Real-Time PCR详细介绍

荧光定量PCR实验指南来源：易生物实验浏览次数：901网友评论0 条荧光定量PCR实验指南关键词：荧光实验指南第一部分一、基本步骤：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；2、引物、探针的设计；3、引物探针的合成；4、反应体系的配制；5、反应条件的设定；6、反应体系和条件的优化；7、荧光曲线和数据分析；8、标准品的制备；二、技术关键：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；从/网点的genbank中下载所需要的序列。

下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。

保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。

然后，再打开DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。

另一种直接用DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“openentrezsequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。

然后要对所有的序列进行排序。

用DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的所有文件，点击“add”或“adda ll”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进行比较。

横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。

有时要设定比较序列的开始与结尾。

有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project”菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80，可调低即可。

再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。

选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimum math percentage”的值。

有时因此个别序列原因，会出现重复序列，碱基的缺失或插入，要对“contig”的序列的排列进行修改，确保排列是每个序列的真实且排列同源性最好的排列。

然后，点击“save”保存即可。

分析时，主要是观察是否全部为一致性的黑色或红色，对于弥散性的红色是不可用的。

2、引物和探针设计2.1引物设计细心地进行引物设计是PCR 中最重要的一步。

理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。

设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。

下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点：²序列选取应在基因的保守区段；²扩增片段长度根据技术的不同有所分别：sybr green I技术对片段长度没有特殊要求；Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp；²避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对；²避免引物自身形成环状发卡结构；²典型的引物18到24个核苷长。

引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。

但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。

较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。

Tm 值在55－65℃，GC含量在40%－60%；²引物之间的TM相差避免超过2℃；²引物的3’端避免使用碱基A；²引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基。

²为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。

2.2 Taqman 探针设计一般设计原则：²探针位置尽可能地靠近上游引物；²探针长度通常在25－35bp，Tm值在65－70℃，通常比引物TM高5－10℃，GC含量在40%－70%。

²探针的5’端应避免使用碱基G。

²整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量。

²为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。

(www.nc /BLAST)2.3TaqmanMGB探针设计介绍MGB探针的优点：²MGB探针较短(14-20bp)，更容易找到所有排序序列的较短片段的保守区。

²短片段探针(14-20bp)加上MGB 后，Tm值将提高10℃，更容易达到荧光探针Tm值的要求。

²MGB探针的设计原则²探针的5’端避免出现G，即使探针水解为单个碱基，与报告基团相相连的G碱基仍可淬灭基团的荧光信号。

²用primerexpress软件评价Tm值，Tm值应为65-67℃。

²尽量缩短TaqmanMGB探针，但探针长度不少于13bp。

²尽量避免出现重复的碱基，尤其是G碱基，应避免出现4个或4个以上的G重复出现。

²原则上MGB探针只要有一个碱基突变，MGB探针就会检测到(MGB 探针将不会与目的片段杂交，不产生荧光信号)。

因此，在进行SNP检测时，为了检测到突变子，即TaqmanMGB不与目的片段杂交，不产生荧光信号，探针目的片段产生荧光信号检测将探针的突变位点尽量放在中间1/3的地方。

注意：为了满足上述要求的4个条件，探针的突变位点可向3’端移动，但突变位点至少在离3’端2个碱基的前方(即必须确保探针的后两个碱基是绝对的保守)，以进行SNP 检测。

反过来，若要进行同类检测，找的是保守片段区，探针中不应有突变位点。

若探针即便是只有13个bp,探针仍不完全保守。

有几个突变，突变位点也应靠近探针的5’端，这样，即便是突变，探针也可与目的片段杂交，产生荧光信号。

另一种方法是设计简并探针，也可达到即使是突变，仍可检测到突变。

2.4 实时多重PCR探针的选择：多重实时PCR的多种含意有两种：一为选择保守的探针和引物，利用不同的染料标记探针，在检测时可根据荧光的颜色来判定不同的产物。

另一种为选择保守的引物，扩增不同长度的目的片段，反应中加入SYBRN染料，最后根据不同目的片段的Tm值来判定不同的物品。

多重实时PCR的荧光探针应为同一类型：如同时为Taqman 探针、或同时为MGB探针、或同时为Beacon 探针。

在多重PCR中，多重PCR的各个引物之间相互干扰和各个探针之间相互干扰分析:设计好各对引物和探针后，重新在用DNAstar软件中的Primerselect软件，打开保守在同一文件中的多重PCR的引物文件，然后两两分别选中所设计的多重引物或两两分别选中所设计的多重探针后，在“report”菜单下“primerpairdimers”,分析上下游引物的dimers。

弹出的窗口中就告诉此对引物有多少个dimer，并对此对引物用dG值进行评价(通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好)。

3、影响PCR及荧光PCR的其他因素引物的设计和选择符合荧光PCR的探针并进行设计对于实时荧光PCR尤其重要。

可以说，不合理的设计意味着绝对的失败。

但是，好的设计并不等于好的实验结果，影响PCR和荧光PCR的因素非常多，下面择其重要进行介绍。

3.1引物退火温度引物的一个重要参数是熔解温度（Tm）。

这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。

Tm对于设定PCR退火温度是必需的。

在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。

合理的退火温度从55℃到70℃。

退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。

设定Tm有几种公式。

确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。

大部分计算机程序使用近邻分析法——从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。

所有oligo软件会自动计算引物的Tm 值。

在设置退火温度时可以如下进行：以低于估算的Tm5℃作为起始的退火温度，以2℃为增量，逐步提高退火温度。

较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。

为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。

引物对的Tm差异如果超过5℃，就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。

如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃。

或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后再根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。

这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

3.2引物浓度引物的浓度会影响特异性。

最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。

较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。

为了确定引物浓度，可以在260nm（OD260）测量光密度值。

然后使用光吸收值和微摩消光系数的倒数（nmol/OD），通过Beers法则（公式1）计算引物浓度。

微摩消光系数可以使用公式2计算。

与大分子双链DNA可以使用平均消光系数不同，确定引物的精确浓度必须使用计算的消光系数。

这是因为引物较短，碱基组成差异很大。

在oligo软件上可以计算出引物的的消光系数（OD/μmol）和消光系数的倒数（μmol/OD）。

一般商业合成的引物以O.D.值表示量的多少，在一般情况下，20个碱基长的引物，1个O.D.加100ul水后引物浓度为50pmol/ul （50μM）。

也可以用OLIGO软件，根据引物的的消光系数（OD/μmol），计算出一定的工作浓度下，引物的加水量。

浓度(μM)＝A260（OD/ml）×稀释系数×消光系数的倒数（nmol/OD）举例：计算某寡核苷酸（溶于1ml水中），取其中的10μl稀释100倍（加入990μl）水中。

在A260处测吸光度为0.2。

计算消光系数的倒数为4.8nmol/OD，代入得：浓度＝0.2（OD/ml）×100×4.8（nmol/OD）＝96nmol/ml＝96μM3.3 引物、探针的纯度和稳定性定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。

部分应用需要纯化，以除去在合成过程中的任何非全长序列。

这些截断序列的产生是因为DNA合成化学的效率不是100％。

这是个循环过程，在每个碱基加入时使用重复化学反应，使DNA从3'到5'合成。

在任何一个循环都可能失败。

较长的引物，尤其是大于50个碱基，截断序列的比例很大，可能需要纯化。

引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。

定制引物以干粉形式运输。

最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。

也可以用双蒸水溶解。

引物的稳定性依赖于储存条件。

应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。

以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。