分子生物学研究方法PCR.pptx
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分子生物学PCR技术课件
2020/4/17
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
14
引物设计基本原则
引物的长度
典型的引物为18-24个核苷酸，在一定范围内 引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列 存在于非目的序列位点的可能性；引物长度的上 限主要与反应效率有关，所以一般又不能太长， 因为过长会导致其延伸温度大于72℃，即Taq酶 的最适温度。
4
Kary B. Mullis
<<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>>
1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大 科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣 获1993年度诺贝尔化学奖。
2020/4/17
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PCR反应条件
1）PCR反应成分
（1）模板 一般100ng DNA模板/100L。模板浓度过高 会导致反应的非特异性增加。
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Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
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（2）引物浓度
0.1-0.5 mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下 降。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
的粗提DNA
2020/4/17
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
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3. PCR反应体系和反应条件
• 反应体系： （五要素）
– 模板（template）
• DNA
分子生物学实验技术ppt课件
质粒转化大肠杆菌的过程
感受态
非定向克隆 +
或
定向克隆
克隆的片段只能按
+ 特定方向连接基因组DNA的构建基因组DNA的类型
质粒（﹤10kb)噬菌体质经双向电泳之后，用蛋白质水解酶裂解成肽段，可 用于质谱分析。通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子， 然后用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比 值（M/Z值）的蛋白离子分离开，经过离子检测器收集分离 的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。
两种离子发生方法： 基质辅助激光解吸附/离子化（MALDI)、电喷雾离子化 （ESI)
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是将编码目的蛋白的基 因与编码噬菌体表面蛋白的基因融合后， 以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的一 种技术。
将不同蛋白的cDNA插入噬菌体载体进 行表达，得到表达不同蛋白的一定规模的 噬菌体展示库 。
将“诱饵”蛋白固定化，基于“诱饵”蛋白与 “猎物”蛋白之间的相互作用，可将展示库 中与固定化的“诱饵”蛋白有相互作用的“猎 物”蛋白分离纯化出来，再对“猎物”蛋白进 行质谱鉴定。
四、蛋白组学研究
蛋白质分离 蛋白质分析 蛋白质相互作用的研究方法： 酵母双杂交技术，噬菌体展示技术，表
面等离子共振技术，荧光共振能量转移 技术，蛋白质微阵列芯片技术，免疫共 沉淀技术，pull-down技术
蛋白质分离
最常用的蛋白质分离技术是20世纪70年代发明的双 向电泳（2-DE），是根据蛋白质的等电点不同在pH 梯度介质中进行第一次分离，即等点聚焦（IEF)，然 后根据蛋白质分子量的不同进行第二次分离，即 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
重叠延伸PCR原理
重叠延伸PCR技术由于使用了具有互补末端的引物， 使PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过 重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。可 简单迅速的将两个DNA片段连在一起，用于嵌合基因的构 建
分子生物学实验技术.pptx
DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环 境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、 有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环 境又可以使DNA复性。
SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞 裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌 细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒 DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放 出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。 然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中 性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分 子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中， 而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底 部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出 来。
2. 启始复制子（ori, Origin of
replication)； 3. 多克隆位点(MSC, Multiple cloning
site or polylinker)； 4. 标பைடு நூலகம்基因(Marker gene, such as
LacZ gene)。
Ampr抗性基因
Ampr抗性基因编码一种周质酶（β-内酰胺酶）可特异地 切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力
分子生物学实验
目录
实验一、植物染色体DNA的提取及纯度鉴定 实验二、大肠杆菌质粒DNA的提取 实验三、琼脂糖凝胶电泳 实验四、ＤＮＡ的限制性酶切 实验五、大肠杆菌感受态细胞的制备及外源DNA
的转化 实验六、PCR基因扩增技术
实验一、植物染色体DNA的提取 及纯度鉴定
一、实验目的
• 掌握真核植物基因组染色体DNA的一种提 取方法
P(BLA) ApaLI (2367)
APr
pUC19
2686 bp
pcr ppt课件教程
引物二聚体
总结词
引物二聚体是指引物之间形成的二聚体，影响PCR扩增效率。
详细描述
引物二聚体的形成可能由于引物设计不当、引物浓度过高、退火温度过低等原因 导致。为解决这一问题，可以优化引物设计，降低引物浓度，适当提高退火温度 等措施。
05
PCR 实验设计
选择合适的引物
引物长度
根据基因序列选择合适的引物长度， 通常为18-30bp。
设置PCR 仪温度循环
设置变性温度
将PCR仪温度设置为95℃，进 行变性处理，使DNA双链解开
成单链。
设置退火温度
根据引物特异性，设置适当的 退火温度，使引物与单链DNA 结合。
设置延伸温度
设置适当的延伸温度，使DNA 聚合酶从引物起始合成DNA链 。
设置循环数
根据实验目的和DNA片段大小 ，设置适当的循环数，确保目
PCR PPT课件教程
目录
• PCR 简介 • PCR 原理 • PCR 实验步骤 • PCR 常见问题与解决方案 • PCR 实验设计 • PCR 数据分析
01
PCR 简介
PCR 定义
• 聚合酶链式反应（PCR）：一种在生物体外复制特定DNA的分子生物学技术，通过DNA聚合酶的作用，以一对寡核苷酸引 物定向导引下完成特定DNA的片段扩增。
在PCR中，DNA的复制是通过特定的引物和聚合酶，在特定的温度和循环次数下完 成的。
引物与模板DNA结合后，聚合酶从引物的3’端开始合成新的DNA链。
聚合酶与引物
聚合酶是生物体内负责DNA复 制的酶，具有耐高温的特性。
在PCR中，常用的聚合酶有Taq 酶和Tfl酶等。
引物是人工合成的短片段DNA ，能够与目标DNA特异性结合 ，为聚合酶提供起始点。
PCR技术原理ppt
• PCR反应用耐高温的 Taq DNA聚合酶，一 次性地将反应液加好后，即在DNA 扩增液 和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般 在2~4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用 电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污 染、易推广
PCR基本原理
PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性 体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性 (Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种 寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键 配对;(3) 延伸(Extension): DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶 的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保 留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复 循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而 且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。 到达 平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 。
聚合酶链式反应也可以当作一项极其重要的酶促合成 DNA技术。PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体 外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新，它 可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。
70年代初，Kleppe等人就提出了PCR的工作原理。Saiki （1985）和Mullis（1986）两家研究室分别用改进的Kleppe 法获得了大量染色体DNA单拷贝基因。当时的PCR技术须在 每次变性和退火后，扩增反应前重新加入DNA聚合酶。1988 年，由于在PCR系统引入了热稳定的TaqDNA聚合酶，这是从 水生栖热菌（Thermusaquaticus）中提取的耐热DNA聚合酶， 简称Taq DNA聚合酶。多次循环后的Taq DNA聚合酶仍然具 有活性，因此反应体系自动往复多次地进行对所需的DNA的 片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，所以命名为聚合酶 链式反应。
PCR基本原理
PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性 体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性 (Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种 寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键 配对;(3) 延伸(Extension): DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶 的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保 留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复 循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而 且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。 到达 平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 。
聚合酶链式反应也可以当作一项极其重要的酶促合成 DNA技术。PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体 外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新，它 可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。
70年代初，Kleppe等人就提出了PCR的工作原理。Saiki （1985）和Mullis（1986）两家研究室分别用改进的Kleppe 法获得了大量染色体DNA单拷贝基因。当时的PCR技术须在 每次变性和退火后，扩增反应前重新加入DNA聚合酶。1988 年，由于在PCR系统引入了热稳定的TaqDNA聚合酶，这是从 水生栖热菌（Thermusaquaticus）中提取的耐热DNA聚合酶， 简称Taq DNA聚合酶。多次循环后的Taq DNA聚合酶仍然具 有活性，因此反应体系自动往复多次地进行对所需的DNA的 片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，所以命名为聚合酶 链式反应。
pcr技术ppt课件
在适中温度下进行延伸，完成一个DNA的复制循环。
通过连续循环，DNA片段数量呈指数增长。
PCR技术的发明和发展
1985年，Mullis和Cetus公司的 合作者Michael Smith在《科学 》杂志上首次公开描述了PCR方 法。
1987年，Innis、Gelfand、 White等人建立了PCR技术的标 准化方案。
退火
将温度降至50℃左右，引物 与单链DNA结合，形成局部
双链。
延伸
温度上升至72℃，DNA聚合 酶从引物起始合成新的DNA
链。
降温及终止反应
每个循环结束后降低温度以终 止反应，准备进入下一个循环
。
03
PCR技术的操作步骤
准备PCR反应所需的试剂和设备
01
准备PCR仪、离心机、移液器等 设备，确保其正常工作。
按照设定的程序进行PCR扩增，记录 扩增曲线和数据。
分析扩增产物
将PCR产物进行电泳或荧光检测 ，观察扩增结果。
利用凝胶成像系统或荧光检测仪 对产物进行分析，确定产物的大
小和浓度。
根据需要，可以进行克隆、测序 等后续操作，进一步验证PCR产
物的准确性和特异性。
04
PCR技术的优缺点
优点
高灵敏度
PCR技术PPT课件
目录
• PCR技术简介 • PCR技术的基本原理 • PCR技术的操作步骤 • PCR技术的优缺点 • PCR技术的应用实例 • PCR技术的未来展望
01
PCR技术简介
什么是PCR技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生 物学技术。
它利用耐高温的DNA聚合酶（通常为Taq酶）在高温下将双链DNA分子 变性解旋为单链，然后通过低温退火使引物与单链DNA分子结合，最后
通过连续循环，DNA片段数量呈指数增长。
PCR技术的发明和发展
1985年，Mullis和Cetus公司的 合作者Michael Smith在《科学 》杂志上首次公开描述了PCR方 法。
1987年，Innis、Gelfand、 White等人建立了PCR技术的标 准化方案。
退火
将温度降至50℃左右，引物 与单链DNA结合，形成局部
双链。
延伸
温度上升至72℃，DNA聚合 酶从引物起始合成新的DNA
链。
降温及终止反应
每个循环结束后降低温度以终 止反应，准备进入下一个循环
。
03
PCR技术的操作步骤
准备PCR反应所需的试剂和设备
01
准备PCR仪、离心机、移液器等 设备，确保其正常工作。
按照设定的程序进行PCR扩增，记录 扩增曲线和数据。
分析扩增产物
将PCR产物进行电泳或荧光检测 ，观察扩增结果。
利用凝胶成像系统或荧光检测仪 对产物进行分析，确定产物的大
小和浓度。
根据需要，可以进行克隆、测序 等后续操作，进一步验证PCR产
物的准确性和特异性。
04
PCR技术的优缺点
优点
高灵敏度
PCR技术PPT课件
目录
• PCR技术简介 • PCR技术的基本原理 • PCR技术的操作步骤 • PCR技术的优缺点 • PCR技术的应用实例 • PCR技术的未来展望
01
PCR技术简介
什么是PCR技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生 物学技术。
它利用耐高温的DNA聚合酶（通常为Taq酶）在高温下将双链DNA分子 变性解旋为单链，然后通过低温退火使引物与单链DNA分子结合，最后
《分子生物学研究法》PPT课件
解决办法：
1 用T4 DNA聚合酶除去PCR产物3’端多余的 核苷酸，成为平端后连接。
2 给平端载体的两个3’端各加上一个T，使 其与3’A突出的PCR产物互补，然后连接。
PCR产物与载体的A-T连接
mRNA
差 别 显 示
利 用
PCR
的
定
点
引物1或引物2的 5’端有不与模板
突
互补的突变。
变
利用PCR的定点突变
在循环温度的设定中，最重要的是退火温度。 退火温度较低可提高扩增效率，但产物的特异性较差； 退火温度较高可提高产物的特异性，但扩增效率较低。
嵌套PCR
( nested PCR)
嵌套PCR主要是为了提 高扩增产物的特异性。
嵌套PCR提高产物特异性的原理
单用第一对引物扩增，得一特异性产物和可能存在的非特异性产物。
循环条件的设定
变性---------→退火----------→链延伸
循环条件举例
循环 首轮循环 中间循环 末轮循环
变性 94℃ 5 min 94℃ 1 min 94℃ 1 min
退火 50℃ 2 min 50℃ 2 min 50℃ 2 min
链延伸 72℃ 3 min 72℃ 3 min 72℃10min
荧光定量PCR
1995年美国PerKin Elmer公司研制成功具有 革 命 性 意 义 的 荧 光 定 量 PCR 技 术 ， 它 融 合 了 PCR高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技 术的高精确定量等优点。荧光定量PCR是直接 探测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的 结 果 ， 不 需 要 PCR 后 处 理 或 电 泳 检 测 ， 完 全 闭 管操作，在整个过程中，仅有加入样品的一次开 盖。
1 用T4 DNA聚合酶除去PCR产物3’端多余的 核苷酸，成为平端后连接。
2 给平端载体的两个3’端各加上一个T，使 其与3’A突出的PCR产物互补，然后连接。
PCR产物与载体的A-T连接
mRNA
差 别 显 示
利 用
PCR
的
定
点
引物1或引物2的 5’端有不与模板
突
互补的突变。
变
利用PCR的定点突变
在循环温度的设定中，最重要的是退火温度。 退火温度较低可提高扩增效率，但产物的特异性较差； 退火温度较高可提高产物的特异性，但扩增效率较低。
嵌套PCR
( nested PCR)
嵌套PCR主要是为了提 高扩增产物的特异性。
嵌套PCR提高产物特异性的原理
单用第一对引物扩增，得一特异性产物和可能存在的非特异性产物。
循环条件的设定
变性---------→退火----------→链延伸
循环条件举例
循环 首轮循环 中间循环 末轮循环
变性 94℃ 5 min 94℃ 1 min 94℃ 1 min
退火 50℃ 2 min 50℃ 2 min 50℃ 2 min
链延伸 72℃ 3 min 72℃ 3 min 72℃10min
荧光定量PCR
1995年美国PerKin Elmer公司研制成功具有 革 命 性 意 义 的 荧 光 定 量 PCR 技 术 ， 它 融 合 了 PCR高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技 术的高精确定量等优点。荧光定量PCR是直接 探测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的 结 果 ， 不 需 要 PCR 后 处 理 或 电 泳 检 测 ， 完 全 闭 管操作，在整个过程中，仅有加入样品的一次开 盖。
PCR技术及其应用(医学分子生物学)PPT课件
3’
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
目录
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
1971年，Khorana及其同事提出：经 过DNA变性，与合适引物杂交，用 DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该 过程便可克隆tRNA基因。
目录
体系组成
模板DNA、DDDP、dNTP、SSB 引物酶、连接酶、拓扑异构酶、解链酶
DNA复制的基本过程
复制的起始 复制的延伸 复制的终止
1993 Nobel prize
目录
本章要讲述的主要内容：
一、PCR的基本原理 二、PCR的体系组成 三、PCR的实施 四、PCR的结果分析及条件优化 五、PCR的类型与应用 六、PCR的相关仪器介绍
目录
一、PCR的基本原理
The polymerase chain reaction is used to amplify a segment of DNA that lies between two regions of known sequence.
酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。 此酶的发现使PCR得以广泛应用。
1989 年，Science 将PCR中的Taq DNA多聚酶命名 为当年的风云分子 (Molecule of the year)
目录
94℃
55℃
72℃
PCR循环
目录
“I do my best thinking while driving”
温度(℃)
40 50 60 70 80 90 100
Saiki将耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用 热变性解链DNA模板可行。
《PCR技术及应用》PPT课件
•引物特异性探针 Amplifluor (Intergen)
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Excitation
SYBR-Green I
5’
SG SG
3’
Emission
SG
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3’
SG
5’
SG
50
SYBR-Green I
DNA
94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100
酶 80 活 性 60
40 20
40 50 60 70 80 90 100
温度(℃)
(%)
PCR技术的原理
1 PCR技术的基本原理
无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入 适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单 核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物, 通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶 段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因 拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环, 最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区 段的DNA带。
Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer
PCR技术的基本过程(2)
琼脂糖凝胶电泳
PCR技术的基本过程(3)
3 PCR反应条件
1）PCR反应成分
（1）模板
单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制 剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
3）操作简便易行
PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳 法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板 序列。
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DNA
94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
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酶 80 活 性 60
40 20
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温度(℃)
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PCR技术的原理
1 PCR技术的基本原理
无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入 适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单 核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物, 通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶 段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因 拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环, 最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区 段的DNA带。
Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer
PCR技术的基本过程(2)
琼脂糖凝胶电泳
PCR技术的基本过程(3)
3 PCR反应条件
1）PCR反应成分
（1）模板
单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制 剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
3）操作简便易行
PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳 法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板 序列。
第5章 分子生物学基本研究方法6-RT-PCR ppt课件
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光 信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准 曲线对未知模板进行定量分析的方法
西北师范大学 精品课程 武国凡
分子生物学与基因工程
原理
第五章 分子生物学基本技术5-RtPCR
常 规 PCR技术：
对PCR的终产物进行定量和定性分析
无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应 进行实时检测
西北师范大学 精品课程 武国凡
分子生物学与基因工程
第五章 分子生物学基本技术5-RtPCR
SYBR Green 法 --PCR反应的建立
反应体系的建立及优化: 1. SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不
易检测 2. Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 3. MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 4. 反应Buffer 体系的优化 5. 反应温度和时间参数:由酶和引物决定 6. 其他与常规PCR相同
SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
5’
SG
SG
SG
3’
3’
No Emission SG
5’
SG
SG
SG
SG
5’
3’ Emission
3’
SG
SG
SG
5’
SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光。
•
n：扩增反应的循环次数
•
X0：初始模板量
•
Ex：扩增效率
西北师范大学 精品课程 武国凡
分子生物学与基因工程
分子生物学实验课件 5PCR基因扩增
2020/11/13
作者:蒋华云
PCR Cycle 2
Two single strands of correct length
End cycle 2
2020/11/13
作者:蒋华云
End cycle 3
2020/11/13
作者:蒋华云
End cycle 4
2020/11/13
作者:蒋华云
Following n cycles of PCR there will be No(1+Y)n copies
作者:蒋华云
反应缓冲液
一般含100mmol/L Tris·Cl （20℃下pH8.3-8.8）, 500mmol/L KCl 和0. 1％的明胶，有时候还有适当浓度的Mg2+
Tris·Cl是一种双极性离子缓冲液，主要靠其调节pH，使Taq DNA 聚合酶的作用环境维持偏碱性
KCl有利于引物的退火，但浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活 性
5’
Taq
3’
3’
Taq 5’
Taq synthesises DNA in the 5’ to 3’ direction
2012-3-202020/11/13
课件作者:作蒋者华云:蒋华云
PCR Cycle 1
Extension 72 ℃
Taq copies DNA strand dNTPs
5’ Taq
2020/11/13
作者:蒋华云
Double stranded DNA template
5’
3’
3’
5’
Region to be amplified
2020/11/13
作者:蒋华云
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组成
50mM KCl
10mM Tris.Cl (pH 8.4) 1.5mM MgCl2
Mg++是Taq酶活性所必需的金属离子。 Mg++浓度的高低能影响反应 的特异性和扩增片断的产率。1.5~2.0mM Mg++是比较合适的。 Mg++ 过量能增加非特异性扩增并影响产率。
4。底物dNTP浓度
在PCR反应中，dNTP浓度应在20~200uM, dNTP浓度过高可加快反应 速度。同时，还可增加碱基的错误掺入率和实验成本。反之，低浓度
的dNTP会导致反应速度的下降，但可提高实验的精确性。此外，由于 dNTP可能与Mg++ 结合，因此应注意Mg++浓度和dNTP浓度之间的关系。
（三）．怎样提高PCR的特异性
• 1．热启动（hot-start)
•
比如（1）将Taq酶与其它反应体系通过石蜡分隔开
•
（2）利用Taq酶的单克隆抗体抑制其活性。
1，基因组DNA步移法
12345
接头
已知DNA序列
接头
PCR
• 2，Inverse PCR
限制酶切点（X）
已知序列
限制酶切点（X）
限制酶X酶切
连接
引物1
引物2
PCR
(二）利用PCR对基因功能进行 分析和改 造
(三） 基因拼接
（四）In vitro evolution of genecoding protein
(6) 引物5‘末端碱基：PCR反应物5’末端碱基并没有严格限制， 只要与 模板DNA结合的引物程度足够，其5‘末端碱基可以不 与模板DNA匹 配，而呈游离状态。这样引物设计时可以在5‘末端加上限制性内切酶 位点或其他短的序列。可以加ATG起始密码，可以加错配碱基造 成突变。
3。PCR反应缓冲液：
• 1。DNA聚合酶：PCR反应使用的是耐热DNA聚合酶。
•
比如：Taq DNA聚合酶。
• 可分为两大类： （1）具有校正功能的（有3‘5’核酸酶活性）
比如：Vent,pfu,pwo等
2。引物
（2）不具有校正功能的 （无3‘5’核酸酶活性） 比如：一般的Taq DNA聚合酶
（1）引物长度以15~30个bp为宜。引物过短会使特异性降低， 过长时则成本增加，且也会降低特异性。
• 10、人的志向通常和他们的能力成正比例。13:03:2413:03:2413:0310/23/2020 1:03:24 PM • 11、夫学须志也，才须学也，非学无以广才，非志无以成学。20.10.2313:03:2413:03Oct-2023-Oct-20 • 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。13:03:2413:03:2413:03Friday, October 23, 2020 • 13、志不立，天下无可成之事。20.10.2320.10.2313:03:2413:03:24October 23, 2020
（2）引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶堆积现象， 引物G+C含量宜在45~55%左右。
（3）引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在3‘末端不应 有互补链存在。
（4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。要求在引物设计时 进行辅助检索分析。
（5）引物3‘末端碱基：原则上要求引物3’末端与模板DNA一定要配对。 另外引物3‘末端的末位碱基在很大程度上影响着Taq DNA聚合酶 的延伸效率。研究表明，引物3‘末端碱基在错误配对时，不同碱基 的引发效率存在很大差异。当末位碱基为A时，即使在错配的情 况下，也能引发链的合成。而末位碱基为T时，错配时引发效率 大大降低。G,C居于中间，所以3‘末端的末位碱基最好选T,G,C而 不选A.
•
Transition： 嘌呤突变为嘌呤，嘧啶突变为嘧啶
•
Transversion: 嘌呤突变为嘧啶
•
2）A或T转变为G或C的程度，或者是反过的分析
1. RT-PCR方法
基本步骤：
mRNA
AAAA
反转录酶和 基因特异引物
分离mRNA
AAAA
PCR
polymerase
． • 4 Amplification of reassembled products by a conventional
PCR
• 怎样提高高保真的重组体
• 1．在步骤2）使用Mn2+而不是Mg2+ ． • 2 在PCR步骤使用高保真的耐热DNA聚合酶
PCR Random Mutagenesis
． • 1 提高PCR反应体系中Mn2+的浓度（可到640uM）
． • 2 在保持Mn2+浓度的基础上，升高dGTP浓度可进一步提高突变率
怎样获得理想的突变率
• 每1000bp含2-6个突变碱基是理想的突变率
• 1．选择缓冲液
• 2．突变偏向（mutational bias)
• 评估方法：1）transition/transversion
mRNA cDNA
反转录合成cDNA
第一轮PCR合 成双链cDNA
PCR
经多轮PCR合成 大量产物
电泳，鉴定
2,Chromatin immunoprecipitation(ChIP)
主要应用:研究转录因子在体内与其顺式作用元件的结合 原理：
3. DNA甲基化的分析
• 9、春去春又回，新桃换旧符。在那桃花盛开的地方，在这醉人芬芳的季节，愿你生活像春天一样阳光，心情像桃花一样美丽，日子像桃子一样甜蜜。2 0.10.2320.10.23Friday, October 23, 2020
• 2. Touchdown
• 先在高于退火温度下进行几轮PCR循环，然后再在 退火温度 下进行大量扩增。
• 3. Nested PCR
• 先在要扩增片断的外侧设计一对引物，进行PCR，然后以此 PCR产物为模板，再在内侧设计一对引物扩增出我们所要的目的 片断。
二 PCR的应用
（一）未知DNA片断的克隆
DNA Shuffle
• 基本过程
． • 1 Preparation of genes to be shuffled ． • 2 Fragmentation with DNase I ． • 3 Reassembly by thermocycling in the presence of a DNA
分子生物学研究方法
PCR技术在医学中的应用
• 一.多聚酶链反应(Polymerase Chain Reaciton,PCR)
• （一）原理
热变性（94度）
退火（55度）
引物
延伸（72度）
DNA聚合酶 dNTP
变性
引物
退火
经25~30次循环， 目的DNA增加166-7
（二）。PCR反应的主要成分和作用