烟草转化及CoIP方法
烟草遗传转化实验
烟草遗传转化实验文件管理序列号：[K8UY-K9IO69-O6M243-OL889-F88688]实验八植物细胞悬浮培养实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。
实验器材：超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、镊子、酒精灯等。
配置MS液体培养基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇 +3% 蔗糖，pH 5.8）分装于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。
实验材料：烟草叶片愈伤组织。
实验方法：1.70%乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等放入工作台。
打开紫外灯和风机，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。
2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入150ml三角瓶中并轻轻夹碎,每个三角瓶加入培养基20-30ml，每瓶接种1-2g愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基1∶10的比例，以保证最初培养物中有足够量的细胞。
3.接种后的三角瓶用天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速100-120rpm，25℃下培养以及散射光条件下，进行振荡悬浮培养。
4.每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换1/3。
每次更换新鲜培养基时称取重量。
5. 每个人接种悬浮培养细胞1瓶，观察并记录细胞生长情况。
6. 培养7天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图：鲜重法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，绘制鲜重增长曲线。
烟草遗传转化实验实验目的烟草是遗传转化的模式植物，已经建立了一套完善的转化再生体系。
本实验以烟草为实验材料，了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤，掌握遗传转化的基本操作技术。
实验要求：掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法；理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理；了解转基因植物筛选的方法。
实验原理根癌农杆菌是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒，简称为Ti质粒。
PPT文档-烟草香味物质的存在-降解和转化
茄酮是烟草中很重要的香味物质，
它的进一步反应产物大多也具香味，在 酸的催化作用下，茄酮端基烯健与水作 用生成一个环氧化的中间产物，此中间 产物不稳定，它的酮基与环氧基反应可 形成一个杂氧的双环化合物，这一结构 的化合物具有特别的香味，在改变烟草 香味方面很有用处，另外，在单线态氧 化作用，茄酮发生分子重排反应，形成 一个环状化合物——茄呢呋喃，这也是 一个很重要的香味化合物。
西柏三烯—4—醇
西柏三烯西柏-4三，烯—64，-6二—二醇醇（（非对非映异对构体映） 异构 体）
西柏烷类化合物最初是以无味物质存在于鲜烟叶中，
经过调制和陈化，烟草中的一些物质会发生反应
从而转化为其它物质。西柏烷类也不例外，例如 西C成15柏的、三降C1烯解4和经产C生物13的物的低降总级解数化，可合发超物生过（二60图重种2断。）裂西经可柏过以三降生烯解成的后C降生18、 解质产茄物酮（。C它13在）烟是草大香家味熟中知起的着烟重草要中作的用重。要不香仅味物西 柏烯可以降解生成茄酮，其它西柏三烯-4，6-二 醇在一定条件下也可以转化成茄酮。
再见
研究发现，天然食品的香味
物质，例如：萜类、醇类、醛类、 酮类、内酯 类、羟酸类、氨类
和含硫化合物是在水果与蔬菜中 经酶催化而生成的。而加工食品 产生的香味物质是这些食品本身 所含的某些成分之间经加热反应 而产生的，也即由非酶棕化反应 所产生的。
非酶棕化反应虽然是多种多
样的，但其基本反应类型是氨基 化合物与还原糖或其它羰基化合 物之间经加热而发生的一系列反 应过程。该反应是构成加工食品、 烟草等香味的重要来源。
烟草化学成分大体上可以分为两
类：一类是挥发性的，例如生物 碱类、类脂的降解物等。另一类 是非挥发性的。例如碳水化合物、 氨基酸等。我们知道，由于烟草 成分受遗传背景、生长条件、调 制方法三种因素的控制，因此， 烟草中的香味物质的质量和数量 因烟草品种和质量不同而有差异， 非挥发性的致香化合物可以向挥 发性的香味成分转变是必然的。
干货│免疫共沉淀（CoIP）原理概述及操作流程
干货│免疫共沉淀（CoIP）原理概述及操作流程免疫共沉淀（CoIP）概述及原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法，属于免疫沉淀技术的一类，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。
免疫共沉淀的设计理念是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。
免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第一是天然状态，第二是蛋白复合物。
RIPA Buffer配制基础成分：Tris-HCl（缓冲液成分，防止蛋白变性）NaCl（盐份，防止非特异蛋白聚集）NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液）去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存）注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。
RIPA蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）（用异丙醇配制成200 mM 的储存液，室温保存）EDTA（钙螯合剂；用H2O配制成100 mM 的储存液，PH 7.4）亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1 mg/ml 的储存液，分装，-20℃保存）抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1 mg/ml 的储存液，分装，-20℃保存）胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成1 mg/ml 的储存液，分装，-20℃保存）RIPA磷酸（酯）酶抑制剂激活的Na3VO4（用H2O配制成200 mM 的储存液，见Sodium Orthovanadate Activation Protocol）NaF（200 mM 的储存液，室温保存）注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂工作液配制：配制100 ml 的modified RIPA buffe：1. 称取790 mg 的Tris-Base，加到75ml 去离子水中，加入900 mg 的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.4。
烟草转化方法及各类培养基配方
表1 烟草转化中使用培养基Table.1 List of the culture mediums in genetic transformation of tobacco培养基Culture medium 成分ingredientspH值pH继代培养基Subculture medium MS 5.8 共生培养基（To）Symbiotic culture medium MS+2.25mg/L6-BA+0.3mg/LNAA 5.8 筛选培养基（To＋）Sifting medium MS+2.25mg/L6-BA+0.3mg/LNAA+400mg/Lcef+100mg/Lkam 5.8 壮芽培养基（P8＋）Budding selection medium MS+0.1mg/L6-BA+0.01mg/LNAA+400mg/Lcef+100mg/Lkam 5.8 生根培养基（1/2MS＋）Rooting medium 1/2MS+400mg/Lcef+100mg/Lkam 5.8 注：cef：头孢霉素，kam：卡那霉素； Note: cef: cefotaxime；kan: KanamycinMS基础培养基配方：（1L的配方）1/2 MS基础培养基配方：（1L的配方）MS 大量：50ml MS 大量：25mlMS 微量：5ml MS 微量：2.5mlMS 铁盐：5ml MS 铁盐：5mlMS 有机：5ml MS 有机：5ml糖：30g 糖：30g琼脂：7.5g 琼脂：7.5g6-BA母液浓度：0.5mg/mlNAA母液浓度： 0.5mg/mlCef（头孢霉素）母液浓度：200mg/mlKam（卡那霉素）母液浓度：100mg/ml注意：高温会导致Cef（头孢霉素）和Kam（卡那霉素）分解，因此需要在培养基灭菌冷却后再在超净工作台内加入。
LB培养液配方：（1L的配方）NaCl 10g （10g/L）胰蛋白胨（TRYPTONE）10g （10g/L）酵母提取物（YEAST EXTRACT）5g （5g/L）LB固体培养基在液体配方的基础上1L加13g琼脂粉。
农杆菌注射烟草转化
农杆菌注射烟草转化编辑整理：尊敬的读者朋友们：这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（农杆菌注射烟草转化）的内容能够给您的工作和学习带来便利。
同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。
本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为农杆菌注射烟草转化的全部内容。
农杆菌注射烟草实验步骤农杆菌转化1. 取1µl 质粒加入50µl 刚冻解的农杆菌感受态中（提前准备1mlLB 培养液，1.5ml 灭菌管,电击杯，移液枪，枪尖等）.★感受态易失效，准备工作须充分2.吸取菌液打入电击杯，（不要产生气泡)，放入电击仪（调manal 至1。
6—1。
7）。
3.电击完立即加入1mlLB 培养基，混匀，并吸至新的离心管中。
4.28℃,摇2h （过程中可以准备抗性板子，或提前准备)。
5.涂板，(使用kan+rif 双抗板）28℃培养36h 。
6. 可做菌落PCR 检测是否转化成功,同时做菌种保藏（根据实验需要）.接菌注射1. 挑菌转接3ml 双抗培养基，27℃摇菌过夜。
★玻璃试管摇菌效果要好些2. 取20µl 菌液到20 mlLB 培养基中，(20mlLB + 100ml/L MES + 20µmol/L AS+500µlkana/L ）摇菌过夜至OD 值为1.0-1.5.●不加Rif ★准备两份，最后调OD 值会用到。
3. 3560r/min ，10min 弃上清.4. 配缓冲液MMA （H 2O+MES 10ml +MgCl 2 10ml +AS 1ml ），现配现用。
用等量缓冲液重悬菌液。
一份等量,一份少量5. 调菌液OD 值至1。
0，室温放置1h 。
将需要混合的菌液等体积混合,可注射。
烟叶发酵的化学原理课件
什么？ 11、赖百当类在烟叶发酵过程中主要产生哪些香气物质？其香气特点是
什么？
一、非酶棕色化反应机理
1.hodge的阐述
2.Vernin等的简化
（1） 糖类和氨基酸的缩合反应
2 阿马杜里和海因氏重排反应
3 阿马杜里和海因氏中间体的重排和脱氨
4 阿马杜里和海因氏中间体的裂解, 形成二羰基化合物
5 糠醛类和呋喃酮的生成
阿马杜里或海因氏重排所产生的中间体, 脱氨形成还原酮 类, 可以环化为糠醛类化合物。中间体重排的还原酮最终可以 转化为呋喃酮。
图9-15 泪柏醇的降解
图9-16 硬尾醇的降解
思考题
1、烟叶发酵的概念是什么？ 2、简述烟叶发酵的机 理。 3、烟叶发酵过程中干物质为什么会损耗？ 4、烟叶发酵过程中淀粉和水溶性糖发生什么变化？ 5、在烟叶发酵过程中主要含氮化合物发生什么变化？ 6.在烟叶发酵过程中有机酸发生什么变化？其机理是什么？ 7、美拉德反应的机理可概括为哪几个方面？ 8、影响美拉德反应产物香气的因素有哪些？ 9、类胡萝卜素在烟叶发酵过程中主要产生哪些香气物质？其香气特征是
6 氨基酸的斯特雷克尔降解
Байду номын сангаас
7 醛醇缩合反应
8 各种杂环化合物的生成
A.吡喃类化合物
B.吡咯类化合物 C. 吡嗪类化合物
二、影响非酶棕色化反应的条件
反应温度 反应物种类
反应时间
非酶棕色化反应
压力
水分 pH
（一）反应物的种类 （二）反应温度
三、非酶棕色化反应产物中的代表性香气物质
第四节 烟叶发酵过程中萜烯类化合物的降 解和香气物质的形成
烟草转化方案
利用农杆菌侵染烟草进行体内瞬时表达的方法[精华提要]通常，我们可以利用烟草的瞬时表达系统来观察感兴趣蛋白的亚细胞定位（通过与绿色荧光蛋白构成融合蛋白）。
同时，还可以检测蛋白的表达量。
这一个过程是通过农杆菌作为一个工具将目的基因整合到到烟草的细胞内的。
材料与试剂1. 携带表达载体的农杆菌菌株（通常表达载体由35S启动子驱动）2. 2-4周的烟草植株3. LB培养基4. 乙酰丁香酮5. 2-(N-吗啉代) 乙磺酸6. 抗生素7. 注射器工具1. 50ml离心管2. 光谱仪3. 紫外灯4. 荧光显微镜步骤：1. 挑取单克隆于5mlLB液体培养中，28-30°C震荡培养。
通常，LB中加入100ug/ml 庆大霉素（农杆菌株GV3101携带抗性），50ug/ml大观霉素（载体携带）。
2. 将1ml过夜培养的农杆菌转接到25mlLB液体培养基中（加有与1相同的抗生素，另外加入高压灭菌的乙酰丁香酮）。
3. 检测过夜培养的菌液OD600的值。
4. 5000g，15分钟集菌，用重悬液重悬菌体，最终OD600为0.4。
5. 室温放置2-3h后注射烟草。
6. 将侵染液装入5ml注射器内，用拇指按压注射器反板将液体从叶片下表皮注射到烟草叶片内（勿使用子叶）。
注射后，烟草叶片会出现湿润的现象。
7. 注射后2-5天，在便携式长波长紫外灯下检测GFP荧光信号（只适用于荧光很强的叶片）。
8. 通过荧光显微镜或者激光共聚交荧光显微镜检测GFP信号。
同时，可以提取蛋白，检测蛋白的含量。
配方1. 加有相应抗生素的LB液体培养基（一种抗生素是菌株携带，一种为载体携带）。
2. 乙酰丁香酮（100mM 溶于乙醇，-20°C储存）。
3. 1M MgCl24. 重悬液(10mM MgCl2,10mM 2-(N-吗啉代) 乙磺酸(pH5.6)高温高压灭菌15分钟，100uM 乙酰丁香酮，高温高压灭菌)。
5. 乙酰丁香酮（来自Aldrich）：又名3’,5’-二甲基-4’-羟基苯乙酮，或4’-羟基-3’,5’-二甲基苯乙酮。
烟草瞬时转化实验步骤
烟草叶片瞬时转化实验试验方法一、实验材料及药品pCAMBIA 1381Z-Luc载体、Gv3101农杆菌菌株及其感受态、MES、MgCl2、乙酰丁香通、5-6周本氏烟草等二、载体构建及农杆菌转化烟草瞬时转化实验选用融合Luc信号的pCAMBIA 1381Z-Luc载体，载体构建过程是将拟南芥及菊花的FT启动子分别采用双切双连的常规载体构建方式将启动子构建到pCAMBIA 1381Z-Luc载体上，同时将目的基因构建到pMDC43或pMDC32或pORE载体上作为超表达载体进行后续的瞬时转化实验。
通过农杆菌转化的方式，将上述构建好的质粒转化到农杆菌菌株GV3101的感受态细胞中。
三、材料的准备1、烟草植株5-6周幼嫩未开花植株2、携带质粒的农杆菌（GV3101或An105均可）3、YEB培养液（一瓶+K+R、一瓶只+R——pCAMBIA 1381Z-Luc载体为卡纳氯霉素抗性、Gv3101只有r抗性）4、处理液：10mL配方如下母液配方（10ml配方）：0.5M MES 200ul 0.976g1M MgCl2100ul 2.03g100mM乙酰丁香酮10ul 0.196g（使用DMSO溶解）灭菌水加至10ml （若长时间保存，需避光！）四、操作步骤1、农杆菌转化2、转化正确的农杆菌进行过夜培养，同时培养P19菌株（最好先进行划线）3、确定不同农杆菌所加菌液的量：计算公式：V=n×Vfinal×0.5/OD600 VP19= n×Vfinal×0.3/OD600OD600最好在1以上n=注射叶片数Vfinal=悬浮后的终体积多为2ml或3ml 注：在进行转录激活或抑制实验时，一般加入四种农杆菌（包括P19）而对照组往往只加入两种或三种菌液，此时，应使用Gv3101对体系进行补充，计算方法为公式一，具体加入量视对照组缺失的量确定，分别加入一倍或两倍Gv3101进行补充。
全生物降解膜 烟草 生产技术体系
全生物降解膜烟草生产技术体系
全生物降解膜（Bio-based Biodegradable Film）是一种以可再生资源为原料制成的薄膜，它具有良好的可降解性和环境友好性。
在烟草生产中，采用全生物降解膜可以减少对环境的负面影响，并且符合可持续发展的理念。
烟草生产技术体系中使用全生物降解膜的步骤如下：
1.原料选择：选择可再生资源作为原料，如生物基聚合物（如淀粉、聚乳酸等）或植物纤维（如纸浆）。
2.薄膜制备：将选定的原料进行加工和制备，可以采用挤出、吹膜或膜铸造等工艺，制成具有一定厚度和机械性能的全生物降解薄膜。
3.包装应用：将制备好的全生物降解膜应用于烟草产品的包装中。
可以将薄膜切割成适当的尺寸和形状，用于包装烟草产品，保护产品的完整性和品质。
4.使用和降解：烟草产品在使用过程中，全生物降解膜会逐渐分解和降解，最终转化为无毒无害的物质，对环境造成较小的影响。
使用全生物降解膜的烟草生产技术体系有助于减少对传统塑料包装的依赖，降低环境污染和资源消耗。
同时，它也符合人们对环境友好产品的需求，提升了产品的可持续性和市场竞争力。
烟草瞬时转化之欧阳文创编
本氏烟草（N. benthamian）瞬时表达及相关实验方法：一、二、农杆菌介导的烟草瞬时转化：A、实验步骤：1、根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，并转化农杆菌。
2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28℃，200rpm过夜。
*估算时间，防止农杆菌液浓度超过1OD，否则会影响转化效率。
3、当菌液OD值介于0.6~1.0之间时，1000g，5min离心收集农杆菌。
4、用2ml Induction medium（without AS）轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液。
5、重复步骤4。
6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬。
7、室温放置1~4小时8、测OD值，根据实验需要，配置侵染液（组合详见下文）。
9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中。
*使用注射器时注意安全，防止针头扎到手，使用完的注射器要把针头套套上再扔，或者将针头放到注射器里面，避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套，防止交叉污染。
B、试剂：Induction medium：MES-KOH PH 5.710nMMgCl210mMAS 200uM推荐提前配制母液1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。
1M MgCl2过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。
0.2M AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌，分装（避免反复冻融），-20℃。
用高压灭菌的超纯水稀释。
C、关于表达时间：烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间，一般注射24小时之后到一周之内都会有表达。
严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段，但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观，不要错过。
D、关于侵染液浓度：推荐每个菌株的浓度在0.1~0.2之间。
过高的农杆菌浓度会。
亚细胞定位之烟草转化方法
亚细胞定位之烟草转化方法烟草是常见的植物模型，被广泛应用于植物生物学研究中。
研究人员通常通过烟草转化方法，将外源基因导入烟草中，实现对基因的功能研究或产生转基因烟草植株。
烟草转化方法通常包括两个步骤：外源基因构建和烟草转化。
首先，需要构建一个携带外源基因的转化载体。
这个载体通常包含一个启动子、外源基因和终止子。
启动子可以驱动外源基因的转录，终止子可使转录终止。
外源基因可以是一个编码蛋白质的序列，也可以是一个编码RNA或其他功能分子的序列。
构建好转化载体后，接下来可以通过烟草转化方法将其导入烟草中。
烟草转化方法有多种，包括农杆菌介导转化、基因枪法等。
其中，农杆菌介导转化是最常用的方法之一、农杆菌介导转化是利用农杆菌的特性，将外源基因导入烟草细胞中。
首先，需要将转化载体与农杆菌进行共转化，形成转化菌。
接着，将转化菌与烟草叶片进行共同培养，利用农杆菌T-DNA的转移机制，将外源基因导入烟草细胞中。
经过一段时间的培养，将转化的烟草细胞分离培养，最终获得转基因烟草植株。
利用亚细胞定位技术，可以进一步研究转基因烟草植株中外源基因的定位。
常用的方法包括荧光蛋白标记技术和抗体标记技术。
荧光蛋白标记技术可以通过将外源基因与荧光蛋白基因进行融合，使转基因植株产生荧光蛋白标记，从而观察外源基因在细胞内的定位。
抗体标记技术则是将外源基因编码的蛋白质与特异性抗体结合，通过免疫荧光染色等方法观察外源基因的定位。
通过亚细胞定位技术，可以了解转基因烟草植株中外源基因在不同亚细胞位置的分布。
这对于研究外源基因的功能以及其与其他生物分子的相互作用方式非常重要。
此外，亚细胞定位研究也可以为转基因烟草的功能性研究提供重要线索。
总结起来，烟草转化方法是利用烟草作为植物模型，将外源基因导入烟草中的方法。
通过亚细胞定位技术，可以了解外源基因在转基因烟草植株中的定位，进一步研究外源基因的功能和相互作用方式。
烟草转化方法为研究转基因植物提供了重要的工具和方法。
烟草转化方法及各类培养基配方
烟草转化方法及各类培养基配方表1 烟草转化中使用培养基Table.1 List of the culture mediums in genetic transformation of tobacco培养基Culture medium 成分ingredientspH值pH继代培养基Subculture medium MS 5.8 共生培养基（To）Symbiotic culture medium MS+2.25mg/L6-BA+0.3mg/LNAA 5.8 筛选培养基（To＋）Sifting medium MS+2.25mg/L6-BA+0.3mg/LNAA+400mg/Lcef+100mg/Lkam 5.8 壮芽培养基（P8＋）Budding selection medium MS+0.1mg/L6-BA+0.01mg/LNAA+400mg/Lcef+100mg/Lkam 5.8 生根培养基（1/2MS＋）Rooting medium 1/2MS+400mg/Lcef+100mg/Lkam 5.8 注：cef：头孢霉素，kam：卡那霉素；Note: cef: cefotaxime；kan: KanamycinMS基础培养基配方：（1L的配方）1/2 MS基础培养基配方：（1L的配方）MS 大量：50ml MS 大量：25mlMS 微量：5ml MS 微量：2.5mlMS 铁盐：5ml MS 铁盐：5mlMS 有机：5ml MS 有机：5ml糖：30g 糖：30g琼脂：7.5g 琼脂：7.5g6-BA母液浓度：0.5mg/mlNAA母液浓度： 0.5mg/mlCef（头孢霉素）母液浓度：200mg/mlKam（卡那霉素）母液浓度：100mg/ml注意：高温会导致Cef（头孢霉素）和Kam（卡那霉素）分解，因此需要在培养基灭菌冷却后再在超净工作台内加入。
LB培养液配方：（1L的配方）NaCl 10g （10g/L）胰蛋白胨（TRYPTONE）10g （10g/L）酵母提取物（YEAST EXTRACT）5g （5g/L）LB固体培养基在液体配方的基础上1L加13g琼脂粉。
《转基因烟草方法》
《转基因烟草方法》2.材料与方法2.1实验材料植物材料：k326烟草种子药品：ms大量元素，ms微量元素，ms铁盐，吲哚乙酸（iaa），6-苄氨基腺嘌呤（6-ba），烟肌醇（b1b6），蔗糖，琼脂，头孢霉素（cef），羧苄青霉素（carb），卡那霉素（kn）、庆大霉素、利福平等；ms培养基（1l）：大量元素（20x）50ml、微量元素（100x）10ml、fe2+（100x）10ml、蔗糖30g、琼脂8g，ph值约为6.0预培养基（1l）。
大量元素（20x）50ml、微量元素（100x）10ml、fe2+（100x）10ml、6-ba（1000x）2ml、b1b6（200x）5ml、甘氨酸（1000x）1ml、琼脂8g，ph值约为6.0。
高温灭菌后加iaa（0.2mg/l）1ml 分化培养基（1l）：预培养基的基础上加入头孢霉素2ml，羧苄青霉素1ml，卡那霉素1ml.生根培养基（1l）：1/2ms、iaa2mg/l、蔗糖30g/l、琼脂5.8g/l，ph=5.8lb液体培养基（1l）：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、naci10gms0培养基：为不加琼脂的只含大量元素ms培养基2.3实验方法2.3.1浸染菌液制备将含有目的基因的农杆菌在固体lb培养基上划板，28℃下暗培养两天。
挑取单菌落，接种于5ml含50mg.l-1卡那霉素、50mg.l-1链霉素及50mg.l-1利福平的液体lb培养基中，28℃下振荡培养过夜。
活化过夜的农杆菌，按1。
50的比例，稀释到含50mg.l-1卡那霉素的新鲜液体lb培养基中，继续培养至od600值约为0.5。
取培养物1ml，置于无菌离心管中，1xxrpm离心1分钟，弃。
加入100ml的ms0培养基，混匀。
2.3.2烟草转化按叶圆盘法转化烟草。
将剪切好的烟草叶盘放置在预培养基上培养1-2，置于悬菌液中（mso悬浮，可以稀释50—100倍）浸泡3-5分钟。
然后取出，用无菌滤纸吸去其表面的液体。
烟草转化
2.11.1 播种烟草种子用70% 乙醇灭菌30 s，去掉乙醇，无菌水清洗一遍，再用2.5% 次氯酸钠表面消毒7 min，无菌水清洗3-4遍，然后播种于MS基本培养基中。
16 h 光( 50 μmol m-2 s-1)/8 h暗环境下25ºC生长，取4-5叶期左右大小的无菌苗叶片转化。
2.11.2农杆菌的活化和制备（1）用接种环蘸取-80ºC冰箱内保存的含有精氨酸脱羧酶基因的农杆菌涂抹在含50mg/ml Km 的LB平板上划线，放到28ºC的光照生化培养箱中暗培养1-2d；（2）当长出菌落后，用接种环挑取单菌落在含有相同浓度抗生素浓度的LB培养基上划线，放入生化培养箱中28ºC暗培养；（3）2-3d后，将培养基中长出的菌落用镊子刮入不含抗生素的液体MS培养基中，28ºC 200r/min 振荡培养1-2 h；（4）用分光光度计测定菌液的OD600值，并用液体MS稀释，直到OD600=0.4~0.6之间进行侵染。
2.11.3 烟草共培养取苗龄为60d左右烟草的无菌、健壮的、去主脉并用镊子切成5×5cm的叶盘，将其浸入到已经培养好的农杆菌菌液中进行侵染9-12min左右。
然后倒掉菌液，将叶片放到灭菌过的滤纸上吸干菌液，将吸干的叶盘背面朝下，放在放有滤纸的共培养基中进行暗培养3d。
2.11.4选择筛选培养共培养结束后，先用含有400mg/ml头孢霉素的灭菌水清洗叶盘2-3次，用灭菌的滤纸吸干叶盘表面的水分，将叶盘放在筛选培养基中进行筛选培养，一般每周继代一次。
2.11.5生根培养在筛选培养基中筛选2-3周以后，叶盘的周围会分化出抗性芽，当抗性芽长到2-3cm大时，用镊子切下放在生根培养基中进行生根培养。
表15 烟草转化培养基配方Table 15 Culture media used in transgenic tabacco培养基名称组分及含量Km（100mg/ml）将km粉末用水溶解，过滤灭菌，-20℃保存Cef (400mg/ml) 将Cef粉末用水溶解，过滤灭菌，-20℃保存MS基本培养基大量100ml/L，微量10ml/L，甘氨酸10ml/L，肌醇10ml/L，铁盐10m/L，VB 10ml/L，蔗糖35g/L，定容至1L，调PH值5.8共培养培养基MS基本培养基+ 6-BA （2.25mg/L）+ NAA (0.3mg/L)筛选培养基MS基本培养基+ 6-BA (2.25mg/L) + NAA(0.3mg/L) + Km(100mg/L)+ Cef(400mg/L)生根培养基MS基本培养基+ NAA(0.3mg/L) + Km(100mg/L)+ Cef(400mg/L)。
烟草瞬时转化doc资料
烟草瞬时转化本氏烟草（N. benthamian）瞬时表达及相关实验方法：一、农杆菌介导的烟草瞬时转化：A、实验步骤：1、根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，并转化农杆菌。
2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28℃，200rpm过夜。
*估算时间，防止农杆菌液浓度超过1OD，否则会影响转化效率。
3、当菌液OD值介于0.6~1.0之间时，1000g，5min离心收集农杆菌。
4、用2ml Induction medium（without AS）轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液。
5、重复步骤4。
6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬。
7、室温放置1~4小时8、测OD值，根据实验需要，配置侵染液（组合详见下文）。
9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中。
*使用注射器时注意安全，防止针头扎到手，使用完的注射器要把针头套套上再扔，或者将针头放到注射器里面，避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套，防止交叉污染。
B、试剂：Induction medium：MES-KOH PH 5.7 10nMMgCl2 10mMAS 200uM推荐提前配制母液1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。
1M MgCl2 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。
0.2M AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌，分装（避免反复冻融），-20℃。
用高压灭菌的超纯水稀释。
C、关于表达时间：烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间，一般注射24小时之后到一周之内都会有表达。
严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段，但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观，不要错过。
D、关于侵染液浓度：推荐每个菌株的浓度在0.1~0.2之间。
过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎。
烟草转化及CoIP方法
CoIP protocol From Guo Siyi烟草转化体系将含有正确构建质粒的阳性农杆菌克隆在YEB 液体培养基中培养过夜，到OD600 约 1.5 左右（大约20h），同时摇菌P19，它能有效抑制植物对外源导入载体表达的沉默效应，提高表达量。
然后收集菌体，5000 rpm 5min 常温离心，将菌体用侵染缓冲液（10 mM MES，100 μM AS-乙酰丁香酮，50 mM MgCl2）重悬，用紫外分光光度仪测定OD600 值；根据实验要求将含有不同载体组合的菌液混合，同时在每一个组合中也加入P19，最终使得每种菌液成分的OD600 在0.8 左右；然后将混合的菌液在28 ℃下以200 rpm 的转速再培养至少3 h，然后注射合适大小的烟草叶片。
尽可能多的注射烟草叶片，并标记下注射的叶片及对应区域；之后用保鲜膜封闭，在暗中培养2 d，然后再转入光下培养2-3 d，并取材在荧光显微镜下观察GFP 的荧光已确定烟草叶片中外源载体的表达情况，视情况取材做后续的实验。
免疫共沉淀（CoIP）将VER2，TaGRP2 与不同的标签蛋白融合如FLAG-VER2，TaGRP2-GFP，将该载体转化农杆菌获得阳性克隆，然后共同用农杆菌侵染的方法转化烟草。
至少设定两组样品：即FLAG-VER2/TaGRP2-GFP 以及FLAG-VER2/GFP。
检测目的蛋白是否表达：用Bradford 法测定提取蛋白的浓度，然后用SDS-PAGE 分离蛋白（15-30 μg protein/lane）做Western Blot 用（WB）标签抗体FLAG，GFP 检测融合蛋白是否在烟草中表达。
并根据WB 的结果估算实验组（FLAG-VER2/TaGRP2-GFP）与对照组（FLAG-VER2/GFP）的蛋白相对表达量。
Pre-clear：（所有步骤尽量在冰上进行）取两份30 μL protein A/G beads 到EP 管中放于冰上，用600 μL 的蛋白提取buffer 重悬beads，4 ℃离心1000 g 1 min。
一种从烟草碎末中提取抗氧化剂的方法[发明专利]
![一种从烟草碎末中提取抗氧化剂的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/6bafa42d2cc58bd63086bdaa.png)
专利名称：一种从烟草碎末中提取抗氧化剂的方法专利类型：发明专利
发明人：梁俪恩,罗少华,黄艳,黎志坚
申请号：CN201010220525.8
申请日：20100707
公开号：CN101953510A
公开日：
20110126
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种从烟草碎末中提取分离抗氧化剂及其作为烟草添加剂在卷烟加香中的应用，其中抗氧化剂是通过以下方法制得：烟草碎末→溶剂加热回流提取→浓缩→分子蒸馏→酸化→萃取→浓缩→抗氧化剂产品。
其特点是：直接采用烟草碎末在溶剂回流中获得含抗氧化剂的提取液，浓缩后进行分子蒸馏处理，将获得的轻组分进行酸化后加入有机溶剂，以1∶0.5至1∶0.8的比例进行混合萃取，合并有机相，浓缩后获得浅黄色的产品，产品得率10％-15％，产品中抗氧化剂的含量大于6.8％。
按照上述方法进行烟草碎末氧化剂的提取，原料易得，工艺路线短，过程可控，适合工业生产。
由于原料来源于烟草，更适合作为卷烟添加剂应用于卷烟烟丝及过滤嘴上，达到清除自由基的效果。
申请人：澳华达香料科技(广州)有限公司
地址：510530 广东省广州市云埔工业区云埔一路22号
国籍：CN
更多信息请下载全文后查看。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
CoIP protocol From Guo Siyi
烟草转化体系
将含有正确构建质粒的阳性农杆菌克隆在YEB 液体培养基中培养过夜，到OD600 约 1.5 左右（大约20h），同时摇菌P19，它能有效抑制植物对外源导入载体表达的沉默效应，提高表达量。
然后收集菌体，5000 rpm 5min 常温离心，将菌体用侵染缓冲液（10 mM MES，100 μM AS-乙酰丁香酮，50 mM MgCl2）重悬，用紫外分光光度仪测定OD600 值；根据实验要求将含有不同载体组合的菌液混合，同时在每一个组合中也加入P19，最终使得每种菌液成分的OD600 在0.8 左右；然后将混合的菌液在28 ℃下以200 rpm 的转速再培养至少3 h，然后注射合适大小的烟草叶片。
尽可能多的注射烟草叶片，并标记下注射的叶片及对应区域；之后用保鲜膜封闭，在暗中培养2 d，然后再转入光下培养2-3 d，并取材在荧光显微镜下观察GFP 的荧光已确定烟草叶片中外源载体的表达情况，视情况取材做后续的实验。
免疫共沉淀（CoIP）
将VER2，TaGRP2 与不同的标签蛋白融合如FLAG-VER2，TaGRP2-GFP，将该载体转化农杆菌获得阳性克隆，然后共同用农杆菌侵染的方法转化烟草。
至少设定两组样品：即FLAG-VER2/TaGRP2-GFP 以及FLAG-VER2/GFP。
检测目的蛋白是否表达：用Bradford 法测定提取蛋白的浓度，然后用SDS-PAGE 分离蛋白（15-30 μg protein/lane）做Western Blot 用（WB）标签抗体FLAG，GFP 检测融合蛋白是否在烟草中表达。
并根据WB 的结果估算实验组（FLAG-VER2/TaGRP2-GFP）与对照组（FLAG-VER2/GFP）的蛋白相对表达量。
Pre-clear：（所有步骤尽量在冰上进行）
取两份30 μL protein A/G beads 到EP 管中放于冰上，用600 μL 的蛋白提取buffer 重悬beads，4 ℃离心1000 g 1 min。
冰上静止1 min，弃上清。
（重复此操作3 次）
将适量蛋白溶液（根据WB 结果，调整实验组和对照组蛋白样品，使得目的蛋白的表达基本相当，总蛋白在400-600 μg，溶液总体积在1 mL 左右，可用蛋白提取buffer 补齐）加入beads 中，4 ℃颠倒混匀1-2 h；然后4 ℃离心2000g 1 min，将上清转移至新EP 管中，取20 μL 样品待用，即Input。
免疫沉淀：
将上清中加入适量的GFP 抗体，根据WB 结果来加，10-20 倍于WB 的抗体用量。
4 ℃颠倒混匀1-2 h，快到时间时，重新准备两份30 μL protein A/G beads 在新EP 管中放于冰上待用（用蛋白提取buffer 重悬3 次）。
将混匀的蛋白+抗体溶液加入含有beads 的EP 管中，4 ℃颠倒混匀1-2 h。
清洗杂蛋白：
4 ℃离心1000 g 1 min，将上清转移到新EP，此为UBP（unbinding protein），存于冰上待用。
将beads 用wash buffer 清洗4-
5 次，600 μL/次，每次重悬后4 ℃离心1000 g 1 min。
留40 μL 最后一次的wash buffer（即W5）于冰上待用。
洗脱结合蛋白：
将beads 用50 μL elution buffer 洗脱后加10 μL 6×SDS loading buffer，或者用60 μL 1×SDS loading buffer 煮沸5 min。
WB 检测FLAG-VER2 蛋白是否与TaGRP2-GFP 蛋白共沉
淀将洗脱后的样品Elution 及UBP，W5 及Input（实验组+对照组共8 个样品）跑SDS-PAGE 电泳并用FLAG 抗体做Western Blot 检测实验组中是否有FLAG-VER2 的信号带，如有则VER2/TaGRP2 互作，同时对照组中不能有FLAG-VER2 的信号带，并且W5 中不能有信号带。
同时用GFP 抗体确保TaGRP2-GFP/GFP 分别在两组elution 中都能有信号即保证用GFP 抗体做的免疫沉淀成功。