2020年第2章 基因工程 上(西南大学 普通生物学)参照模板

T4DNA聚合酶 T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出的一种特 殊的DNA 聚合酶 具5’→3’的聚合酶活性 3’ → 5’的核酸外切酶活性
用途 标记探针DNA片段，DNA测序。
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T7噬菌体DNA聚合酶 来源T7噬菌体感染的大肠杆菌 持续合成最强的DNA聚合酶 合成的长度比其他聚合酶要长
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逆转录酶（Reverse transcriptase） 一类依赖于RNA的DNA聚合酶 以RNA为模板 催化脱氧-5’-三磷酸合成DNA 具有Rnase H活性
平齐末端（blunt end） 两条链断裂的位置处在识别序列的对称结构中心，产 生的DNA末端是平齐的。
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同尾酶（isocaudamer） 限制性内切虽然识别序列不同，但切割DNA片段具
有相同的粘性末端。
如： BamH I的识别序列GGATCC Bcl I的识别序列TGATCA
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4、限制性内切核酸酶反应系统 底物（环状或线状双链DNA） 缓冲液 温度（37℃）
先用一对引物对模板进行扩增
再用另一对引物扩增第一对引物扩增的产物
5'
P1
P3
P4
3'
外引物 第一次扩增所用引物
3'
P2
5'
内引物 第二次扩增作用的引物
优点 用途
因为同两套引物都互补的靶序列很少降低 了扩增多个靶位点的可能性
主要用于极少量的•模板的扩增
反向PCR（reverse PCR） 扩增引物与PCR序列方向相反
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第一节 DNA重组
一、DNA
1、核酸的组成与结构 DNA是一类由四种脱氧核苷酸（A、T、G、C） 聚合而成的大分子 核苷酸分子由戊糖、磷酸和碱基组成。
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（1）核酸的组成 碱基
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核糖
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核苷
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核苷酸
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（2）DNA的结构
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单链DNA
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双链DNA
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2、DNA的功能 （1）DNA分子能在细胞内复制
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限制性内切酶 分为I、II、III型酶。基因工程中使用的为Ⅱ酶。 I型酶：先识别，移动后在切割。 II型酶：识别处切割DNA。 III型酶：识别和切割相差限定数核苷酸。
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2、限制性核酸内切酶的识别序列 识别序列(识别位点) 限制性内切酶在DNA 分子上能识别的特定核苷酸序列 如： EcoR I的识别序列为 5'GAATTC3' 3'CTTAAG5'
第二章 基因工程
基因工程的优点 打破物种界限 可实现 原核生物与真核生物、动物与植物 的遗传信息进行相互重组和转移
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基因工程研究的理论依据 1）不同基因具有相同的遗传物质 2）基因是可切割 3）基因是可以转移 4）多肽与基因之间存在对应关系 5）遗传密码是通用的 6）基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代
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Taq DNA聚合酶 一种耐热的依赖DNA的DNA聚合酶 具5’→3’聚合酶活性 具5’→3’外切酶活性
最大特点：耐高温。
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DNA聚合酶Ⅰ 大肠杆菌PolA基因编码的一种单链DNA聚合酶 PolⅠ有三种不同的酶活性 5’→3’的聚合酶活性 5’→3’的核酸外切酶活性 3’ → 5’的核酸外切酶活性 DNA聚合酶Ⅰ的主要用途 通过切口平移标记DNA分子，测序。
2、DNA聚合酶(polymerase) 一种催化由脱氧核糖核苷酸合成DNA的酶 以单链或双链DNA为模板 称为依赖DNA的DNA聚合酶
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DNA聚合酶催化合成DNA互补链的条件 四种脱氧核苷5’-三磷酸 带有3’-OH游离基团的引物链 DNA摸板，双链DNA只有在糖-磷主链 上有缺口时，才是有效的摸板。
基因工程的关键技术 是DNA的连接、重组，但 是DNA在连接之前必须进 行加工，把DNA分子切割 成所需要的片段。
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1、限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease） 一类以环状或线形双链DNA为底物， 能识别DNA中的特定核苷酸序列， 在合适条件下，使每条DNA的一个磷酸二酯键断开， 产生3'-OH和3'-P基团DNA片段 的脱氧核酸内切酶(endodeoxyribonuclease)。
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不同限制性内切酶产生DNA片段大小
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3、限制性核酸内切酶的酶切位点 Ⅱ型限制性内切酶的切割位点处在识别序列内
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同裂酶（isoschizomer） 有一些限制性内切酶虽来源不同，但有相同的识别序列。 如： BamH I和Bs I具有相同识别序列 5'GGATCC3' 3'CCTAGG5'
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粘性末端（sticky end） 两条链断裂呈交错对称，产生的DNA末端的一条链多 出几个核苷酸，成为凸出末端。
主要作用 将mRNA反转录
成cDNA
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3、PCR引物
能够引导模板DNA互补链合成的寡聚核苷酸
5'
3'
பைடு நூலகம்3'
5'
3'-OH
15-30个核苷酸
G＋C含量40-60%
浓度一般为0.1-0.5µmol/L
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4、DNA片段扩增系统
巢式/套式PCR （Nested polymerase chain reaction）
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5、限制性内切核酸酶酶切DNA的方法 1）单酶切 2）双酶切 3）部分酶切
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三、特异性DNA片段的PCR扩增
1、PCR原理
PCR包括3个反应 变性（90-95℃） 双链DNA变性成单链
复性（36-60℃）
引物同单链DNA互 补序列结合 延伸（70-75℃） DNA聚合催化（7075℃）使引物延伸。 如此经过25-40次循环。 •
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大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段
又叫Klenow聚合酶或Klenow大片段酶 是由大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ全酶经枯草杆菌蛋 白酶处理后产生的大片段分子。
Klenow聚合酶的功能
5’→3’的聚合酶活性
3’ → 5’的核酸外切酶活性
Klenow聚合酶的主要用途
修补经限制酶消化的DNA所形成的3'隐蔽末端， 标记DNA末端，cDNA克隆中第二链的合成， DNA序列测定。 •
主要用于已知序列两翼未知DNA序列的扩增
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不对称PCR（asymmetric PCR） 两种引物比例相差较大的PCR 用于制备核酸序列分析的单链DNA片段 或核酸杂交的探针
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（2）携带遗传信息
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1）DNA分子转录合成RNA DNA分子上只有编码基因的片段才能转录合成相应
的RNA（mRNA、rRNA、tRNA）。
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mRNA
TU
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tRNA
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核糖体RNA (rRNA) 原核生物
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原核生物
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2）mRNA翻译合 成蛋白质
缬
酪 色
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二、 限制性内切核酸酶和DNA片段化