烟草转化及CoIP方法

CoIP protocol From Guo Siyi

烟草转化体系

将含有正确构建质粒的阳性农杆菌克隆在YEB 液体培养基中培养过夜，到OD600 约 1.5 左右（大约20h），同时摇菌P19，它能有效抑制植物对外源导入载体表达的沉默效应，提高表达量。然后收集菌体，5000 rpm 5min 常温离心，将菌体用侵染缓冲液（10 mM MES，100 μM AS-乙酰丁香酮，50 mM MgCl2）重悬，用紫外分光光度仪测定OD600 值；根据实验要求将含有不同载体组合的菌液混合，同时在每一个组合中也加入P19，最终使得每种菌液成分的OD600 在0.8 左右；然后将混合的菌液在28 ℃下以200 rpm 的转速再培养至少3 h，然后注射合适大小的烟草叶片。尽可能多的注射烟草叶片，并标记下注射的叶片及对应区域；之后用保鲜膜封闭，在暗中培养2 d，然后再转入光下培养2-3 d，并取材在荧光显微镜下观察GFP 的荧光已确定烟草叶片中外源载体的表达情况，视情况取材做后续的实验。

免疫共沉淀（CoIP）

将VER2，TaGRP2 与不同的标签蛋白融合如FLAG-VER2，TaGRP2-GFP，将该载体转化农杆菌获得阳性克隆，然后共同用农杆菌侵染的方法转化烟草。至少设定两组样品：即FLAG-VER2/TaGRP2-GFP 以及FLAG-VER2/GFP。检测目的蛋白是否表达：用Bradford 法测定提取蛋白的浓度，然后用SDS-PAGE 分离蛋白（15-30 μg protein/lane）做Western Blot 用（WB）标签抗体FLAG，GFP 检测融合蛋白是否在烟草中表达。并根据WB 的结果估算实验组（FLAG-VER2/TaGRP2-GFP）与对照组（FLAG-VER2/GFP）的蛋白相对表达量。

Pre-clear：（所有步骤尽量在冰上进行）

取两份30 μL protein A/G beads 到EP 管中放于冰上，用600 μL 的蛋白提取buffer 重悬beads，4 ℃离心1000 g 1 min。冰上静止1 min，弃上清。（重复此操作3 次）

将适量蛋白溶液（根据WB 结果，调整实验组和对照组蛋白样品，使得目的蛋白的表达基本相当，总蛋白在400-600 μg，溶液总体积在1 mL 左右，可用蛋白提取buffer 补齐）加入beads 中，4 ℃颠倒混匀1-2 h；然后4 ℃离心2000g 1 min，将上清转移至新EP 管中，取20 μL 样品待用，即Input。

免疫沉淀：

将上清中加入适量的GFP 抗体，根据WB 结果来加，10-20 倍于WB 的抗体用量。4 ℃颠倒混匀1-2 h，快到时间时，重新准备两份30 μL protein A/G beads 在新EP 管中放于冰上待用（用蛋白提取buffer 重悬3 次）。将混匀的蛋白+抗体溶液加入含有beads 的EP 管中，4 ℃颠倒混匀1-2 h。

清洗杂蛋白：

4 ℃离心1000 g 1 min，将上清转移到新EP，此为UBP（unbinding protein），存于冰上待用。将beads 用wash buffer 清洗4-

5 次，600 μL/次，每次重悬后4 ℃离心1000 g 1 min。留40 μL 最后一次的wash buffer（即W5）于冰上待用。

洗脱结合蛋白：

将beads 用50 μL elution buffer 洗脱后加10 μL 6×SDS loading buffer，或者用60 μL 1×SDS loading buffer 煮沸5 min。WB 检测FLAG-VER2 蛋白是否与TaGRP2-GFP 蛋白共沉

淀将洗脱后的样品Elution 及UBP，W5 及Input（实验组+对照组共8 个样品）跑SDS-PAGE 电泳并用FLAG 抗体做Western Blot 检测实验组中是否有FLAG-VER2 的信号带，如有则VER2/TaGRP2 互作，同时对照组中不能有FLAG-VER2 的信号带，并且W5 中不能有信号带。同时用GFP 抗体确保TaGRP2-GFP/GFP 分别在两组elution 中都能有信号即保证用GFP 抗体做的免疫沉淀成功。