等方法实现。
7. 评价与分析：最后，通过显微镜观察和图像分析等手段，对标记结果进行定性或定量的评价与分析。
可以使用计算机软件进行图像处理和定量分析以获取更准确的数据。
总之，免疫组化的原理在于利用抗原与抗体的特异性结合来对蛋白质进行检测与定位。
在实验过程中，需要进行样本取样与制片、抗原恢复、非特异性结合阻断、抗体标记与孵育、洗涤、可视化和显色、评价与分析等一系列步骤。
这些步骤均为确保实验结果的准确性和可靠性所必需的。
免疫组化 HE染色 FISH ISH
HE染色
苏木精 — 伊红染色法 ( hematoxylin-eosin staining ，HE)是石蜡 切片技术里常用的染色法之一 。HE染色法是组织学、胚胎学、病理 学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。 HE染色的原理：脱氧核糖核酸（DNA）两条链上的磷酸基向外，带 负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合 而被染色。伊红是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷 的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染成红色或粉 红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。
• 3、5-10% 正常山羊血清封闭，室温孵育10-30min。倾去血清，勿洗。 • 4、滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1-2小时或4℃
过夜。 • 5、PBS冲洗，5min×3次。 • 6、滴加适当比例稀释的生物素标记二抗，37℃孵育10-30min；或滴
加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10-20min。 • 7、PBS冲洗，5min×3次。 • 8、滴加SABC-FITC,37℃孵育10-30min，PBS冲洗5min×3次。 • 9、抗荧光萃灭封片液 封片，荧光显微镜观察。
4、组织的固定：4%多聚甲醛固定一般1-2小时。固定后经充分的流水冲 洗后进行脱水包埋。
5、组织脱水：主要用不同梯度的酒精进行脱水。一般情况下，组织经过 70％，80％，90％，95％，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱 水的要求。但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液 体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次95％酒精，两次100％酒 精重复进行脱水，以保证组织的水分脱净。
免疫组化切片组织前期处理
1、组织块大小应限于2cm×1.5cm×0.2cm 。 2、应用于光镜的免疫组织化学染色的切片厚度一般要求5μm左右，神经
免疫组化(immunohistochemistry,IHC)
免疫组化（Immunohistonchemistry）是应用免疫学基本原理—抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
主要应用于以下方面:恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断;确定转移性恶性肿瘤的原发部位；对某类肿瘤进行进一步的病理分型；软组织肿瘤的治疗一般需根据正确的组织学分类，因其种类多、组织形态相像，有时难以区分其组织来源，应用多种标志进行免疫组化研究对软组织肿瘤的诊断是不可缺少的；发现微小转移灶,有助于临床治疗方案的确定,包括手术范围的确定；为临床提供治疗方案的选择。
服务内容
（1）组织标本的固定和石蜡包埋
（2）石蜡标本或冰冻标本的切片
（3）常规或特殊病理切片染色
（4）组织/细胞标本的免疫组化检测
（5)图片拍照及图片分析、数据统计
客户提供
组织或石蜡组织切片；细胞爬片；一抗
我们提供
（1)免疫组化所需的试剂
（2）免疫组化结果(实物）
（3）实验结果图片
（4)完整的实验过程及实验报告
服务内容
（1）组织标本的固定和石蜡包埋
（2）石蜡标本或冰冻标本的切片
(3)常规或特殊病理切片染色
（4）组织/细胞标本的免疫组化检测
(5）图片拍照及图片分析、数据统计
客户提供
组织或石蜡组织切片；
细胞爬片；
一抗
我们提供
（1）免疫组化所需的试剂
（2）免疫组化结果（实物）（3）实验结果图片
（4）完整的实验过程及实验报告。
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免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组化实验所用的抗体有哪些？免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。
单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。
多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
免疫组化常用的染色方法有哪些？根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。
这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。
抗体交叉反应的原因：指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。
产生的原因有以下几个方面：1. 抗原特异性指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子，它引起动物产生针对多种抗原分子特异性的相应抗体。
任何其它物质只要含有一种或多种与上述物质相同的抗原分子，必将与上述多特异性的抗血清发生交叉反应。
2. 共同决定簇即两种抗原分子中都含有相同的抗原决定簇。
3. 决定簇相似，两种不同的抗原决定簇，如果结构大致相同，由于空间构象关系，某一决定簇的相应抗体可以与大致相同的决定簇发生交叉反应。
当然抗原一抗体之间构象相似时的结合力小于吻合时的结合力。
欢迎常到免疫版讨论区做客我为人人，人人为我免疫细胞化学技术一、免疫细胞化学技术的概述*免疫细胞化学（immunocytochemistry, ICC）-是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定细胞内抗原的成分（主要是多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为～。
（一）对抗原和抗体的要求*具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。
-对抗体的要求：纯度高、比活性强；*高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。
-对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。
（二）抗原（antigen, Ag）*抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和（或）细胞免疫反应的物质，称为抗原。
抗原具有两个方面的特性：-免疫原性：引起机体产生抗体和（或）致敏淋细胞的特性；-免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。
*根据抗原是否显示免疫原性分为：-完全抗原：分子量较大，一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。
*免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。
-半抗原：又称为不完全抗原，分子量较小。
例如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。
*半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。
载体*通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。
-常用的载体有钥孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）、卵白蛋白（Ovalbumin，OVA）等。
-用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。
结合比例为5kDa结合5～25个分子的小肽。
（三）抗体（antibody, Ab）1、抗体的概念：*机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白，被称为抗体。
-抗体主要存在于血清内；-抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗体。
-免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、IgD、IgE、IgA、IgM。
2、免疫组化实验中常用的抗体：单克隆抗体和多克隆抗体。
*单克隆抗体：是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。
-特异性强、抗体产量高。
*多克隆抗体：是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
-特异性低，会产生抗体的交叉反应。
-多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。
-抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时，是不能聚合成大颗粒。
3、抗体的制备——多克隆抗体的制备*动物的选择*佐剂（adjuvant）*免疫方法*免疫剂量*抗体效价的测定*放血或定期抽血（1）动物的选择选择什么动物来免疫取决于：*所需抗血清的量-小鼠只能提供1.0～1.5ml的血液，而山羊能提供几升。
*能供免疫用的抗原量-小鼠50?g足够，而山羊需要几毫克。
（1）动物的选择（续）*动物的品系：免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。
-例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。
-常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔（新西兰兔，年轻，健壮，体重在2.5kg左右，雄性）为最常用。
（2）佐剂（adjuvant）*一般可溶性抗原注射后，迅速从注射部位扩散、吸收代谢。
佐剂可延长潴留时间，且延长免疫刺激作用。
因此在制备抗体的过程中，常将抗原和佐剂一起注射。
*最常用的佐剂是弗氏佐剂，又分为:-弗氏不完全佐剂（Freund＇s incomplete adjuvant）-弗氏完全佐剂（Freund＇s complete adjuvant）弗氏不完全佐剂（Freund＇s incomplete adjuvant, FIA）*是由油剂（石蜡油或植物油）与乳化剂（羊毛脂或Tween80）混合而成，比例为1:1、2:1、3:1或5:1，可根据需要而定，通常2:1。
*使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。
弗氏完全佐剂（Freund＇s complete adjuvant, FCA）*在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌（终浓度为2～20mg/ml），即成为FCA。
*免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积1:1 混合乳化后（油包水）注入动物。
-一般首次注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。
佐剂与抗原乳化的方法*研磨法：适于制备大量的佐剂抗原-先将不完全佐剂加热，取1.73ml放人无菌玻璃研钵内；缓缓滴入0.23ml活卡介苗，边滴边按同一方向研磨，使菌体完全分散。
-按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失。
滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。
*缺点：研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。
佐剂与抗原乳化的方法（续）*注射器混合法-将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，然后插入三通管内，交替推动针管混匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。
*优点：无菌操作，节省抗原或佐剂。
*缺点：不易乳化，时间长。
佐剂与抗原乳化的方法（续）*快速乳化法：利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。
-将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下0.5cm，离瓶底0.5cm左右，以免打碎离心管。
-每次乳化10～15s，然后置冰箱lmin左右。
反复乳化3～4次即可完全乳化。
管内残余量800r/min离心5～10min收集。
*优点：简单、快速、节省材料。
乳化剂的鉴定*判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上（冷水中），如能长时间保持圆珠形而不散开，表示乳化达到要求。
（3）免疫方法——免疫途径*常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。
*一般采用多点注射方法-常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。
-皮内易引起细胞免疫反应，有利于提高抗体的效价。
（3）免疫方法——免疫途径（续）*几点说明：-大动物一般不用腹腔注射-颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射-抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法，只需10～100?g抗原即可获得较好的免疫效果。
-皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入。
（3）免疫方法——次数及间隔时间*次数一般为2～3次（初次免疫和加强免疫）-首次注射后，10～15天再加强注射；-剂量同首次或为首次的一半，用不全佐剂或不用佐剂。
*间隔时间，一般而言，动物越大，间隔越长-豚鼠、大鼠为7～8天，兔子为10～15天，羊为14～28天；-第三次注射的间隔时间更长些，效果更好。
举例1：家兔的免疫*初次免疫-用50～200?g Ag加入FCA，在背部皮下注射6～8点，每点0.1～0.2ml，也可肌肉内或皮内注射；*两周后，加强免疫-将50～200?g Ag于PBS或FIA中，在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射；*抗体效价的检测：加强免疫一周后，耳缘静脉采血-抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。
前者抗体效价在1:4000以上，后者在1:16以上，即可采血，取血清进一步提纯。
举例2：微量抗原淋巴结内注射免疫家兔*一般选择2.5～3.0kg的新西兰种公兔-先在其两脚垫注射完全福氏佐剂0.2ml（卡介苗每兔合5mg）；-10天后，见胭窝淋巴结肿大，然后将抗原注射至肿大的淋巴结内，第一次注射抗原用完全福氏佐剂混合乳化；-以后每隔20天用不完全福氏佐剂乳化抗原，以同样方法加强2次，各次注射的抗原均为25～50?g；-末次注射两周后兔耳放血测价（可达1:128）。
举例3：豚鼠和大鼠的免疫*初次免疫-用10～100?g Ag加入FCA，在背部皮内注射4～6点，每点0.lml，也可肌肉内或皮下注射；*加强免疫-每隔7～8天，将10～50?g Ag于PBS或FIA中。
在肌肉、皮下或静脉注射；*抗体效价的检测（4）免疫剂量*抗原性强的抗原量应小，过大反会引起免疫抑制；*免疫周期长的动物可少量多次注射，短的可大量少次。