Seahorse海马代谢仪使用说明

选择模板（提前预热）
Injection strategies--add---strategy 1----A---add----mito stress test1
B C同样
Pretreatment----add-----不用做修改
Assay Media-----Mito Stress test medium
汇报人： 学号：
背景
生物能量学（Bioenergetic）
老化 各类药 物毒理 机制 神经退 化性疾 病
探讨的是生物将氧份 转为能量并借此推动生 命的过程。不同的细胞 依据其生理特性及健康 状况，能量供需系统亦 有所不同。
癌症
能量 代谢
糖尿病
Fra Baidu bibliotek心血管 疾病
肥胖
简介

美国海马生物科学利用细胞外流量（Extracellular Flux， XF）检测专利技术，发明了业界第一款海马细胞能量代谢 实 时 测 定 仪 / 生 物 能 量 代 谢 测 定 仪 （ Seahorse XF Extracellular Flux Analyzers），是进行细胞代谢分析、氧 呼吸测定、药物代谢分析、线粒体有氧代谢和糖酵解等功 能的最佳分析工具。
2.按以下表格，用检测液将FCCP稀释为不同的浓度
3.取300 μL 50 μM rotenone/antimycin A母 液至2700 μL检测液中。
加药
从无CO2培养箱中取出已水化的测试板。按以下说明，
将药物分别加到每个加药孔里。 加药孔A：细胞孔内oligomycin终浓度为1 μM。每个A 孔加入56 μL 10×药物。 加药孔B：测定浓度的FCCP。将62 μL 10×的不同浓 度药物加入到B孔里。 加药孔C：细胞孔内Rot/AA终浓度为0.5 μM。每个C孔 加入69 μL 10×药物。
配制XF细胞线粒体压力测试盒中药物 母液
检测液体积 Oligomycin FCCP Rotenone/Ant imycin A 630 μL 720 μL 540 μL
终浓度 100 μM 100 μM 50 μM
将药物稀释为10×浓度，用于加到加药孔中
1.按左边表格，用3 mL 检测液将 oligomycin稀释为所需浓度（或使 用大多数细胞都适用的1 μM）。
How do I know whether the cell density is good?
• Basal OCR range: 20-160 pmol/min • Maximum recommended OCR: 400 pmol/min • ECAR: 5-100 mpH/min
优势特点：
采用超敏感的生物传感器和非接触式设计，真正实现检



测细胞零损伤； 实时检测细胞有氧呼吸、糖酵解的能量代谢情况，即时 反应细胞生理状态； 同步检测细胞的耗氧量和产酸率（pH值变化），数据结 果更加全面； 实现同步检测96/24个细胞样品，通量高，速度快； 自动化检测流程、自动化控制添加多达四种药物，操作 方便高效。
Review Run-----Plate Information-----Well Volume-----Plate by----Start Run，放入测试板。当软件出现校准完成提示时，将Utility板 换为细胞培养板。点击Continue。仪器完成OCR值测定，数据分析。
寡霉素：ATP合酶抑制剂； FCCP：解偶联剂 ； 抗霉素A/鱼藤酮：呼吸链抑制剂；
填写相关信息：Name ,Cell Type, Seeding density（Cell Type2，3， 4 同样），之后点击“Generate Group”查看
“Plate Map”设置颜色
默认的 Mix-Wait-Measure时间为3 min-2 min-3 min。通常在 加药前测量3次基础值；每次加药后再进行3次测量。 “Injection”多少种药点多少次
3.将细胞板放置在细胞培养箱中让细胞 贴壁（快1h；慢5-6h），在显微镜下观 察细胞是否贴壁。
4.细胞贴壁后，每孔加入150 μL生长培 养液，总体积为250 μL。加液时，沿壁 轻轻加入，避免吹起刚贴壁的细胞。 5.将细胞放置在细胞培养箱中过夜培养。 在显微镜下观察细胞的生长状态。
预热仪器
打开Seahorse仪器和电脑，并打开软件，使仪器升温至37 ℃，过夜预热。
特点：通过特殊的细胞培养微孔板设计，在测量时临时形
成的约2ul微环境中，利用无创的专利光学传感器同步地实 时探测溶解氧（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）变化，从 而快速了解细胞内两大能量转换途径（线粒体的有氧代谢 和糖酵解）的能量代谢状态。
仪器外观
Hydro Booster
Sensor Cartridge
处理细胞
1.将细胞培养板从CO2培养箱中取出，并记录时间。 2.在显微镜下观察细胞（无污染，细胞均匀状态好，贴壁 未脱落，背景矫正孔无细胞。） 3.用XF细胞线粒体压力测试检测液洗细胞： a.吸去生长培养液至每孔剩余50 μL。 b.用1 mL XF检测液洗细胞两次。 c.每孔加入检测液至终体积为500 μL/孔。 4.在显微镜下观察细胞，确认细胞在换液过程中没有脱落。 5.将细胞板置于37°C无CO2培养箱中1 h。
Cartridge Lid
耗材
自动药物注射端口 启用实时功能分析
实验前一天
水化探针
1.在Utility Plate每孔中加入1ml校准液
(Seahorse XF 校准液用于溶解和校准 XF 小柱，并包含 FluxPak)
2.将Hydro Booster放在Utility Plate上，Sensor Cartridge放在最上面
3.放入无CO2的培养箱，37℃过夜（使校准液能浸没在sensors 中；保证培养箱湿度，防止干燥）
培养细胞
1.100ul 培养液收集细胞，按最佳细胞 密度重悬细胞（10,000 - 80,000个细胞/ 孔）。 2.每孔接种100 μL细胞悬液，背景校正 孔（A1, B4, C3, D6）不接种细胞。将 细胞板室温静置在超净台上1 h。
实验当天 准备XF检测液
一个培养板 手动加液需100ml，仪器加液需 200ml
1.使用NaOH调节pH值至7.35±0.05 2.检测液中所需要添加的底物及浓度取决于细 胞类型和实验设计，或者与生长培养基保持一 致。 3.37℃放置备用。
NO sodium bicarbonate Low phenol red (3 mg/L)