基因操作主要技术原理
基因编辑技术的原理与应用
基因编辑技术的原理与应用基因编辑技术是一项重要的生物技术，通过对基因组进行修改和修饰，可以改变生物体的特征和功能，从而对人类的生活产生深远影响。
本文将介绍基因编辑技术的原理和应用，并分析其在医学、农业和生态环境等领域的前景。
一、基因编辑技术的原理基因编辑技术主要基于CRISPR/Cas9系统，该系统来源于细菌对病毒侵袭的免疫反应机制。
具体来说，CRISPR是细菌染色体上由一系列重复序列和间隔序列组成的片段，而Cas9是一种蛋白酶，它能识别特定的DNA序列并切割它。
科学家通过改变CRISPR的间隔序列，使其与目标基因的DNA序列相匹配，同时将Cas9蛋白酶导入到细胞中，从而实现对基因组的精确编辑。
具体操作过程如下：1. 设计寻找目标基因的特定序列，将其与CRISPR的间隔序列相匹配。
2. 使用CRISPR引导RNA (sgRNA) 来指引Cas9蛋白酶与目标基因DNA序列结合。
3. Cas9蛋白酶会切割目标基因的DNA序列。
4. 细胞会尝试修复这个断裂的DNA，但修复过程中可能会发生错误，导致基因组发生改变。
5. 通过这种方式，可以实现添加、删除或改变特定基因。
二、基因编辑技术的应用1. 医学应用基因编辑技术在医学领域中具有广泛应用的前景。
例如，它可以用于治疗遗传病，如囊性纤维化、血液病、遗传性失聪等。
通过基因编辑，可以更精确地修复或替换有缺陷的基因，为患者带来希望。
此外，基因编辑技术还可用于癌症治疗，通过删除癌细胞的恶性基因来抑制肿瘤生长。
2. 农业应用基因编辑技术对农业领域的发展也有巨大影响。
它可以用于改进作物的品质和产量，改良农作物的抗病性和适应性。
通过编辑关键基因，可以使作物更耐旱、耐盐、抗虫，从而提高农作物的生产效率和抵抗力。
此外，基因编辑技术还可以降低农作物对化学农药的依赖性，减少环境污染。
3. 生态环境应用基因编辑技术在生态环境保护方面也具有潜力。
例如，一些物种对外来入侵物种有抵抗力，而一些物种则对外来入侵物种易感。
基因工程的主要技术原理
基因工程的主要技术原理基因工程是一种利用现代分子生物学和生物化学技术来对生物体进行基因组的修改、操作和调控的技术。
它的主要技术原理涉及到以下几个方面：1.DNA重组技术：DNA重组是基因工程的核心技术之一、它通过切割不同生物体中的DNA片段，然后重新组合、连接，将特定的基因或基因片段导入到目标组织、细胞或生物体中。
DNA重组技术包括PCR、限制酶切、DNA连接等。
2.遗传转化技术：遗传转化是将外源DNA导入目标生物细胞或组织中的过程。
常用的转化方法包括细菌的转化、植物的遗传转化以及动物细胞的转染等。
3.基因克隆技术：基因克隆是指通过复制DNA片段来得到多个完全相同的基因分子或有关基因分子的方法。
基因克隆包含了DNA提取、DNA扩增、DNA定序等技术。
5.选择标记技术：为了辅助识别和选择已经被转化的细胞或生物体，常常需要在外源基因上引入选择标记基因。
选择标记基因通常携带特定抗性或基因标记，如抗生素抗性基因或荧光蛋白基因。
6.基因表达调控技术：为了使外源基因在目标生物体中得到高效表达，常需对其进行适当调控。
基因表达调控技术包括启动子的选择、转录因子的调控、信号通路的调节等。
7. 基因测序技术：基因测序是确定DNA序列的方法，可用于分析基因组结构、功能和演化。
目前，最主要的基因测序技术是高通量测序技术，如Illumina测序技术和PacBio测序技术。
8.产生转基因生物技术：基因工程的一个重要应用是产生转基因生物。
转基因生物是指通过基因工程技术将外源基因导入到目标生物体中，使其获得新的性状或功能。
常见的转基因生物包括转基因植物、转基因微生物等。
以上是基因工程的主要技术原理。
随着科学技术的不断进步，基因工程技术将进一步发展和应用，为解决人类面临的许多生物学和医学问题提供更好的解决方案。
基因操作的原理和过程
基因操作的原理和过程基因操作（Genetic engineering）是一种利用基因技术对生物体的遗传物质进行修改和重组的技术手段。
通过基因操作，可以对生物的基因进行剪接、修饰或移除，并向生物中引入新的基因或基因片段，从而改变生物的遗传特征和表现形式。
基因操作在农业、医学、生物工程等领域都有广泛的应用，它不仅可以提高生物的抗病性、耐性和产量，还可以用于研究基因的功能和调控机制。
基因操作的原理是基于对生物体的基因组进行修改和优化，具体分为以下几个步骤：1. 选择目标基因：首先需要确定要操作的基因，可以是现有生物体中的某个基因，也可以是外源基因。
有时也会选择修改某个特定区域的基因片段。
2. 基因克隆和构建载体：利用分子生物学技术，将目标基因从生物体中分离提取。
然后，将目标基因插入到载体DNA中，构建成重组载体。
常用的载体包括质粒和病毒。
3. 转化目标细胞：将构建好的重组载体导入到目标细胞中。
可以通过多种途径实现细胞的转化，如化学转化、电转化、冷冻复苏等。
4. 基因表达和筛选：在转化成功后，目标基因会在细胞内进行表达，从而改变生物的遗传特征和表现形式。
为了筛选出表达目标基因的细胞，可以在重组载体中引入选择标记基因，如抗生素抗性基因。
5. 验证和分析：在筛选出表达目标基因的细胞后，需要对其进行验证和分析。
可以通过PCR、酶切、同源重组等技术手段来验证基因操作的结果，并进一步分析基因的功能。
基因操作的过程中有一些关键技术和工具，如PCR技术、限制性内切酶、连接酶、DNA测序等。
这些技术和工具的应用使得基因操作的过程更加高效、准确。
基因操作的应用领域广泛，涉及农业、医学、生物工程等多个领域。
在农业领域，基因操作可以用于改良农作物的品质和产量，提高抗病虫害的能力，延长保存期限等。
比如，通过引入抗病虫害基因，使植物对害虫和病毒的侵害产生免疫反应。
在医学领域，基因操作可以用于治疗遗传性疾病、癌症等疾病。
比如，通过修正患者的遗传突变，可以恢复正常的基因功能。
基因编辑技术的原理与方法
基因编辑技术的原理与方法基因编辑技术是一种能够创造新的生命形态的科技，它可以改变生物的基因组，使其拥有更先进的基因组结构，并且可以消除人类遗传病。
基因编辑技术的主要原理是通过改变生物基因组内的核酸序列，去掉有害基因和插入有利基因，来实现对生物基因编辑的操作。
本文将讨论基因编辑技术的原理和方法。
一. 基因编辑技术的原理基因编辑技术的原理是利用现代生物技术将人类的基因或某种蛋白质编辑或修饰，使其能更好的适应环境以及更好的发挥作用。
1.重组DNA技术重组DNA技术是基因编辑技术的关键，重组DNA技术使得科学家们可以利用细胞、病毒或细菌的基因将不同的DNA片段组合在一起，产生新的DNA序列。
具体地，利用重组DNA技术在DNA链上切开并粘贴一段新的DNA，这样就可以在人类基因组上定位有害基因并进行修饰、消除。
2. CRISPR / Cas9基因编辑技术CRISPR/Cas9基因编辑技术是一种基因编辑技术，是一种高效的基因编辑工具。
与传统的基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9可以更容易地定位和修改目标基因。
它利用了CRISPR基因与Cas9蛋白的互作，在某个DNA片段上划分一个锋利的切割器，来修正、插入或删除DNA链中的基因。
这种基因编辑技术使得基因编辑更加精准和有效，对治疗包括肺癌、胃癌、乳腺癌等多种疾病均具有一定的优势。
二. 基因编辑技术的方法目前，基因编辑的主要方法有三种：基因注射法、细胞融合法和CRISPR/Cas9技术。
1.基因注射法基因注射法是一种基本的基因编辑方法，它适用于比较简单、单一的生物细胞，如蝌蚪、动物卵细胞等。
该技术的具体方法是将编码所需蛋白或RNA的DNA或RNA注射进去，使其在细胞内进行转录和后续翻译，来实现对细胞基因编辑的操作。
2.细胞融合法细胞融合法是一种通过融合两个非常相似的细胞产生一个新的细胞来编辑基因的方法，主要针对多细胞生命而言。
这种方法通过融合可以得到新细胞及其基因，可以将新细胞的某些特征加入原有的种群中，使它们更适应某些特定环境和进化。
基因操作原理和方法
克隆和重组技术的应用
克隆和重组技术广泛应 用于基因工程、生物制 药、农业和医学等领域 。
在基因工程中，克隆和 重组技术用于生产重组 蛋白、疫苗和抗体等生 物制品。
在农业中，克隆和重组 技术用于改良作物品种 和提高农作物的抗逆性 和产量。
生物科学研究
基因敲除和敲入技术可用于研究基因功能、细胞信 号转导、药物筛选等生物科学研究领域，有助于深 入了解生命活动的本质。
生物制药
基因敲除和敲入技术可用于生产基因工程药物，通 过改造或增强微生物、细胞或动物细胞中的基因表 达，生产具有特定功能的药物。
敲除和敲入技术的限制和挑战
80%
技术难度高
基因敲除和敲入技术需要精确的 操作和设计，对技术和实验条件 要求较高，且存在一定的失败率 和不确定性。
05
基因编辑新技术
CRISPR-Cas9系统
总结词
CRISPR-Cas9系统是一种高效、简单、低成本的基因编辑技术，通过向导RNA和Cas9 蛋白的引导，实现对特定DNA序列的切割和修复。
详细描述
CRISPR-Cas9系统利用向导RNA与目标DNA序列的特异性结合，将Cas9蛋白引导至目 标位置，通过切割DNA双链形成缺口，启动细胞内的DNA修复机制。在修复过程中， 插入、删除或替换特定DNA序列成为可能，从而实现基因敲除、敲入和点突变等基因
基因操作的历史与发展
基因操作技术的起源可以追溯到20 世纪70年代，当时科学家开始探索 限制性内切酶和DNA连接酶等工具 的应用。
随着技术的不断发展，基因操作逐渐 成为现代生物学和医学研究的重要手 段，广泛应用于基因克隆、基因治疗 、基因工程等领域。
基因操作原理知识点总结
基因操作原理知识点总结基因操作是一种在生物体内对基因进行修改或操作的技术，它的出现为生物学、医学和农业等领域带来了革命性的变革。
通过基因操作技术，科学家们可以改变生物体的一些性状，使得其具有更好的抗病性、生长速度、产量等特性，从而为人类生活和生产带来了巨大的便利和利益。
在这篇文章中，我将从基因操作的原理、技术、应用和风险等方面进行详细的介绍和讨论。
基因操作的原则基因操作的基本原理是对生物体的基因进行修改或操作，使得其具有某些特定的性状。
这是通过DNA重组技术来实现的，DNA重组技术是一种利用酶的作用或化学方法，将DNA片段进行切割、粘接、合成等操作，从而实现对基因的改变或移植。
利用这一技术，科学家们可以将某种物种的基因转移到另一种物种中，或者通过改变某个基因的表达方式来使得生物体产生一些新的性状。
基因操作的技术基因操作技术主要包括DNA重组技术、基因克隆技术、基因敲除技术、基因编辑技术等。
其中，DNA重组技术是最基本的技术，它通过切割、粘接、重组DNA片段来改变基因的结构和表达方式；基因克隆技术是一种通过细胞培养和分裂来复制基因的方法，可以用于大规模生产具有某些特定性状的生物体；基因敲除技术是一种通过干扰某个基因的表达来观察该基因在生物体中的功能和作用；基因编辑技术是一种通过精确的操纵基因序列来实现对基因的改变和操作。
基因操作的应用基因操作技术在农业、医学、生物工程等领域都有着广泛的应用。
在农业领域，基因操作技术可以用来改良作物的产量、抗病性、品质等性状，从而为农业生产提供更多的选择和可能；在医学领域，基因操作技术可以用来治疗或预防一些遗传疾病，为人类健康带来更多的希望和机会；在生物工程领域，基因操作技术可以用来生产某些特定的物质或药物，从而为生产和生活提供更多的可能性。
基因操作的风险尽管基因操作技术为人类带来了巨大的利益和希望，但是它可能也会带来一些潜在的风险和问题。
其中，最主要的风险包括对环境的影响和对人类健康的影响。
基因工程的原理是什么
基因工程的原理是什么
基因工程是一种利用生物技术手段对生物体进行基因改造的技术，它的原理主要包括基因分离、基因修饰和基因重组三个方面。
基因工程的原理是通过对生物体的基因进行改造，实现对生物体性状的调控和改良，从而达到人为控制生物体遗传特征的目的。
首先，基因工程的原理之一是基因分离。
基因是生物体内控制遗传信息传递和表现的基本单位，通过基因分离技术，可以将特定的基因从一个生物体中分离出来。
这一过程需要利用分子生物学技术，如PCR、酶切等，将目标基因从细胞或DNA中分离出来，为后续的基因修饰和重组奠定基础。
其次，基因工程的原理还包括基因修饰。
基因修饰是指对已分离的基因进行改造，使其具有特定的性状或功能。
这包括基因的点突变、插入、删除等操作，通过改变基因的序列，使其表达产生不同的蛋白质或调控特定的生物过程，从而实现对生物体性状的调控和改良。
最后，基因工程的原理还涉及基因重组。
基因重组是指将不同来源的基因进行组合，形成新的基因组合，使生物体表现出新的性
状或功能。
通过基因重组技术，可以将来自不同生物体的基因进行组合，形成转基因生物，从而实现对生物体性状的改造和调控。
总的来说，基因工程的原理是通过基因分离、基因修饰和基因重组等技术手段，对生物体的基因进行改造，实现对生物体性状的调控和改良。
基因工程技术的应用，不仅可以用于农业领域的作物育种和畜禽改良，还可以用于医学领域的基因治疗和药物研发，对人类健康和生物资源的可持续利用具有重要意义。
基因工程的主要技术与原理-核苷酸序列分析
(三) 化学降解法的应用
Maxam-Gilbert化学降解法的测序长度大约为250个
碱基，适合G+C含量较高及较短的寡核苷酸片段的 测序； 从DNA两端分别测定同一条DNA核苷酸序列，相互 参照测定结果，可以得到准确的核苷酸序列；
Maxam-Gilbert化学降解法不需要进行酶催化反应，
起始位点相同的、不同长度的、以不同碱基结
尾的DNA片段群； 3. 分离：通过凝胶电泳分离片段群；
4. 推导：再经放射线自显影，确定各片段末端碱基， 从而得出目的DNA的碱基序列。
凝胶电泳分离，放射线自显影分析
G A+G C+T C 3′
5′ 5′ C T T T T T T G G G C T T A G C 3′
基因分析工具
NCBI:（美国国家生物技术信息中心）
EMBL:（欧洲生物信息学研究所）
Sanger中心:（基因组测序中心）
ExPASy:（瑞士生物信息学研究所蛋白质分析系统）
H
ddNTP
ddATP
ddCTP
通过聚丙烯酰胺凝胶电 泳能分辨出小至一个碱基 长度差异的DNA片段,从 而将混合产物中不同长度 DNA片段分离开。
再通过放射自显影曝光, 根据片段尾部的双脱氧核 苷酸读出该DNA的碱基排列 顺序。
(二) 序列分析的基本步骤
模板变性(dnature template)：将待测DNA模板 与引物混合，通过加热时模板变性； 退火(annealing)：将变性的模板与引物混合物 缓慢降温，使引物与模板结合； 标记(labeling)：利用放射性同位素标记核苷酸 或引物； 延伸(extension)和终止(termination)：反应体 系中新生核苷酸的合成和随机终止过程； 电泳分析和数据读取：聚丙烯酰胺凝胶电泳，放 射自显影，读取DNA的碱基排列顺序。
吴乃虎《基因工程原理》4-6知识点总结
第4章基因操作的主要技术原理基因操作的方法包括:大分子DNA的提取、DNA分子的切割和连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、DNA序列分析、基因的人工合成、基因定点突变、PCR扩增等。
DNA分子的切割和连接是基因操作的核心技术。
一、核酸的分离和纯化技术核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中它们都是以与蛋白质结合的状态存在。
DNA：真核生物染色体DNA——双链线性；真核生物的细胞器DNA——双链环状；原核生物的核区DNA、质粒——双链环状。
RNA：RNA分子在大多数生物体内均是单链线性分子。
一般生物体基因组DNA大小为107-8bp。
DNA提取的目的（1）可用PCR从基因组中扩增基因；（2）作RAPD分析，区别两种物种之间的亲缘关系；（3）作Southern分析，检测是否转入基因；探测同源的基因；（4）作酶切图谱，用于DNA测序。
（一）总DNA的提取DNA在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0。
14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。
总DNA：一般来说是指基因组DNA ，即细胞核内的染色体DNA分子。
核DNA分子呈极不对称的线性结构，一条染色体为一个DNA分子。
其长度与直径的比例极不对称性，使其对极械力十分敏感。
分离纯化中DNA分子的断裂是很难避免的。
尽可能保持DNA分子的完整性是DNA分离技术的关键。
（1）有效制备大分子DNA的方法主要考虑两个原则：①防止和抑制内源DNase对DNA的降解；DNase 以Mg2+、Mn2+为辅助因子，只要加入一定的螯合剂，如EDTA（乙二胺四乙酸钠）、柠檬酸便可。
②尽量减少对溶液中DNA的机械剪切力。
动作轻柔、减少涡旋、使用大口吸管。
（2）DNA提取的主要操作过程（3）DNA提取的主要问题及解决方法：①DNA沉淀呈棕色，很难酶切或扩增；多酚、单宁、色素等氧化所致。
基因工程的主要技术及其原理
基因工程的主要技术及其原理基因工程是一种利用分子生物学和遗传学知识对生物体进行基因改造的技术。
它可以用于改良农作物、生产药物、治疗疾病等领域。
基因工程的主要技术包括基因克隆、基因编辑、转基因等，下面将分别介绍这些技术的原理和应用。
一、基因克隆技术基因克隆是指将感兴趣的基因从一个生物体中复制出来，并将其插入到另一个生物体中的技术。
其原理是利用限制性内切酶将DNA切割成片段，然后将感兴趣的基因片段插入到质粒或病毒载体中，最后将载体转化到宿主细胞中。
基因克隆技术可以用于生产大量的特定基因，用于研究基因功能、生产蛋白质等。
二、基因编辑技术基因编辑是指利用特定的酶对DNA序列进行精准的修改的技术。
目前最常用的基因编辑技术是CRISPR/Cas9系统，其原理是利用Cas9蛋白和RNA引导序列形成复合物，精准地切割目标DNA序列，然后通过修复机制进行修复或插入新的DNA序列。
基因编辑技术可以用于研究基因功能、治疗遗传疾病、改良农作物等方面。
三、转基因技术转基因是指将外源基因导入到目标生物体中，使其表达外源基因产生的蛋白质或表型。
其原理是利用载体将外源基因导入到目标生物体的细胞中，然后使其稳定地整合到目标生物体的染色体中。
转基因技术可以用于改良农作物、生产药物、治疗疾病等领域。
基因工程技术在农业、医药、生物学等领域有着广泛的应用。
在农业领域，基因工程技术可以用于改良农作物的抗病虫性、耐逆性等性状，提高农作物的产量和质量。
在医药领域，基因工程技术可以用于生产重组蛋白质药物、治疗遗传疾病、研发新型疫苗等。
在生物学研究领域，基因工程技术可以用于研究基因功能、构建基因组库等。
然而，基因工程技术也面临着一些挑战和争议。
一方面，基因工程技术可能会引起环境风险和健康风险，例如转基因作物可能会对生态系统产生影响，基因编辑技术可能会引起不可逆的基因突变等。
另一方面，基因工程技术的应用也涉及到伦理道德、食品安全、知识产权等问题，需要进行严格的监管和管理。
基因编辑技术的原理和应用
基因编辑技术的原理和应用基因编辑技术，是指通过对生物体的基因进行直接修饰和改变，实现特定基因的添加、删除或修复的一种生物技术手段。
这项技术的诞生，给人类带来了巨大的希望和挑战。
本文将介绍基因编辑技术的原理、方法以及其在医学、农业和环境保护等领域的应用。
一、基因编辑技术的原理基因编辑技术主要基于CRISPR-Cas9系统进行操作，该系统来源于大肠杆菌的一种天然免疫机制。
CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种存在于细菌和古菌基因组中的特殊DNA序列。
而Cas9（CRISPR-associated protein 9）则是一种与CRISPR序列一起工作的内切酶，能够识别特定的DNA序列并进行剪切。
基因编辑技术的原理可以概括为三个步骤：sgRNA设计、Cas9靶向和DNA修复。
首先，根据目标基因序列设计一段单链RNA，称为sgRNA（single-guide RNA），它能与Cas9蛋白结合形成复合物。
这个sgRNA导向Cas9蛋白来到目标基因序列的特定部位。
接下来，Cas9蛋白会利用其内切酶活性，将目标基因序列中的DNA双链骨架剪切开。
最后，细胞会根据自身修复机制进行DNA修复，可能引起插入、删除或替代等不同类型的变化。
二、基因编辑技术的应用1. 医学应用基因编辑技术在医学领域有着广泛的应用前景。
通过基因编辑技术，可以研究疾病发生和发展的机制，找到治疗某些遗传性疾病的方法。
例如，科学家使用基因编辑技术成功修复了人工核武器相关疾病的遗传突变，并取得了显著的疗效。
此外，基因编辑技术还可以用于治疗癌症、艾滋病等疾病。
通过改变患者体内的基因，可以使患者产生能够对抗疾病的物质，达到治疗的目的。
2. 农业应用基因编辑技术在农业领域的应用，主要集中在改良植物和动物的品种。
通过编辑植物基因，可以使其拥有抗病虫害、耐逆性强、产量高等优势特性。
基因操作的主要技术原理
基因操作的主要技术原理1．核酸的凝胶电泳(Agarose & Polyacrylamide)将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。
某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。
在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。
将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。
在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）--ethidium bromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。
DNA的脉冲电泳技术 :PFGE-Pulse-field gel electrophoresis2．核酸的分子杂交技术在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地"吸印" 转移到滤膜上的。
常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）等。
核酸分子杂交实验包括如下两个步骤：将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程特称为核酸印迹(nucleic acid blotting)转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法(dot and slot blotting)、菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting)；将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。
所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。
3．细菌的转化所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。
这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。
第二章基因操作的主要技术原理2
22
nothernblot
Gene engineering
四、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交
斑点印迹杂交（dot blotting）和狭线印迹杂 交（slot blotting ）是在Southern印迹杂交的基 础上发展的量种类式的快速检测特定核酸 （DNA和RNA）分子的核酸杂交技术。由于在 实验的加样过程中使用了特殊设计的加样装置， 使众多待测样品能够一次同步转移到杂交滤膜 上，并有规律地排列成点阵或线阵。这两项技 术更适应与核酸样品的定量检测。
10
Gene engineering
尼龙膜
很强的抗张性，易于操作，与核酸分子 的结合能力大。 DNA以天然的形式从凝胶上转移到膜上， 在尼龙膜上进行原位碱变性。
11
Gene engineering
尼龙膜或硝酸纤维素膜杂交的步骤
1)核酸印迹转移：将核酸样品转移到固体 支持膜上(毛细管作用)
2)印迹杂交： 将具有核酸印迹的滤膜同带 有标记的DNA/RNA进行杂交。
43
Gene engineering
DNA + DMS
+ Saturating [Protein] Gel Shift
44
Gene engineering
4、甲基化干扰实验（methyltion interference assay）
根据DMS（硫酸二甲酯）能够使G残基甲基化，而六氢吡 啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理，设计出了另一 种研究DNA与蛋白质相互作用的实验方法，即甲基化干扰 实验。这种技术可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化 对而后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细 地揭示DNA与蛋白质之间相互作用的模式。
基因工程实验原理
基因工程实验原理
基因工程实验的原理是基于对生物体基因组的修改和重组，旨在增加或改变生物体的特性。
下面将介绍几种常见的基因工程实验原理：
1. 基因克隆：该实验原理是将所需基因从一个生物体中剪切并插入到另一个生物体的染色体上，使目标基因能够在新宿主中表达。
2. 限制性内切酶消化：该实验原理是利用限制性内切酶切割目标DNA，创建具有粘性末端的DNA片段。
然后，可以通过连接这些片段来构建重组DNA。
3. 反转录和cDNA合成：这个实验原理是利用逆转录酶将RNA转录成DNA，即cDNA（互补DNA），然后将其克隆到表达载体中。
4. 基因敲入和敲除：该实验原理是通过CRISPR/Cas9系统或其他方法，有针对性地切割或改写目标基因，从而敲除或敲入特定的DNA片段。
5. 转基因技术：这是将外源基因导入到目标生物体中，使其表达或增强特定的功能。
转基因技术的原理可以是通过基因枪、农杆菌介导的转化等手段。
这些实验原理是基因工程研究中常用的方法，可以用于改良农
作物、生产药物、开发生物燃料等领域。
在实验过程中，研究人员需要仔细设计实验方案，并根据具体需求选择适当的方法。
基因工程的主要技术与原理
（一）、探针的标记物
非放射性探针的标记 ▪ 生物素标记核酸 （光敏生物素、酶促生物素） ▪ DNA半抗原标记 ▪ 荧光素标记
基本原理：
生物素标记法
以生物素化的脱氧核苷三磷酸（Bio-11-dUTP,Bio-7-dATP、 Bio-11-dCTP）等代替相应脱氧核苷三磷酸，经DNA聚合酶作用掺 入新合成的DNA。可以采用缺口平移法和随机引物延伸法进行。
制备高比活性探针(1010 cpm/μgDNA);
（3）末端标记法 T4 DNA聚合酶
5’→3’聚合酶活性，1500 nt/min, 为pol I的两倍 3’→5’外切酶活性，可作用于ssDNA和dsDNA, 其切除速度 分别为40和 4000nt/min
补平或标记DNA分子由核酸内切酶产生的3'凹端 对带有3'黏性末端或平末端的DNA片段进行标记，制备探针
基本原理 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针” 是抗体，“显色”用标记的二抗
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如NC膜）上， 固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多 肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作 为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第 二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的 特异性目的基因表达的蛋白成分。
随机引物：含有各种 可能排列顺序的寡核 苷酸片段的混合物。 46 = 4096
DNA聚合酶ⅠKlenow片段
5’→3’DNA聚合酶活性 弱3’→5’外切核酸酶活 性 无5’→3’外切核酸酶活 性
➢ 产物平均长度为400-600个核苷酸。 ➢ Klenow片段没有5 ’→3’外切酶活性, 反应稳定, 可以获得大量的有效探针。 ➢ 反应时对模板的要求不严格, 用微量制备的质粒DNA 模板也可进行反应。
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银染色
▪ 银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳 定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+ 还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐 色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色. 也用于琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高 200倍.但银染色后，DNA不宜回收.
DNA条带大小及量的估算
5000（bp） 3000 2000
▪ SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量 SYBR 荧 光 染 料 ， SYBR 荧 光 染 料 特 异 性 地 掺入 DNA 双 链 后 ， 发 射 荧 光 信 号 ， 而 不 掺 入 链 中 的 SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证 荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
▪ 因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结 果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的 变性剂为甲醛和戊二醛。
第二节 核酸分子杂交
▪ 核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基
学院（Cavnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事发明的。 ▪ 所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的 单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应 的同源区段将会退火形成双链的结构。
② 琼脂糖浓度 一个给定大小的线状DNA片段，其迁移速率 在不同浓度的琼脂糖中各不相同。
③ DNA的构象
分子量相同的超 螺旋环状，带切 口的环状及线性 DNA通过凝胶时 速度不一。
（4）低熔点琼脂糖（LMP）
▪ 熔点在65oC的琼脂糖凝胶，熔解后可在37oC保持液 体形态，可直接用来回收DNA分子。
第二章 基因操作的主要技术原理
▪ 基因操作技术主要包括 （1）DNA分子的切割、连接、转化 （2）核酸分子杂交，凝胶电泳以及序列分析，
基因的人工合成，PCR扩增等
▪ 第一节 核酸的凝胶电泳 ▪ 第二节 核酸分子杂交 ▪ 第三节 细菌的转化 ▪ 第四节 DNA序列分析 ▪ 第五节 基因扩增 ▪ 第六节 基因的定点诱变 ▪ 第七节 蛋白质与DNA相互作用的研究方法
琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡过程中 DNA Ladder的形成
PCR产物的琼脂糖电泳
（2）分辨能力
同凝胶的浓度相关，能分辨50-200kb的DNA片段， 浓度越低，孔隙越大，分离的DNA越大
（3）影响DNA迁移率的因素
① DNA分子量大小 线状DNA分子的迁移速率 与 其 碱 基 数 目 以 10 为 底 的 对数值成反比。分子量越 大，摩擦力越大，越难于 在凝胶空隙中蠕行，迁移 得越慢。
第一节 核酸的凝胶电泳
一、核酸的凝胶电泳(Agarose & Polyacrylamide) 1、简介
➢ 将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的 速度向适当的电极移动。 ➢ 某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率， 它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数 成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、 极性、介质的粘度系数等）。
1000 750 500 250 100
6、RNA 电 泳
▪ 基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是， 因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必 须用对RNA酶有抑制作用DEPC水（0.1％ 焦碳酸 二乙酯）来配制所有溶液，所有与RNA接触的仪 器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品 的降解；
在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）-ethidium bromide染色，此时，核酸分子在紫 外光下发出荧光，能看到约1-10ngDNA所形 成的条带。
溴化乙锭（EtBr）
一种具扁平分子的核酸 染料，可插入到DNA或 RNA分子的碱基之间。 在300nm紫外灯照射下 发射出荧光。
6、其他染色方法
（2）聚丙烯酰胺凝胶分离范围如下：
（3）制备：
凝胶铺于两块玻 璃板之间，两块玻 璃板由间隔片所隔 开，并封一绝缘胶 布。
（4）检测方法
EB染色 放射自显影 硝酸银染色
聚丙烯凝胶电泳的银染结果分析
4、脉冲电场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）
▪ SYBR Green I 核酸染料 ▪ 高灵敏的DNA荧光染料，适用于各种电泳
分析，操作简单：无需脱色或冲洗。至少 可检出20pg DNA，高于EB染色法25-100 倍。SYBR Green I 与dsDNA 结合荧光信 号会增强800-1000倍，用SYBR Green I染 色的凝胶样品荧光信号强，背景信号低。 可适用于多种电泳分析。
➢在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是 离子化的，所以DNA和RNA实际上呈多聚 阴离子状态（Polyanions）。将DNA、 RNA放到电场中，它就会由负极→正极移 动。
2、琼脂糖凝胶电泳
• 琼脂糖凝胶： 琼脂糖是提取的线性高聚物，电泳中 EB染色，紫外灯下1ngDNA可以被检测到 ➢ 分离作用依赖于DNA的分子量及构型 ➢ 凝胶的种类及浓度对被分离的DNA的分子大小有 影响
用 于 分 离 超 大 分 子 量 的 DNA ， 可 分 辨 达 到 107bp 的 DNA分子
原理：
电场方向，电流大小和作用时间都在交替变换，使 DNA分子能够随时调整其泳动方向，以适应凝胶孔 隙的无规则变化
45o夹角
PFGE can resolve large DNA fragments
5、EB染色
LMP中的DNA分子
65oC加热熔解
加入苯酚抽提
LMP形成沉淀，DNA在上清 离心分离
3、聚丙烯酰胺凝胶电泳
① 用于分离和纯化双链DNA的非变性电泳 ②用于分离和纯化单链DNA的变性电泳，凝胶中加 入抑制碱基配对的试剂（尿素、甲醛）
（1）原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称 Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis) 在加速剂N，N，N，N-四甲基乙二胺(简称 TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP) 的作用 下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝 胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳 (简称PAGE)。