2020年第2章 基因工程 上(西南大学 普通生物学)参照模板
西南大学基因工程
第一部分质粒DNA的提取和酶切电泳鉴定实验一质粒DNA的小量制备1．目的学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。
2．原理根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。
在pH12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。
尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。
3．器材超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌器等。
4．试剂Pinpoint™xa-3质粒载体菌，pBS-CHI载体菌，LB培养基1000ml（含100µg/ml氨苄青霉素），葡萄糖/ Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液I），NaOH/SDS溶液(溶液II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液III)，RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8.0）。
5．实验准备氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20°C保存），配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200ml ddH2O 搅拌完全溶解，用约200ml 5N NaOH调pH至7.0，加ddH2O 至1L，121°C 20min灭菌）；溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）；溶液II（0.2mol/L NaOH，1% SDS）；溶液III（60ml 5mol/L Kac，加冰乙酸调pH4.8，补dd H2O至100ml），75%乙醇（-20°C保存），TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDT A pH8.0）；10mg /ml RNase A（RNA酶A溶于10mmol/L Tris HCl pH7.5，15mmol/L NaCl中）；摇菌试管洗净并盖上棉塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（1 21°C 30min）。
XX916BT第2讲基因工程第1讲概论
•With Restriction enzymes •with DNA ligase enzyme
XX916BT第2讲基因工程第1讲概论
基因工程的基本内涵
•
•
•
基因工程是指将一种生物体（供体）的基因
与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生
物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传
PPT文档演模板
XX916BT第2讲基因工程第1讲概论
二、基因工程的重大意义
（1）重组DNA技术填平了生物种属间 不可逾越的鸿沟。
跨越天然物种屏障，将原核和真核生物、 植物和动物，造福人类，在过去人们难以 置信的事情，现在已成为现实。
PPT文档演模板
XX916BT第2讲基因工程第1讲概论
（2）重组DNA技术缩短了进化时。
XX-9-16BT第2讲基因工 程第1讲-概论
PPT文档演模板
2020/11/3
XX916BT第2讲基因工程第1讲概论
概论
PPT文档演模板
XX916BT第2讲基因工程第1讲概论
要求
1、掌握基因工程的概念 2、掌握基因工程的基本过程 3、熟悉工具酶和载体类型及应用 4、熟悉原核、真核细胞转染、表
达的基本方法和类型。 5、熟悉基因工程产生的基础和过程
人类各种疾病发生的分子机理；
人类各种疾病如遗传性疾病、肿瘤、
肥胖、心血管疾病、传染病等病因
的查明、诊断、治疗和预防。
药物的研发和生产；
疾病模型的建立；
人类的营养、健康、长寿和保健（亚健康）
PPT文档演模板
XX916BT第2讲基因工程第1讲概论
PPT文档演模板
XX916BT第2讲基因工程第1讲概论
西南大学基因工程知识点
1.基因工程的基本过程：目的基因+载体—（酶切、连接）重组子—（转化或转染）宿主细胞—选择、筛选（—（导入）表达体系—目的基因表达）—目的基因扩增—目的基因表达2.基因工程的工具：1.基因操作的车间——大肠杆菌和病毒：优点；2.获得基因片段的工具——限制性内切核酸酶：剪刀，回文结构，类型；3.连接基因片段的工具酶——连接酶：浆糊，磷酸二酯链，ATP，NAD+；4.基因操作的载体——质粒和病毒。
3.亚克隆：1.将大片段克隆子的DNA重新打断成小片段，然后分别克隆到新的载体中，供进一步研究；2.通指将DNA片段从一个载体穿梭克隆到另一个载体的过程。
4.限制酶的命名原则：①限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名; 第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名。
②第四个字母代表宿主菌的株或型，正体。
③若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示，正体写在第4个字母之后，字母间无间隔。
例：EcoRⅠ、HindⅢ、SalⅠ5.Ⅱ型限制酶分子内切酶与甲基化酶不在一起；识别位点4-6bp，多为回文序列；切割位点在识别序列内或附近特异切割；限制与甲基化是分开的反应；辅因子为Mg2+；种类多，用途大，多为同源二聚体，其中切口酶只在单链上产生切口，Ⅱs型识别序列和切割位置特殊。
6.限制酶识别序列长度(n)：一般为4-8个碱基对，最常见6bp。
识别位点出现频率：4n7.Ⅱ限制酶切割双链DNA产生3种不同的末端类型：1.对称型突出末端：回文结构决定对称，分为5’突出和3’突出的粘性末端两种；2.平末端：任何平末端酶的酶切产物可以互连，但连接效率比粘性末端低100倍左右；3.非对称的突出末端：因为识别序列是非回文的、简并的或存在间隔序列，故产生的粘性末端也为非对称的。
即使是单酶切限制片段在连接时也具有方向性。
8.限制酶的反应条件：温度大多数为37℃，储存于50%甘油里，多数为10×buffer，有些限制酶用2×buffer，一些限制酶还需添加BSA（牛血清白蛋白）。
生物技术基因工程
•4. 平端连接
•
所用ATP及T4DNA连接酶的浓度比，粘性末端连接要
高些（大于2.5倍）
PPT文档演模板
生物技术基因工程
•四、将重组DNA导入宿主细胞
•1. 转化（transformayion） •将质粒或其它外源DNA导入宿主细胞的过程。
•宿主：大肠杆菌 •感受态细胞（Competent Cell）：E-coli经Cacl2处 理（0-5℃），使细胞膜通透性增加，从而具有摄取外 源DNA的能力。
•
③基因产物易受污染（内毒素）
•
④基因产物对受体菌有毒害作用
•
⑤基因产物易被水解
•
⑥从安全角度——并不理想
•
⑦缺乏基因产物表达后加工机制
PPT文档演模板
生物技术基因工程
•二. 酵母菌受体系统
•特点：①安全性大
•
②遗传信息和生理状况更适合于真核基因表达
•
③基因产物外分泌
•
遗传背景较清楚
•
具基因表达后加工机制
PPT文档演模板
生物技术基因工程
•2、机械降解法 •用超声波震荡等机械法使DNA断裂。
•优点：随机性大 •缺点：所得基因片段不能直接连接，需加工修饰。
•3. cDNA合成•cDNA（Cdna library）：将一个细胞中，所有cDNA都与 载体连接成重组DNA，并列入宿主细胞进行扩质粒（plasmid）：
•种类很多，但作为克隆载体须具备。
•⑴ 分子量相对较小，在细菌中稳定存在，
•
拷贝指数高。
•⑵ 具有遗传标记： 如抗生素性基因
•
—半乳糖酶基因（LacZ）
•⑶ 具 有 多 个 酶 的 单 一 切 点 。 称 多 克 隆 位 点 （
基因工程复习资料
绪论第一节The birth of Genetic Engineering一．基因工程的定义在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。
二．基因工程诞生的理论基础1.DNA是遗传物质（1）肺炎双球菌转化实验（2）噬菌体转染实验2.DNA双螺旋结构三．基因工程诞生的技术突破1.限制性内切酶（restriction enzymes）2. DNA连接酶（ligase）3.载体（vector）4.感受态体系(competence)5.琼脂糖凝胶电泳6.DNA测序技术四．基因工程的诞生1.Berg的开创性实验2. Boyer-Cohen实验六．基因工程的特征1.跨物种性2.无性扩增七．基因工程的主要操作内容1.目的基因的获取2.重组体的制备3.重组体的转化4.克隆鉴定5.目的基因表达第二节基因工程的安全性一、基因工程的安全隐患1.对环境的影响2.新型病毒的出现3.癌症扩散4.人造生物扩散二、重组DNA研究的安全准则1.公众的担忧2.专家的态度3.制定安全规则4.基因工程的安全措施（1）实验室的物理安全分4级：P1—P4级。
（2）实验室的生物安全分3 级（大肠杆菌）：EK1—EK3级。
（3）载体的安全第三节基因工程的应用一、基因工程在农业生产中的应用1.提高植物的光合作用效率（1）提高CO2的固定率（2）提高光能吸收率和转化率2.提高豆科植物的固氮效率3.转基因植物4.转基因动物二、基因工程在工业中的应用1.纤维素的开发利用2.酿酒工业三、基因工程在医药上的应用1.用转基因植物或动物生产药物2.用微生物生产药物3.技术设计高效高特异性的生物制剂4.研制疫苗5.基因诊断6.法医鉴定7.基因治疗四、基因工程在环境保护中的应用1.检测水污染2.生物降解第四节基因工程技术的商业化发展一、商业投资支持现代生物技术研究二、基因工程商业化特点1.技术密集型（1）产品来源于实验室（2）科学家往往就是公司的领导人2.市场扩张迅速3.投入巨大4.风险太高5.产品不断增加6.研究专一、产品专一7.医学生物技术产业进展最快8.专门为基因工程实验提供研发试剂的公司第一章基因工程的主要技术原理第一节DNA的提取与纯化一、质粒DNA的提取1 .碱抽提法提取质粒DNA（1）原理闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。
基因工程细胞工程知识点汇总doc资料
基因工程细胞工程知识点汇总一、基因工程（一）基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
基因工程是在DNA 分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
（一）基因工程的基本工具1•“分子手术刀”一一限制性核酸内切酶（限制酶）（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
2. “分子缝合针” 一一DNA连接酶⑴两种DNA连接酶（E - coliDNA连接酶和T4DNA!接酶）的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键。
②区别：E - coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA1接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
⑵与DNA 聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。
DNA1接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
3. “分子运输车”一一载体（1）载体具备的条件：① 能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。
③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
（2）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
（3）其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒（二）基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的获取1. 目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。
2. 原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。
人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。
3. PCR技术扩增目的基因(1)原理：DNA双链复制(2)过程：第一步：加热至90〜95C DNA军链；第二步：冷却至U 55〜60C,引物结合到互补DNA 链；第三步：加热至70〜75C,热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。
高考生物总复习专题《基因工程》知识研习新人教版选修共张课件(1)
专题 1 基因工程
载体、载体与载体，需要分离纯化才能得到重组质粒。EcoRI酶
切破坏了载体中的四环素抗性基因，只有载体与载体转化的原 核宿主细胞在含四环素的培养基中能生长。因为青霉素基因没 有被破坏，所以目的基因与载体、载体与载体转化的原核宿主
细胞在含青霉素的培养基中能生长。EcoRI和BamHI酶切后有2种
项目
种类 限制酶
作用底物
DNA分子
DNA连接酶 DNA聚合酶
解旋酶
DNA分子片段 脱氧核苷酸 DNA分子
作用部位 作用结果
磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 碱基对间的氢键
形成黏性末 形成重组 形成新的 端或平末端 DNA分子 DNA分子
形成单链DNA分子
专题 1 基因工程
二、载体 1．作用 (1)作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。 (2)利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。 2．具备的条件 (1)能在宿主细胞内稳定保存并大量复制。 (2)有多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。 (3)具有某些遗传标记基因，以便进行筛选。 3．种类
专题 1 基因工程
(3)香蕉组织细胞具有________，因此，可以利用组织培养 技术将导入抗病基因的香蕉组织细胞培育成植株。图中①②依 次表示组织培养过程中香蕉组织细胞的_________________。
【解析】 本题主要考查基因工程的相关知识。(1)由于限 制酶SmaⅠ的切割位点在抗病基因中间，因此不能用限制酶 SmaⅠ来进行切割目的基因。要将目的基因从含抗病基因的DNA 分子中切割下来，从图中看需要用限制酶PstⅠ和EcoRⅠ同时进 行切割。而运载体要和目的基因含有相同的黏性末端才能进行 连接，所以质粒也要用限制酶PstⅠ和EcoRⅠ同时进行切割。 (2)由于卡那霉素能抑制香蕉愈伤组织细胞的生长，所以构建的 基因表达载体A中应含抗卡那霉素基因，作为标记基因。(3)
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
成cDNA
•
3、PCR引物
能够引导模板DNA互补链合成的寡聚核苷酸
5'
3'
3'
5'
3'-OH
15-30个核苷酸
G＋C含量40-60%
浓度一般为0.1-0.5µmol/L
•4、Leabharlann NA片段扩增系统巢式/套式PCR （Nested polymerase chain reaction）
T4DNA聚合酶 T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出的一种特 殊的DNA 聚合酶 具5’→3’的聚合酶活性 3’ → 5’的核酸外切酶活性
用途 标记探针DNA片段，DNA测序。
•
T7噬菌体DNA聚合酶 来源T7噬菌体感染的大肠杆菌 持续合成最强的DNA聚合酶 合成的长度比其他聚合酶要长
•
逆转录酶（Reverse transcriptase） 一类依赖于RNA的DNA聚合酶 以RNA为模板 催化脱氧-5’-三磷酸合成DNA 具有Rnase H活性
第二章 基因工程
基因工程的优点 打破物种界限 可实现 原核生物与真核生物、动物与植物 的遗传信息进行相互重组和转移
•
基因工程研究的理论依据 1）不同基因具有相同的遗传物质 2）基因是可切割 3）基因是可以转移 4）多肽与基因之间存在对应关系 5）遗传密码是通用的 6）基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代
先用一对引物对模板进行扩增
再用另一对引物扩增第一对引物扩增的产物
5'
P1
P3
P4
3'
外引物 第一次扩增所用引物
3'
P2
5'
内引物 第二次扩增作用的引物
优点 用途
因为同两套引物都互补的靶序列很少降低 了扩增多个靶位点的可能性
主要用于极少量的•模板的扩增
反向PCR（reverse PCR） 扩增引物与PCR序列方向相反
•
5、限制性内切核酸酶酶切DNA的方法 1）单酶切 2）双酶切 3）部分酶切
•
三、特异性DNA片段的PCR扩增
1、PCR原理
PCR包括3个反应 变性（90-95℃） 双链DNA变性成单链
复性（36-60℃）
引物同单链DNA互 补序列结合 延伸（70-75℃） DNA聚合催化（7075℃）使引物延伸。 如此经过25-40次循环。 •
平齐末端（blunt end） 两条链断裂的位置处在识别序列的对称结构中心，产 生的DNA末端是平齐的。
•
同尾酶（isocaudamer） 限制性内切虽然识别序列不同，但切割DNA片段具
有相同的粘性末端。
如： BamH I的识别序列GGATCC Bcl I的识别序列TGATCA
•
4、限制性内切核酸酶反应系统 底物（环状或线状双链DNA） 缓冲液 温度（37℃）
•
Taq DNA聚合酶 一种耐热的依赖DNA的DNA聚合酶 具5’→3’聚合酶活性 具5’→3’外切酶活性
最大特点：耐高温。
•
DNA聚合酶Ⅰ 大肠杆菌PolA基因编码的一种单链DNA聚合酶 PolⅠ有三种不同的酶活性 5’→3’的聚合酶活性 5’→3’的核酸外切酶活性 3’ → 5’的核酸外切酶活性 DNA聚合酶Ⅰ的主要用途 通过切口平移标记DNA分子，测序。
•
限制性内切酶 分为I、II、III型酶。基因工程中使用的为Ⅱ酶。 I型酶：先识别，移动后在切割。 II型酶：识别处切割DNA。 III型酶：识别和切割相差限定数核苷酸。
•
2、限制性核酸内切酶的识别序列 识别序列(识别位点) 限制性内切酶在DNA 分子上能识别的特定核苷酸序列 如： EcoR I的识别序列为 5'GAATTC3' 3'CTTAAG5'
•
（2）携带遗传信息
•
1）DNA分子转录合成RNA DNA分子上只有编码基因的片段才能转录合成相应
的RNA（mRNA、rRNA、tRNA）。
•
mRNA
TU
•
tRNA
•
核糖体RNA (rRNA) 原核生物
•
原核生物
•
2）mRNA翻译合 成蛋白质
缬
酪 色
•
二、 限制性内切核酸酶和DNA片段化
•
第一节 DNA重组
一、DNA
1、核酸的组成与结构 DNA是一类由四种脱氧核苷酸（A、T、G、C） 聚合而成的大分子 核苷酸分子由戊糖、磷酸和碱基组成。
•
（1）核酸的组成 碱基
•
核糖
•
核苷
•
核苷酸
•
（2）DNA的结构
•
单链DNA
•
双链DNA
•
2、DNA的功能 （1）DNA分子能在细胞内复制
•
不同限制性内切酶产生DNA片段大小
•
3、限制性核酸内切酶的酶切位点 Ⅱ型限制性内切酶的切割位点处在识别序列内
•
同裂酶（isoschizomer） 有一些限制性内切酶虽来源不同，但有相同的识别序列。 如： BamH I和Bs I具有相同识别序列 5'GGATCC3' 3'CCTAGG5'
•
粘性末端（sticky end） 两条链断裂呈交错对称，产生的DNA末端的一条链多 出几个核苷酸，成为凸出末端。
•
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段
又叫Klenow聚合酶或Klenow大片段酶 是由大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ全酶经枯草杆菌蛋 白酶处理后产生的大片段分子。
Klenow聚合酶的功能
5’→3’的聚合酶活性
3’ → 5’的核酸外切酶活性
Klenow聚合酶的主要用途
修补经限制酶消化的DNA所形成的3'隐蔽末端， 标记DNA末端，cDNA克隆中第二链的合成， DNA序列测定。 •
2、DNA聚合酶(polymerase) 一种催化由脱氧核糖核苷酸合成DNA的酶 以单链或双链DNA为模板 称为依赖DNA的DNA聚合酶
•
DNA聚合酶催化合成DNA互补链的条件 四种脱氧核苷5’-三磷酸 带有3’-OH游离基团的引物链 DNA摸板，双链DNA只有在糖-磷主链 上有缺口时，才是有效的摸板。
主要用于已知序列两翼未知DNA序列的扩增
•
不对称PCR（asymmetric PCR） 两种引物比例相差较大的PCR 用于制备核酸序列分析的单链DNA片段 或核酸杂交的探针
基因工程的关键技术 是DNA的连接、重组，但 是DNA在连接之前必须进 行加工，把DNA分子切割 成所需要的片段。
•
1、限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease） 一类以环状或线形双链DNA为底物， 能识别DNA中的特定核苷酸序列， 在合适条件下，使每条DNA的一个磷酸二酯键断开， 产生3'-OH和3'-P基团DNA片段 的脱氧核酸内切酶(endodeoxyribonuclease)。