实验三细菌生理生化鉴定-LOPAT试验

菌落圆形，污白色，全缘，微凹，光滑

实验三细菌生理生化鉴定-LOPAT试验

一、实验目的：

1）了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定lopat实验方法

二、实验材料：

猕猴桃溃疡病病原菌（分类地位薄壁菌门Gracilicutes，Proteobacteria纲假单胞菌科Pseudomonadaceae假单胞杆菌属Pseudomonas）、SPA培养基：蔗糖20g，蛋白胨5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.25g，琼脂15g，蒸馏水1000ml

对照SPA培养基：葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.25g，琼脂15g，蒸馏水1000ml

Thornley培养基配方：蛋白胨1g，精氨酸10g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，酚红0.01g，琼脂6g，蒸馏水1000ml

1%二甲基对苯二胺盐酸盐，3×108 /ml的菌液（病原菌），烟草，马铃薯；

灭菌培养皿及培养基（平板）110套、未灭菌培养皿110套，接种针15个，试管110支，接种针55把，滤纸55张，试剂瓶55个，胶头滴管55支，喷壶55个

三、试验方法：

果聚糖试验（Levan formation）：

用细菌悬浮液，在SPA培养基上，再用葡萄糖代替蔗糖培养基平板上分别划线。在25℃条件下培养3–7 d，形成白色、粘稠、圆顶、隆起而有闪光的菌落为阳性反应。

在此条件下，在SPA培养基上可形成前述菌落，果聚糖试验为阳性；而在用葡萄糖代替蔗糖培养基上，不形成前述菌落。

氧化酶试验（oxidase reaction）：

在培养皿内放一张滤纸，滤纸上加3–4滴1%二甲基对苯二胺盐酸盐，使其湿润。用玻棒挑取生长24 h的菌苔涂在滤纸上，若菌苔在10 s内变成紫色，为阳性反应；在60 s以后变色或一直不变色，为阴性反应。

在此条件下，菌苔的氧化酶试验为阴性反应

氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶

马铃薯软腐试验（potato erroring capacity）：

在马铃薯上做刺伤伤口，将细菌接到伤口上，几天后观察，是否出现软腐。

精氨酸双水解酶检验（argine reaction）：

配制Thornley培养基。每试管装3–4 ml培养基灭菌，冷却，针刺接种细菌至培养基底部，立即用凡士林封管，在27℃条件下培养7 d。

在此条件下，精氨酸双水解酶为阴性，颜色不变。

细菌的精氨酸双水解作用是将精氨酸经过两步水解，生成有机胺和无机氨。鉴定细菌的精氨酸试验，无论发酵菌还是非发酵菌，革兰阳性菌还是革兰阴性菌，测的都是精氨酸双水解酶，使用脱羧酶试验培养基。所以，赖氨酸脱羧酶，鸟氨酸脱羧酶和精氨酸双水解酶用同一种基础培养基，为Moeller配方或Falkow配方，均须加盖石蜡油。对于发酵菌，细菌生长后，培养基变黄为阴性，变紫为阳性；对非发酵菌，培养基颜色不变为阴性，变黄为阳性。另有一种精氨酸双水解酶专用培养基，其中使用的是酚红指示剂。这种配方目前已不使用。细菌生化反应表中的精氨酸双水解酶的阳性百分率也不是在这种培养基上做的，所以，该配方实际已淘汰。

烟草过敏性反应（tobacoo hypersensitivity）：

将在26℃条件下，培养72 d的菌株，用无菌水配成3×108 /ml的菌液，对烟草下表皮进行皮下接种，在24 ℃条件下经20–24 h后检查是否出现过敏性坏死斑。

菌落圆形，污白色，全缘，微凹，光滑