基因操作主要技术原理

▪ SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量 SYBR 荧 光 染 料 ， SYBR 荧 光 染 料 特 异 性 地 掺入 DNA 双 链 后 ， 发 射 荧 光 信 号 ， 而 不 掺 入 链 中 的 SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证 荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
第二章 基因操作的主要技术原理
▪ 基因操作技术主要包括 （1）DNA分子的切割、连接、转化 （2）核酸分子杂交，凝胶电泳以及序列分析，
基因的人工合成，PCR扩增等
▪ 第一节 核酸的凝胶电泳 ▪ 第二节 核酸分子杂交 ▪ 第三节 细菌的转化 ▪ 第四节 DNA序列分析 ▪ 第五节 基因扩增 ▪ 第六节 基因的定点诱变 ▪ 第七节 蛋白质与DNA相互作用的研究方法
1000 750 500 250 100
6、RNA 电 泳
▪ 基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是， 因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必 须用对RNA酶有抑制作用DEPC水（0.1％ 焦碳酸 二乙酯）来配制所有溶液，所有与RNA接触的仪 器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品 的降解；
琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡过程中 DNA Ladder的形成
PCR产物的琼脂糖电泳
（2）分辨能力
同凝胶的浓度相关，能分பைடு நூலகம்50-200kb的DNA片段， 浓度越低，孔隙越大，分离的DNA越大
（3）影响DNA迁移率的因素
① DNA分子量大小 线状DNA分子的迁移速率 与 其 碱 基 数 目 以 10 为 底 的 对数值成反比。分子量越 大，摩擦力越大，越难于 在凝胶空隙中蠕行，迁移 得越慢。
（2）聚丙烯酰胺凝胶分离范围如下：
（3）制备：
凝胶铺于两块玻 璃板之间，两块玻 璃板由间隔片所隔 开，并封一绝缘胶 布。
（4）检测方法
EB染色 放射自显影 硝酸银染色
聚丙烯凝胶电泳的银染结果分析
4、脉冲电场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）
银染色
▪ 银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳 定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+ 还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐 色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色. 也用于琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高 200倍.但银染色后，DNA不宜回收.
DNA条带大小及量的估算
5000（bp） 3000 2000
第一节 核酸的凝胶电泳
一、核酸的凝胶电泳(Agarose & Polyacrylamide) 1、简介
➢ 将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的 速度向适当的电极移动。 ➢ 某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率， 它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数 成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、 极性、介质的粘度系数等）。
▪ 因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结 果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的 变性剂为甲醛和戊二醛。
第二节 核酸分子杂交
▪ 核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基
学院（Cavnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事发明的。 ▪ 所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的 单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应 的同源区段将会退火形成双链的结构。
用 于 分 离 超 大 分 子 量 的 DNA ， 可 分 辨 达 到 107bp 的 DNA分子
原理：
电场方向，电流大小和作用时间都在交替变换，使 DNA分子能够随时调整其泳动方向，以适应凝胶孔 隙的无规则变化
45o夹角
PFGE can resolve large DNA fragments
5、EB染色
LMP中的DNA分子
65oC加热熔解
加入苯酚抽提
LMP形成沉淀，DNA在上清 离心分离
3、聚丙烯酰胺凝胶电泳
① 用于分离和纯化双链DNA的非变性电泳 ②用于分离和纯化单链DNA的变性电泳，凝胶中加 入抑制碱基配对的试剂（尿素、甲醛）
（1）原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称 Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis) 在加速剂N，N，N，N-四甲基乙二胺(简称 TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP) 的作用 下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝 胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳 (简称PAGE)。
➢在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是 离子化的，所以DNA和RNA实际上呈多聚 阴离子状态（Polyanions）。将DNA、 RNA放到电场中，它就会由负极→正极移 动。
2、琼脂糖凝胶电泳
• 琼脂糖凝胶： 琼脂糖是从海藻中提取处理出来的一种线
性聚合物。
（1） 琼脂糖——海藻中提取的线性高聚物，电泳中 EB染色，紫外灯下1ngDNA可以被检测到 ➢ 分离作用依赖于DNA的分子量及构型 ➢ 凝胶的种类及浓度对被分离的DNA的分子大小有 影响
▪ SYBR Green I 核酸染料 ▪ 高灵敏的DNA荧光染料，适用于各种电泳
分析，操作简单：无需脱色或冲洗。至少 可检出20pg DNA，高于EB染色法25-100 倍。SYBR Green I 与dsDNA 结合荧光信 号会增强800-1000倍，用SYBR Green I染 色的凝胶样品荧光信号强，背景信号低。 可适用于多种电泳分析。
在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）-ethidium bromide染色，此时，核酸分子在紫 外光下发出荧光，能看到约1-10ngDNA所形 成的条带。
溴化乙锭（EtBr）
一种具扁平分子的核酸 染料，可插入到DNA或 RNA分子的碱基之间。 在300nm紫外灯照射下 发射出荧光。
6、其他染色方法
② 琼脂糖浓度 一个给定大小的线状DNA片段，其迁移速率 在不同浓度的琼脂糖中各不相同。
③ DNA的构象
分子量相同的超 螺旋环状，带切 口的环状及线性 DNA通过凝胶时 速度不一。
（4）低熔点琼脂糖（LMP）
▪ 熔点在65oC的琼脂糖凝胶，熔解后可在37oC保持液 体形态，可直接用来回收DNA分子。