病理技术的发展与现状

病理技术的发展与现状 Final approval draft on November 22, 2020

病理技术的发展与现状

病理学是研究疾病发生的、发病原理和疾病过程中发生的、组织和的结构、功能和代谢方面的改变及其规律。

研究方法

病理学的研究方法多种多样，研究材料主要来自自患病（人体病理材料）和实验动物以及其他实验如组织培养、细胞培养等（实验病理材料）。

（一）尸体剖检

对死亡者的遗体进行病理剖检（尸检）是病理学的基本研究方法之一。尸体剖检（autopsy）不仅可以直接观察疾病的病理改变，从而明确对疾病的诊断，查明死亡原因，帮助临床探讨、验证诊断和治疗是否正确、恰当，以总结经验，提高临床工作的质量，而且还能及时发现和确诊某些、地方病、流行病、为防治措施提供依据，同时还可通过大量尸检积累常见病、多发病、以及其他疾病的人体病理材料，为研究这些疾病的病理和防治措施，为发展病理学作贡献。显然，尸检是研究疾病的极其重要的方法和手段，人体病理材料则是研究疾病的最为宝贵的材料。

（二）活体组织检查

用局部切除、钳取、穿刺针吸以及搔刮、摘除等手术方法，由患者活体采取病变组织进行病理检查，以确定诊断，称为活体组织检查（biopsy），简称活检。这是被广泛采用的检查诊断方法。这种方法的优点在于组织新鲜，能基本保持病变的真像，有利于进行组织学、组织化学、细胞化学及超微结构和组织培养等研究。对临床工作而言，这种检查方法有助于及时准确地对疾病作出诊断和进行疗效判断。特别是对于诸如性质不明的肿瘤等疾患，准确而及时的诊断，对治疗和预后都具有十分重要的意义。

（三）动物实验

运用动物实验的方法，可以在适宜动物身上复制某些人类疾病的模型，以便研究者可以根据需要，对之进行任何方式的观察研究，例如可以分阶段地进行连续取材检查，以了解该疾病或某一病理过程的发生发展经过等。此外，还可利用动物实验研究某些疾病的病因、发病机制以及药物或其他因素对疾病的疗效和影响等。这种方法的优点是可以弥补人体观察之受限和不足，但与人体之间毕竟存在种种差异，不能将动物实验的结果直接套用于人体，这是必须注意的。

（四）组织培养与细胞培养

将某种组织或单细胞用适宜的培养基在体外加以培养，以观察细胞、组织病变的发生发展、如肿瘤的生长、细胞的癌变、的复制、染色体的变异等等。此外，也可以对其施加诸如射线、药物等外来因子，以观察其对细胞、组织的影

响等。这种方法的优点是，可以较方便地在体外观察研究各种疾病或病变过程，研究加以影响的方法，而且周期短、见效快，可以节省研究时间，是很好的研究方法之一。但缺点是孤立的体外环境毕竟与各部分间互相联系、互相影响的体内的整体环境不同，故不能将研究结果与体内过程等同看待。

（五）病理学的观察方法

随着学科的发展，病理学的研究手段已远远超越了传统的经典的形态观察，而采用了许多新方法、新技术，从而使研究工作得到了进一步的深化，但形态学方法（包括改进了的形态学方法）仍不失为基本的研究方法。兹将常用的方法简述如下：

大体观察：主要运用肉眼或辅之以、量尺、各种衡器等辅助工具，对检材及其病变性状（大小、形态、色泽、重量、表面及切面状态、病灶特征及坚度等）进行细致的观察和检测。这种方法简便易行，有经验的病理及临床工作者往往能借大体观察而确定或大致确定诊断或病变性质（如肿瘤的良恶性等）。

组织学观察：将病变组织制成厚约数微米的切片，经不同方法染色后用显微镜观察其细微病变，从而千百倍地提高了肉眼观察的分辨能力，加深了对疾病和病变的认识，是最常用的观察、研究疾病的手段之一。同时，由于各种疾病和病变往往本身具有一定程度的组织形态特征，故常可借助组织学观察来诊断疾病，如上述的活检。

细胞学观察：运用采集器采集病变部位脱落的细胞，或用空针穿刺吸取病变部位的组织、细胞，或由体腔积液中分离所含病变细胞，制成细胞学涂片，作检查，了解其病变特征。此法常用于某些肿瘤（如肺癌、子宫颈癌、乳腺癌等）和其他疾病的早期诊断。但限于取材的局限性和准确性，有时使诊断难免受到一定的限制。

超微结构观察：运用透射及扫描对组织、细胞及一些病原因子的内部和表面超微结构进行更细微的观察（电子显微镜较的分辨能力高千倍以上），即从亚细胞（细胞器）或大分子水平上认识和了解细胞的病变。在超微结构水平上，还常能将形态结构的改变与机能代谢的变化联系起来，大大有利于加深对疾病和病变的认识。

组织化学和细胞化学观察：通过运用具有某种特异性的、能反映组织和细胞成分化学特性的组织化学和细胞化学方法，可以了解组织、细胞内各种、酶类、、等等化学成分的状况，从而加深对形态结构改变的认识。这种方法不仅可以揭示普通形态学方法所不能观察到的组织、细胞的化学成分的变化，而且往往在尚未出现形态结构改变之前，就能查出其化学成分的变化。此外，随着免疫学技术的进步，还可运用免疫组织化学和免疫细胞化学的方法，了解组织、细胞的免疫学性状，对于病理学研究和诊断都有很大帮助。

除上述常用方法外，近数十年来陆续建立的还有放射自显影技术、显微分光技术、形态测量（图像分析）技术、分析电镜技术、（FCM）技术、多聚酶链反应

（PCR）技术以及分子原位杂交技术等一系列分子生物学技术，从而使常规的病理形态学观察，发展到将形态结构改变与组织、细胞的的化学变化结合志来进行研究，而且将历来的定性的研究发展到对病理改变进行形态的和化学成分的定量研究，从而获得了大量的更多更新的新信息，大大加深了疾病研究的深度。

病理技术

（一）常规病理制片技术

病理切片是将部分有病变的组织或脏器经过各种化学品和埋藏法的处理，使之固定硬化，在切片机上切成薄片，粘附在玻片上，染以各种颜色，供在显微镜下检查，以观察病理变化，作出病理诊断，为临床诊断和治疗提供帮助。

包括取材、固定、脱水、包埋、切片、染色、封片等几个主要步骤。

1.取材此步骤在技术员协助下由病理完成。

2.固定通过添加固定剂让组织中的所有细胞及细胞外成分迅速死亡，避免细胞中溶酶体成分的破坏作用，保持离体组织细胞与活组织时的形态相似，并防止细菌繁殖所致的腐败，以保存蛋白质与核酸的基本结构。病理标本的制作和组织切片都必须先进行固定。常用固定剂：4%甲醛（10%福尔马林）水溶液、酒精等。其中福尔马林对人体有害。

3.脱水利用脱水剂将组织内的水分置换出来，以利于有机溶剂的渗入。脱水是否彻底，直接关系到组织是否能充分透明，而脱水过度容易造成组织变脆。目前绝大多数医院组织脱水都是通过脱水机来完成，按一定的程序来进行，主要试剂为二甲苯和酒精。

4．包埋用包埋剂来支持组织的过程，最常用的是石蜡包埋法，包埋的关键一是平整，二是方位。蜡的熔点应在56－58℃之间。

5．切片用切片机将包埋有组织的蜡块切成薄片。切片厚度一般为4－6微米，切片的要求是完整、薄、均匀。

6．染色未经染色的组织切片和细胞涂片不能直接在光学显微镜下观察。苏木素和伊红染色（HE）是细胞与组织学最广泛的染色方法。

7．封片切片滴中性树胶后，加盖玻片封片。

（二）特殊染色

为了显示与确定组织或细胞中的正常结构或病理过程中出现的异常物质、病变及病原体等，需要分别选用相应的显示这些成分的染色方法进行染色。包括：胶原纤维染色（Masson等）、网状纤维染色、弹力纤维染色、肌肉组织染色（磷钨酸苏木素）、脂肪染色（苏丹III）、糖原染色（PAS）、粘液染色（PAS）等。

（三）细胞制片

细胞制片包括各种来源的样本的制备，比如宫颈脱落细胞样本、呼吸系统样本、体腔液样本、脑脊液脱落细胞样本、消化道脱落细胞样本等的制备；细胞固定；细胞染色等。

（四）免疫组化

免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的方法。免疫组化方法有直接法和间接法；按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。

（五）分子诊断技术

通过从分子水平上完成DNA、RNA或蛋白质检测，从而对疾病作出诊断的方法称为分子诊断技术，目前常用的方法有基因诊断和肿瘤标志物检测。

1.基因诊断用分子生物学的理论和技术，通过直接探查基因的存在状态或缺陷，从基因结构、定位、复制、转录或翻译水平分析基因的功能，从而对人体状态与疾病作出诊断的方法。基因诊断不仅能对某些疾病作出确切的诊断，如确定某些遗传病，也能确定基因与疾病有关联的状态，如对疾病的易感性、发病类型和阶段的确定等。基因诊断的主要技术有核酸分子杂交（原位杂交、southern杂交、Northern杂交、斑点杂交等）、PCR和生物芯片技术。

2.肿瘤标志物检测是指肿瘤细胞和组织由于相关基因或异常结构的相关基因的表达所产生的蛋白质和生物活性物质，在正常组织中不产生或产量甚微，而在肿瘤病人组织、体液和排泄物中可检测到。此外，在病人机体中，由于肿瘤组织浸润正常组织，引起机体免疫功能和代谢异常，产生一些生物活性物质和因子，虽然这些物质和因子特异性低，但与肿瘤发生和发展有关，也可用于肿瘤辅助诊断。肿瘤标志物分别有：原位性肿瘤相关物质、异位性肿瘤相关物质、胎盘和胎儿性肿瘤相关物质、病毒性肿瘤相关物质，癌基因、抑癌基因及其产物等。肿瘤标志物测定方法包括：生物化学法、免疫组化法、单克隆抗体法。（六）电镜技术

由于电镜产生的电子束穿透能力很弱，必须把标本切成厚度小于微米以下的薄片才能适用，这种薄片称为超薄切片，切片的制作过程基本上和石蜡切片相似。组织从生物活体取下以后，如果不立即进行适当处理，会由于细胞内部各种酶的作用，出现细胞自溶现象，容易出现人为假象，此外，还可能由于组织干燥脱水、微生物污染等使细胞的超微结构受破坏。因此标本取材时必须要做到快、小、冷、准等四大基本要求。电镜分透射电镜和扫描电镜，两者标本的制备各有不同。