最新13第13章免疫组织化学技术
免疫学检验技术—免疫组织化学检验技术
（四）标本片的保存 固定好的标本片应尽快荧光染色检查，如需保存，
置-20℃下低温干燥保存。
二、荧光抗体标记及染色
• 荧光抗体是荧光免疫技术的关键试剂，是将荧光素与 特异性抗体通过共价键的方式结合而成。其制备过程通常 包括抗体的标记、纯化和鉴定三步。
• 在已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光抗体，置于 带盖的湿盒内，37℃温育30min。检测不耐热抗原以4℃ 过夜为宜。温育后充分洗涤、干燥、镜检。
（三）方法评价 该技术既可检测抗原，又可检测抗体。由于酶不是
标记在抗体上，而是经抗原（酶）抗体性。 尤其是双桥PAP法，是当今免疫组化技术中敏感性较高 的方法。
四、临床应用
• 酶免疫组织化学检验技术主要用于组织切片或其它 抗原的定性、定位、定量检测。组织切片中各类抗原性 物质，如各类蛋白质、酶、激素、细胞、病毒、肿瘤抗 原、浆细胞中的免疫球蛋白、各种多肽、细胞表面标志 等均可检测。
二、SPA法
• SPA具有和人及许多动物如豚鼠、猪、小鼠、猴 等的IgG Fc结合的能力，这种结合不会影响抗体的 活性。每个SPA分子可同时结合两个IgG分子，也可 一方面同IgG相结合，一方面与标记物如荧光素、过 氧化物酶、胶体金和铁蛋白等相结合。
• 阳性细胞的着色形态（如胞膜型、胞核型、胞质(浆) 型等）及组织分布特点（如局灶型、弥漫型、片块 型等）主要是定位指标
• 哪怕只有少数细胞阳性（只要是抗原所在部位）也 应视为阳性表达
（三）阴性结果
阴性结果不能简单视为抗原不表达，由于染色方 法灵敏度有高低之分，有时可因灵敏度不够，而导致 阴性反应。
• 即过氧化物酶（P）-抗过氧化物酶（AP）法，为酶 桥法的改良，技术要点基本上与酶桥法相同，但该法将 抗酶抗体（抗过氧化物酶（AP））与酶（过氧化物酶 （P））制成了可溶性复合物（PAP）,该复合物由2个抗 酶抗体和3个过氧化物酶分子组成，呈五角形，非常稳定。
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术第一篇：免疫组织化学技术基础免疫组织化学技术是一种利用免疫学原理对细胞或组织进行化学定位的技术。
该技术可以用于鉴定细胞或组织中某种特定抗原的存在及分布情况，从而为病理诊断、学术研究和药物研发等提供有力的支持。
一、免疫组织化学技术的原理免疫组织化学技术的原理是利用抗体与其靶分子间的特异性结合反应，来实现对目标物的检测和定位。
抗体可以识别并结合到人体或动物体内的大部分蛋白质，包括生物芯片检测、ELISA检测、Western blotting等技术所用的基质和抗原。
在免疫组织化学技术中，针对某种抗原的特异性抗体先与组织样本中的特异性抗原发生特异性结合，然后通过检测抗体所标识的色素或荧光物等发射的信号，加以可视化。
例如，用特异性抗体和明胶酶-抗明胶酶复合物在组织样本上进行化学染色，从而定位并可视化样本中的抗原。
二、免疫组织化学技术的步骤1. 样本制备：第一步是样本的制备，包括切片、固定和脱水等处理。
固定组织样本是为了保持其形态和结构，因此往往使用福尔马林等固定剂进行固定。
在制片时，细胞或组织切割成相对较薄的切片，一般为5-10 μm。
切割后，通常漂洗去除固定剂，然后脱水，通常采用乙醇浓度逐渐递增的方法进行。
最后，将切片放置于有机媒介中，如去石蜡等。
2. 抗原修复：切片离体后，抗原结构可能会发生改变，因此需要进行抗原修复。
抗原修复可以通过热处理、酶解或酸解等方式进行。
热处理方法包括水浴、压力釜等；酶解包括蛋白酶和肝素酶等；而酸解则是利用酸将组织溶解并解离抗原。
3. 抗体标记：抗体标记是免疫组织化学技术的核心步骤。
选择具体的抗体，可以选择单克隆或多克隆抗体等。
接着，抗体常被标记为一种检测信号(如与酶或荧光物质结合)。
免疫荧光技术通常是通过荧光标记的二抗或荧光标记的可溶解复合物来可视化。
荧光地染色颜色有多种不同的方式，如荧光素-醌染料、荧光素-异硫氰酸染料等，可以根据不同的研究目的选择不同的荧光染色方法。
临床分析中的免疫组织化学技术进展
临床分析中的免疫组织化学技术进展免疫组织化学技术（Immunohistochemistry，IHC）作为一种重要的临床分析方法，在肿瘤诊断、治疗和预后评估等方面发挥着重要作用。
随着技术的不断进步和应用的广泛推广，免疫组织化学技术逐渐成为临床医学中的一项必备技能。
本文将从技术原理、应用领域和进展方面对免疫组织化学技术进行综述。
一、技术原理免疫组织化学技术是利用抗体与相应抗原结合的特异性反应来检测组织或细胞中特定分子的存在与定位。
其基本原理是将组织切片经过特定的预处理步骤后，使用专门的免疫反应试剂盒，将抗体与待检测的抗原发生特异性结合，并通过染色反应来显示抗原的分布情况。
免疫组织化学技术的核心在于选择合适的抗体，其中包括一抗和二抗。
一抗与待检测的抗原结合后，通过与二抗反应生成复合物，再使用染色试剂可使复合物形成染色沉积物。
通过显微镜观察染色沉积物的颜色和分布情况，可以得出待检测抗原在组织中的表达情况。
二、应用领域免疫组织化学技术已广泛应用于肿瘤学、病理学、免疫学等临床领域。
在肿瘤诊断中，可以通过检测特定标志物的表达来帮助鉴别不同类型的肿瘤，指导临床治疗。
例如，通过检测ER、PR、HER2等标志物的表达情况，可以为乳腺癌患者提供更精确的治疗策略。
在病理学中，免疫组织化学技术可以帮助鉴别病变的类型和性质。
通过检测特定抗原的表达情况，可以确定病变是否来源于肿瘤细胞、病毒感染等。
此外，免疫组织化学技术还可以在肾脏病变、风湿疾病等方面提供重要的诊断依据。
免疫组织化学技术在免疫学研究中也起着重要作用。
通过检测特定免疫细胞或分子的存在与定位，可以揭示机体对疾病或外界刺激的免疫应答过程，对于研究免疫学机制具有重要意义。
三、进展方向随着科学技术的不断进步，免疫组织化学技术也在不断发展和完善。
主要体现在以下几个方面。
1. 抗体的选择和特异性改进。
随着对不同抗原的研究深入，筛选和改进抗体的方法不断提升。
目前，已有多种技术可用于获得高特异性的抗体，如单克隆抗体和人工合成抗体等。
第13章 免疫组织化学技术(共42张PPT)
免疫胶体铁细胞化学染色 法
胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通 过普鲁蓝反应呈色，胶体铁颗粒有一定大小，还具有一 定电子密度，可用在电镜和光镜水平的抗原定位研究。
酶免疫电镜技术
酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物 的反应形成不同的电子密度，借助于电子显微镜观察 ，证明酶的存在，从而对抗原进行定位。
LSCM 应用广泛
细胞器研究-籍特异性荧光探 针。图像清晰，可动态观察 活细胞
罗丹明123染细胞线粒体
鬼笔环肽染涡虫纲扁虫肌动蛋白丝
肿瘤细胞间通讯研究
检测人类癌细胞表皮生长因子
Y
Y
Z
Z
X
X
焦平面（水平面或xy切面）及沿光轴（垂直平面或xz切面）光学切面模式图
分层扫描、光学切片
细胞测量
细胞“CT”片
四、链霉亲合素-生物素法 (LSAB）
链霉亲合素(Streptavidin SA)是从链霉菌培养物提取的一种纯 蛋白，不含糖基，有4个生 物素结合位点，并且具有高度的亲 和力，其功能类似亲合素。
利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组合成酶标链霉亲合 素-生物素方法
第五节 免疫电镜技术
一、免疫标记电镜技术的原理
原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检
测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来 ，达到检测反应分子的目的。 由于生物素化抗体分子上连有多个 生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲合素-酶标生物 素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产 生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。
藤黄微球菌 绿色-活菌 红色-死菌 酶免疫组织化学技术的应用
临床检验技师-临床免疫学和免疫检验(2019)讲义第十三章免疫组织化学技术
第十三章免疫组织化学技术免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。
第一节概述免疫组织化学的基本过程包括：①抗原的提取与纯化；②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；③将标志物与抗体结合形成标记抗体；④标本的处理与制备；⑤抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应；⑥观察结果。
一、标本的处理（一）标本的主要来源1.活体组织：应取材于病变组织及病变与正常组织交界处，大小适中。
减少对组织标本的损伤与挤压。
2.体液、穿刺液：可直接涂片或经离心后取沉淀物涂片。
3.培养细胞：悬浮培养的细胞经离心沉淀后做细胞涂片，盖玻片上的单层培养细胞直接固定。
（二）标本的固定与保存1.标本固定的目的：使细胞内蛋白质凝固，细胞内分解酶反应终止，以防止细胞自溶，保持细胞形态和结构；保存组织细胞抗原性；防止标本脱落；除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织腐败和在后续组织制备中的细胞结构和成分的改变。
标本的固定应以不损伤细胞形态，不干扰固定后抗原的识别和结合为原则。
2.固定剂的选择：蛋白质类抗原，可用乙醇或甲醇固定；微生物抗原可用丙酮或三氯化碳固定；如需除去病毒的蛋白质外壳，可使用胰蛋白酶；多糖类抗原用10%福尔马林固定或以微火加热固定；如有黏液物质存在，应用透明质酸酶等处理除去；类脂质丰富的组织进行蛋白、多糖抗原检测时，需用有机溶剂（乙醚、丙酮等）处理除去类脂。
组织标本常规固定液为中性缓冲甲醛。
3.制片方法的评价：冷冻和石蜡切片是免疫组化最常用的制片方法。
首选冷冻切片。
其操作简便，可避免石蜡切片因固定（甲醛）、脱水、浸蜡等对抗原所造成的损失，适用于不稳定的抗原。
石蜡切片是研究形态学的主要制片方法，它不但是观察组织细胞结构的理想方法，而且可用在陈旧石蜡包埋材料免疫组化的回顾性研究。
免疫组织化学技术的应用
免疫组织化学技术的应用免疫组织化学技术概述免疫组织化学技术是一种利用免疫学原理进行生物分子检测和定位的技术。
它采用抗体与特定抗原结合的顺反应原理，在组织切片中检测和定位某一特定分子。
原理免疫组织化学技术利用抗体与特定抗原结合的顺反应原理，即对一种特定抗原有高度选择性的抗体与组织样品中的该抗原相结合产生可见的信号。
这种信号可以是产生光学、荧光或颜色改变等形式。
应用1.生物医学研究：免疫组织化学技术可以检测组织中特定蛋白质的分布和表达，是研究生物医学领域中蛋白质分子组学的基础技术之一。
2.临床诊断：免疫组织化学技术可以应用于肿瘤诊断、流行病学调查等领域。
通过检测某些肿瘤标志物、细胞表面分子和内分泌指标等，可以帮助医生进行正确诊断。
3.药物制剂：免疫组织化学技术可以帮助研究药物分布和作用机制。
例如，在研究心血管药物时，可以用抗体检测受体的表达和分布，从而了解药物作用机制和药效。
优点1.高度特异性：免疫组织化学技术可以准确地检测特定分子，避免了其他分子的干扰。
2.高灵敏度：可以检测极微量的分子，并精确定位其位置。
3.多样性：可以应用于不同分子种类的检测和定位，有很大的应用前景。
局限性1.抗体交叉反应：某些抗体可能对多种分子有交叉反应，导致误判。
2.样品制备：样品的制备和处理对结果产生影响，需要更加严格的标准化。
3.价格昂贵：用于免疫组织化学技术的抗体相对价格较高，加上试剂盒和设备的购买，成本较高。
结论免疫组织化学技术作为一种重要的实验室技术，具有广泛的应用前景。
这种技术可以在细胞和分子层面上全面解析生物体的结构和功能，是生物医学领域中不可或缺的技术之一。
免疫组织化学技术的操作步骤1.标本制备：首先需要采集组织样本，处理后制成组织切片。
2.抗体处理：挑选合适的抗体，经过处理（如荧光标记、酶标记等），制成特定的抗体试剂。
3.特定抗原检测：在组织切片上滴加特定抗体试剂，进行特定抗原的检测。
4.反应信号检测：根据抗体的标记方式，进行相应信号的检测。
免疫组织化学技术名词解释
免疫组织化学技术名词解释免疫组织化学技术是一种应用于组织学研究和病理诊断中的实验技术，用于检测和定位特定抗原在组织中的表达和分布。
免疫组织化学技术结合了免疫学和组织学的原理和方法，使得我们能够在组织切片中检测到特定抗原，并通过染色的方式将其可视化。
1. 免疫染色：免疫组织化学技术的核心是免疫染色。
免疫染色是通过将特异性的抗体与待检测物质结合，并标记上染色物质，从而实现对抗原的检测和定位。
常用的染色物质包括标记着色剂如酶、荧光物质和金颗粒等。
2. 抗原：抗原是一类能够诱导机体产生抗体的物质。
在免疫组织化学技术中，抗原可以是蛋白质、多肽或者是其他小分子化合物。
通过特异性的抗体和抗原的结合来实现对抗原的检测和定位。
3. 抗体：抗体是机体特异性免疫应答产生的一类蛋白质分子。
抗体能够与特定抗原结合，并通过诱导免疫反应来清除抗原。
在免疫组织化学技术中，通过标记抗体对待检测抗原进行检测和定位。
4. 免疫组织化学染色法：免疫组织化学染色法是一种检测并定位抗原的方法。
根据标记抗体的不同，可以分为酶标法、免疫荧光染色法和免疫金染色法等。
其中，酶标法是最常用的方法之一，通过将酶标记的抗体与待检测抗原结合，然后通过酶的催化作用使染色物质可视化。
5. 免疫组织化学实验步骤：免疫组织化学技术包括多个实验步骤，一般包括组织固定、切片、抗原恢复、阻断、一抗和二抗结合、洗涤、染色和显微镜观察等。
每个步骤都需要严格的操作和控制条件，以保证实验的可靠性和准确性。
6. 免疫组织化学应用：免疫组织化学技术广泛应用于医学研究和病理诊断中。
在医学研究领域，免疫组织化学技术可以用于研究疾病的发生和发展机制、寻找新的生物标志物以及评估药物的疗效等。
在病理诊断中，免疫组织化学技术可以用于帮助确定肿瘤类型、检测特定蛋白的异常表达以及判断预后等。
7. 免疫组织化学技术的优点和局限性：免疫组织化学技术具有高度的特异性和灵敏度，可以实现对细胞和组织水平上抗原的定量和定位。
免疫组织化学技术
（1）多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。 （2）APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷） 干净载玻片→丙酮5min →用镊子夹住浸入APES试剂（ 1ml+50ml丙酮） 1～3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝箔 包好，室温或4℃保存备用。 （3）铬矾明胶液：铬矾0.5g 明胶5g H2O2 1000ml （4）甲醛明胶液：40％甲醛2.5ml 明胶0.5g H2O2 100ml
待稍微风干以后加4％多聚甲醛溶液覆盖细胞 ，固定2－4小时。
在细胞上加一层甘油放-20℃保存。
荧光标记免疫组织化学
直接法
间接法
注意事项
一、抗体的保存
浓缩抗体：有效期内，只需放在 4℃冰箱内，保存时间可达1-3年。
即用型抗体：理论上在4 ℃冰箱内 可保存半年左右。
PBS或抗体稀释液稀释的抗体：一般 只可放置1-2个月。
2）免疫酶标方法 是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶
的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗 粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成 分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。
本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是： 定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于
切片的制作
组织的固定 组织石蜡包埋 切片
组织材料的固定
目的:
（1）防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞 的固有形态。
（2）使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶 性物质，以保持它原有的结构与自然状态时相仿。防止组织细 胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态
光、电镜研究等。 免疫酶标方法目前在病理诊断中广为 使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法检测系统等. 。
免疫组织化学检验技术
免疫组织化学检验技术一、免疫组织化学检验技术简介免疫组织化学检验技术（Immunohistochemistry，IHC）是一种常用的实验技术，它利用抗原-抗体的特异性结合反应，检测组织或细胞中的蛋白质、多肽、激素等生物活性物质。
该技术可用于疾病的诊断、病理学研究、药物靶点筛选等多个领域。
二、免疫组织化学检验技术的基本原理免疫组织化学检验技术的核心是抗原-抗体的特异性结合反应。
这种反应基于抗体和抗原的互补性，即抗体分子中的抗原结合部位能够与抗原分子中的互补部位结合。
在免疫组织化学检验中，将组织或细胞固定在载玻片上，然后加入特异性抗体，通过孵育反应，抗体与组织或细胞中的抗原结合。
随后加入显色剂进行显色反应，根据显色情况判断是否存在相应的抗原。
三、免疫组织化学检验技术的应用例子1.肿瘤诊断：免疫组织化学检验技术可用于肿瘤诊断，通过检测肿瘤组织中的特异性抗原，如癌胚抗原、糖类抗原等，有助于确定肿瘤的性质和分化程度。
例如，乳腺癌患者的肿瘤细胞可能表达ER、PR、HER2等基因蛋白，通过检测这些蛋白的表达情况，有助于指导治疗和判断预后。
2.感染性疾病诊断：免疫组织化学检验技术也可用于感染性疾病的诊断，例如检测病毒抗原、细菌抗原等，有助于确定感染的病原体种类。
例如，在流感病毒感染中，通过检测病毒核蛋白抗原，有助于确诊病毒感染。
3.药物靶点筛选：免疫组织化学检验技术还可用于药物靶点筛选，通过检测目标蛋白在组织或细胞中的表达情况，筛选出可能的药物作用靶点。
例如，在寻找治疗肿瘤的新药时，可利用免疫组织化学技术检测肿瘤细胞中的各种蛋白表达情况，筛选出可能的药物作用靶点。
四、免疫组织化学检验技术的优缺点1.优点：具有高特异性、高灵敏度、操作简便、易于定量等优点。
同时，免疫组织化学检验技术可以用于检测组织或细胞中的蛋白质、多肽、激素等生物活性物质，有助于深入探讨疾病的发病机制和病理过程。
2.缺点：可能会出现非特异性染色和交叉反应，影响结果的准确性。
免疫组织化学技术
临床免疫学检验技术定的一项免疫检测方法。
目录CONTENTS第一节第二节第三节第四节酶免疫组织化学技术第五节第六节影响免疫组织化学技术的主要因素免疫组织化学技术的临床应用免疫标记电镜技术亲和组织化学技术荧光免疫组织化学技术免疫组织化学过程1抗原的提取与纯化2制备特异性抗体3标记物与抗体结合形成标记抗体4标本的处理与制备基本过程5抗原抗体免疫学反应以及标记物呈色反应6观察结果免疫组织化学技术分类酶免疫组织化学技术免疫标记电镜组织化学技术标记物不同荧光免疫组织化学技术亲和组织化学技术免疫金（银）组织化学技术酶免疫组织化学技术0104定义：在一定条件下，应用酶标抗体（抗原）与组织或细胞标本中的抗原（抗体）发生反应，催化底物产生显色反应，通过显微镜观察标本中抗原（抗体)的分布位置和性质，也可通过图像分析技术达到定量的目的。
标本类型：组织切片、组织印片和细胞涂片等。
分类酶桥法过氧化物酶抗过氧化物酶（PAP ）法双桥PAP 法碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶（APAAP ）法非标记抗体酶免疫组化技术酶标记抗体免疫组化技术直接法间接法直接法间接法优点操作简便特异性强检测敏感性高制备一种酶标二抗可用于检测多种抗原或抗体缺点敏感性低制备的抗体种类有限特异性不如直接法操作较为繁琐非标记抗体酶免疫组织化学染色酶桥法：抗酶抗体作为第三抗体，通过桥抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与第三抗体连接起来，形成酶联的抗原-抗体复合物，加底物显色（图12-1）。
过氧化物酶抗过氧化物酶（PAP）法：是在酶桥法基础上加以改良。
PAP法首先将酶桥法的第三抗体（抗酶抗体）与酶组成可溶性复合物（PAP复合物，图12-2）。
该复合物由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组成，呈五角形结构，非常稳定。
通过桥抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与PAP复合物的抗酶抗体连接起来，此时要求特异性第一抗体与第三抗体的动物种属相同（图12-3）。
免疫组织化学(免疫组化)技术
免疫组织化学（免疫组化）技术利用抗原抗体的特异性结合反应来检测和定位组织或细胞中的某种化学物质的一门技术，它是免疫学和传统的组织化学相结合而形成的，这种技术称免疫组织化学（immunohistochemistry IHC）或免疫细胞化学（immunocytochemistry）。
其特点是将形态学改变与功能，代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质或多肽物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚焦显微术等技术，可对被检物质进行定量分析。
第一节免疫组化的发展史及应用自1941年Coons及其同事首创免疫组织化学技术以来，拌随免疫学和组织化学理论与技术的发展，免疫组织化学已发生了日新月异的变化。
如下表由于免疫组化具有特异性强、灵敏度高等显著特点，且能将形态与功能研究有机的结合在一起，所以，这门技术从一诞生起就显示出了强大的生命力和广阔的应用前景，现今它已被广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域，推动了学科的发展，取得了令人瞩目的成就。
免疫组织化学染色技术的应用随着大量商品化的单克隆和多可隆抗体出现，配套试剂盒的使用及方法的不断完善，使免疫组化染色已经成为医学基础研究和病理外检中应用最为广泛的技术手段之一。
免疫组化可用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测，细胞属性的判定，淋巴细胞的免疫表型分析，细胞增殖和凋亡的研究，激素受体和耐药基因蛋白表达检测，以及细胞周期和信号转导的研究等。
在病理学研究中，免疫组化技术的作用和意义更重要。
以肿瘤研究为例，在免疫组化技术出现以前，对肿瘤的诊断和分类还局限于细胞水平，而引入免疫组化技术后，则使研究的深度提高到了生物化学水平、分子水平。
近年来，拌随基因探针研究而兴起的核酸分子原位杂交技术也正在蓬勃发展，更使免疫组化如虎添翼，两者相得益彰，将研究推进到了基因水平。
越来越多的癌基因与抗癌基因的发现不仅有助于对肿瘤发生机制的探讨，而且使肿瘤的预防，早期诊断，甚至治疗都向前迈进了一大步，为人类征服癌症代来了希望的曙光。
【检验医学】免疫组织化学技术
各种抗原的固定
抗原 蛋白质 微生物 病毒外壳 多糖 黏液物质 类脂质
固定剂或处理方法 乙醇、甲醇 丙酮、三氯化碳 胰蛋白酶 10%甲醛或微火加热 透明质酸酶 乙醚、丙酮
二、抗 原 的 保 存 与 修 复
➢ 抗原修复:使在制片过程中被遮蔽的组织抗原决定簇重新暴露的过程。
四、结 果 判 断
➢ 对照实验： 阳性对照：选择含已有抗原的标本(证明整个显色程序正确，尤其待检标本呈 阴性结果时更为重要） 阴性对照：选择不含已知抗原的标本（排除假阳性）
➢ 确证实验： 空白实验：PBS（排除内源性酶） 替代试验：与待测抗原的同种动物非免疫血清（证明阳性反应不是由异嗜性抗 原引起的非特异性反应） 吸收或阻断试验：用过量已知抗原（可溶性）与特异性抗体反应，已知阳性的 标本应呈阴性或弱阳性（证明免疫组化的阳性结果是与天然抗原相同的抗原 抗体反应。）
第十二章 免疫组织化学技术
概念
免 疫 组 织 化 学 技 术 （ immunohistochemistry technique）又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特 异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化 学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测 定的一项免疫检测方法。
第一节 免疫组织化学技术概述
根据标记物的不同分类： 荧光免疫组织化学技术 酶免疫组织化学技术 免疫金（银）组织化学技术 亲和组织化学技术 免疫电镜组织化学技术
第一节 免疫组织化学技术概述
免疫组织化学的基本过程包括：
1.抗原的提取与纯化； 2.免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及
抗体的纯化； 3.将标记物与抗体结合形成标记抗体； 4.标本的处理与制备； 5.抗原抗体免疫学反应以及标记物呈色反应； 6.观察结果。
免疫组织化学
免疫组织化学免疫组织学是研究细胞、组织和器官在发生免疫反应时所发生的化学变化的科学。
通过采用组织化学和免疫组织化学技术可以观察和研究免疫系统中各个细胞分子、细胞膜和细胞内物质在免疫反应中的变化情况，从而了解和诊断疾病。
一、组织化学技术1.石蜡切片技术石蜡切片技术是通过对组织进行处理后包埋在石蜡中，再将石蜡切片来观察组织状态的技术。
这种技术可以非常清晰地显示细胞和细胞膜，同时被用于对组织进行染色和特定化学分析。
2.冻切片技术冻切片技术是将组织冷冻并且快速切片来观察组织状态的一种技术。
这种技术用于光镜下检测细胞活性和免疫反应时的病理学变化以及细胞的病态化变化。
3.光镜检查光镜检查是针对石蜡切片和冻切片进行的检查，对病理学变化等细节进行更加细致的观察。
二、免疫组织化学技术1.免疫荧光技术免疫荧光技术是通过对组织中某些成分进行标记，利用特定的荧光染料来显示出细胞、分子及其他细节结构的技术。
这种技术主要用于开展多种体外免疫试验。
2.酶标记技术酶标记技术也称为酶免疫分析技术或酶联免疫试验技术，利用酶或其他分子标记的抗体来对组织进行特定分析的技术。
这种技术可以应用于抗体定性、半定量和全定量测定。
三、应用通过免疫组织化学技术，可以对各种组织进行检查。
例如，可以用来检查肿瘤细胞，对具体癌细胞和癌细胞分子进行定位和识别。
除此之外，免疫组织化学技术还可以用于疾病的诊断和治疗。
例如，对于免疫性关节炎，可以通过对炎症反应区域进行研究发现疾病过程中先后发生的变化，从而掌握疾病过程，为提高治疗效果提供依据。
同时，通过免疫组织化学技术可以对新的治疗方法进行评估。
例如，对药物的抑制和消灭癌细胞和癌细胞分子进行研究，有助于设计合适的治疗方案。
总之，免疫组织化学技术是一种非常强大的工具，能够帮助人们更好地理解生物学、医学等领域的疾病过程，并且有助于评估治疗方案和开发新药物。
免疫组织化学技术操作流程
免疫组织化学技术操作流程
1.组织固定处理：首先，需要收集需要检测的组织样品，并将其固定在载玻片上。
这个步骤常用的方法有冷冻切片和石蜡切片，其中冷冻切片适用于细胞和组织的蛋白质表达的快速检测，而石蜡切片适用于长期保存和形态学研究。
2.抗原修饰：对于固定的组织样品，需要进行抗原的修饰处理来增强抗原的可检测性。
这通常包括蛋白酶的消化和抗原恢复等处理。
3.抗体染色：在免疫组织化学技术中，使用特异性的一抗体来识别和检测感兴趣的蛋白质。
这些抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，具体选择要根据实验需求来决定。
一抗染色的方法有直接法和间接法，其中间接法是最常用的方法，使用辅助抗体来扩大信号。
4.信号检测：在抗体染色后，需要对信号进行检测。
这包括使用化学染色，如荧光染色、酶联免疫吸附实验（ELISA）和辐射放射等。
其中最常用的是荧光染色，因为它具有较高的灵敏度和多色信号的能力。
5.显微镜观察：最后一步是对染色结果进行显微镜观察和图像分析。
通过显微镜观察可以确定特定蛋白质在组织中的定位和表达水平，并可以进一步进行信号定量分析和数据处理。
总的来说，免疫组织化学技术是一种重要的实验技术，可以用于检测组织中特定蛋白质的存在和定位，从而为进一步的分子生物学研究提供重要的信息。
虽然这个技术在整个操作流程中需要一些特定的试剂和设备，但它的结果可以为分子生物学和医学研究提供重要的支持。
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术
免疫组织化学(immunohistochemistry)，也称免疫细胞化学(immunocytochemistry)，是由免疫学和传统的组织化学方法相结合发展形成的研究方法，能定位、定性或定量检测组织切片上的特殊蛋白质、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受体、病原体等。
利用抗原与抗体能特异性结合的原理，用标记的抗体(或抗原)与组织或细胞中的特定抗原(或抗体)结合，形成带有标记物的抗原抗体复合物。
通过普通显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察标记物，从而证明这些抗体或抗原物质在组织细胞内的分布。
根据标记物的不同，免疫组织化学染色可分为免疫荧光组织化学技术、免疫酶组织化学技术、亲和免疫组织化学技术、免疫金银及铁蛋白标记技术等。
免疫组织化学方法将形态学改变与功能和代谢结合起来，既保持了传统形态学对组织和细胞的客观、细致形态观察的优点，又克服了生物化学、免疫学反应只能定性和定量不能定位的缺点，已成为生物医学各学科领域的重要研究手段。
在生物学、医学等领域的研究和诊断中日以显出巨大的实用价值，尤其在肿瘤病理学中已成为常规的诊断方法。
标记在抗体上的荧光素
荧光素标记的羊抗兔IgG (间接荧光抗体)
兔抗人角蛋白的IgG(特异性抗体)
人组织细胞中的抗原(如角蛋白)
直接法间接法
免疫荧光组织化学方法示意图
组织切片的免疫酶组织化学染色培养细胞的亲和免疫组织化学染色
免疫荧光染色免疫荧光染色
(兰色为细胞核，红色为角蛋白) (兰色为细胞核，绿色为上皮膜抗原)。
免疫组织化学技术
免疫组织化学的概念：免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
免疫组化常用的染色方法有哪些？根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。
这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。
抗体的保存：抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。
如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100mg/L）,就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。
绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。
临床医学检验主管技师考试辅导《临床免疫学和免疫检验》第十三章 免疫组织化学技术练习题
第十三章免疫组织化学技术一、A11、下列有关直接法荧光抗体试验的叙述中，不正确的是（）。
A、简单易行，特异性好B、敏感性较间接法差C、可对抗原或抗体进行检测D、检测一种抗原需要制备一种荧光抗体E、只能检测抗原2、用直接免疫荧光法检测T细胞上CD4抗原，荧光素应标记在（）。
A、CD4抗原上B、CD4单克隆抗体上C、固相载体上D、抗人Ig抗体上E、某种动物红细胞上3、最先被用作标记免疫技术的标记物是（）。
A、荧光素B、放射性核素C、酶D、激素E、生物素-亲和素4、下列不符合荧光免疫技术直接法的描述是（）。
A、荧光抗体直接加于标本上B、常用于抗核抗体的检测C、每检查一种抗原需制备特异的荧光抗体D、灵敏度偏低E、特异性高，非特异荧光染色因素少5、为了保证免疫荧光细胞化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次实验时进行对照试验。
下列选项中不必要的是（）。
A、自身对照B、吸收试验C、阴性对照D、阳性对照E、补体对照6、关于免疫组织化学技术的应用，下列说法错误的是（）。
A、对于细胞抗原性物质能准确、敏感地进行检测和定位B、在细胞学中主要用于菌种鉴定和抗原结构的研究C、检测人体大多数寄生虫，且具有特异性高和敏感性好等优点D、确定肿瘤的组织学发生，进行肿瘤的转移性和特异性的鉴别E、应用免疫荧光抗体直接法可以检出自身免疫疾病患者血中的自身抗体答案部分一、A11、【正确答案】C【答案解析】【答疑编号100065986】2、【正确答案】B【答案解析】直接免疫荧光法是用单克隆抗体检测T细胞表面抗原的方法。
用已知特异性抗体与荧光素结合，制成荧光特异性抗体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，在荧光显微镜下，即可见抗原存在部位呈现特异性荧光。
【答疑编号100065984】3、【正确答案】A【答案解析】直接免疫荧光法是用单克隆抗体检测T细胞表面抗原的方法。
用已知特异性抗体与荧光素结合，制成荧光特异性抗体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，在荧光显微镜下，即可见抗原存在部位呈现特异性荧光。
病理学中的免疫组织化学技术
病理学中的免疫组织化学技术免疫组织化学技术是病理学中常用的一种技术，它利用特异性抗体来检测并鉴定组织中的特定细胞或分子。
这种技术在肿瘤学、免疫学、神经科学等领域得到广泛应用，并且对于疾病的早期诊断、治疗有着重要的作用。
免疫组织化学技术是在组织学的基础上发展起来的一种技术，它利用特异性抗体识别组织中的不同成分，并将它们染色或标记。
目前常使用的免疫组织化学技术主要有免疫荧光、免疫酶标记、免疫金标记等。
免疫荧光是一种利用荧光染料标记抗体或标记物并将其显色的技术。
它可以快速、准确地鉴定出组织中的不同分子或细胞，并可以通过多重荧光染色技术同时检测出多种分子，从而实现复杂的研究目的。
免疫荧光技术在病理学中的应用十分广泛，包括免疫球蛋白的分布、肿瘤细胞的识别和定位、免疫细胞的分布和功能等。
免疫酶标记是一种将酶标记物（如过氧化物酶、碱性磷酸酶等）标记在抗体或其他分子上，然后通过酶促反应将其染色或显色的技术。
这种技术可以用于特定细胞或分子的定量分析，可以通过数字化显微镜来定量计算染色强度等参数。
在肿瘤学中，免疫酶标记技术常被用来鉴定肿瘤细胞的种类和分化程度，以及进行肿瘤的分子分型。
免疫金标记技术是一种将金标记物标记在抗体或标记物上，然后通过放大或显色等方式来进行检测的分析技术。
这种技术的优点在于其对细胞结构和分子的高分辨率显微镜观察，同时可通过计算机数字化技术实现图像分析和处理。
在神经科学领域中，免疫金标记技术常被用于观察神经元的形态和分布，以及神经递质的定位和释放。
总之，免疫组织化学技术在病理学中得到了广泛应用。
这种技术的出现和发展，为疾病的诊断、治疗和研究提供了有力的工具，同时也为未来疾病防治的研究和治疗提供了新的思路和可能性。
免疫组织化学法
免疫组织化学法免疫组织化学法是一种生物学技术，它可以辅助研究人员检测和鉴定细胞内和细胞外免疫分子的存在和表达。
这种技术为识别细胞和分子的特定结构以及同步地观察和分析细胞和分子之间的动态变化，为生物学家的研究提供了Python的灵活性。
为了达到这一目的，研究人员会使用各种技术，包括免疫组织化学、免疫荧光技术、免疫共聚焦显微镜、免疫贴片技术等。
免疫组织化学是一种利用抗体来检测细胞内或细胞外抗原的技术，它与其他免疫技术不同，例如免疫荧光，因为它可以在宏观尺度上看到目标抗原的分布形态和配分情况。
同时，它能够通过观察特定位点的抗原表达水平来识别细胞功能的改变情况。
免疫组织化学法的技术原理是首先将一种特定的抗体与一个细胞样本中的抗原结合起来，然后通过采取特定技术（如光学显微镜）来观察结合后的细胞样本，从而使抗原体现出明显的可视化特征。
抗体可以检测各种免疫分子，如抗原、抗体、抗原抗体复合物、细胞因子和其他复杂结构。
它们可以发挥自身的特异性，以催化特定类型的生物学反应，从而检测和识别特定的免疫分子。
另外，免疫组织化学的另一个优势是，它可以同步地观察和分析细胞和分子之间的动态变化情况，从而选择有效的分子，有助于确定特定分子在调节细胞状态和促使细胞功能的过程中的作用。
例如，研究人员可以通过识别细胞及其周围的抗原在细胞凋亡、炎症损伤和免疫细胞活动过程中的调节活动，从而更深入地了解他们所研究的特定疾病。
最后，免疫组织化学可以有效地帮助研究人员检测并观察细胞内外免疫分子的存在和表达，有助于研究人员更深入地了解细胞及其周围抗原在各种疾病发生发展过程中的调节作用，为临床医学提供参考。
免疫组织化学是一种多种技术的变种，它的根源可以追溯到20世纪50年代末水平的免疫学技术。
近年来，由于技术进步和设备发展，该技术受到了越来越多的研究者的关注，在生物学研究中发挥着日益重要的作用。
虽然免疫组织化学仍然只是一种新兴的技术，但它有望在临床中发挥重要作用，对疾病的诊断和治疗提供参考。
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修复。 ➢ 常用的方法有：
经交济联胃简蛋蛋单限白白，度，酶适暴已—用露暴强于抗露消大原掩化批而盖酶切又的片不抗 原决破定坏簇抗。原
酶消化法
盐酸水解暴露抗原法 也是利用热效 微波炉恢复抗原法 应恢复抗原性 高压锅恢复抗原法
煮沸恢复抗原法
三、抗 体 的 处 理 与 保 存
抗体的选择
➢注意选择具有高特异性、稳定的优质抗体 ➢多克隆抗体：敏感性较高、特异性相对较低 ➢单克隆抗体：特异性较高、敏感性相对较低
13第13章免疫组织化学技术
第二节 免疫荧光组织化学技术 一、组织处理 二、荧光抗体的标记及染色
第三节 酶免疫组织化学技术 一、组织处理
二、酶标记抗体免疫组化染色 三、非标记抗体免疫酶组化染色 四、酶免疫组化染色中的常用的酶及显色底物 第四节 亲合组织化学染色 一、生物素-亲合素法 二、葡萄球菌A蛋白法 三、凝集素法 四、链霉亲合素-生物素法
表面）
挤压的细胞区域
由于细胞内抗原含量不同，所 不限于单个细胞，而是累及一
以显色不均一
片细胞，均匀显色
阳性与阴性细胞相互交杂，同 细胞和周围的结缔组织均无区
一切片上显色强度不一
别的着色
免疫组化结果与HE染色结果
当免疫组化诊断结果与HE切片诊断不一致时, 应再结合临床资料，如性别、年龄、部位、X线 等影像学及实验室结果综合分析, 不能简单地推 翻HE切片诊断。（HE，苏木精-伊红染色）
➢ 标记方法：搅拌法、透析法 ➢ 标记抗体的纯化：游离荧光素、未标记或过度标记
蛋白的去除 ➢ 标记抗体的质量鉴定：抗体特异性、效价、荧光素
与蛋白质结合比率F/P
荧光免疫组化染色
直接法：
优点：操作简便、特异性高
标记抗体
缺点：敏感度偏低、抗体
抗原
标本
制备麻烦
载玻片
间接法： 优点：较直接法灵敏，标记一种抗
五、质 量 控 制
包括第一抗体和
试剂的质量控第二制抗体
预试验
➢ 抗体特异性、敏感性测试 ➢ 抗体最佳稀释度的选择 ➢ 稀释剂 ➢ 抗体孵育温度、时间
质量
操作过程质量控制
操作：步骤是否正确规范；每日之间、操作 人员之间的变异；试剂复溶、状态是否良好
标本：阴性、阳性或自身组织对照三种类型 质控品，可用于监控标本制备、操作过程、 染色步骤、试剂质量等问题引起的误差
➢ 阴性结果:不能简单认为具有否定意义， 阳性表达有强弱、多少之分，
➢ 只有少数细胞阳性（只要是在抗原所在部位）也要 视为阳性表达,
➢ 不能认为个别细胞阳性而不作阳性看待。
特异性染色与非特异性染色
特异性染色
非特异性染色
分布在特定的部位, 具结构性 无分布规律，常出现在切片边
（如细胞质、细胞核、或细胞 缘、刀痕或皱折部位及坏死或
一、组 织 的 处 理
➢ 标本的类型：
涂片和印片 组织切片
铺片
培养的粘附细胞
悬浮细胞 活细胞
➢ 标本的保存 ： 标本固定干燥后，最好立即检测 保持干燥、置4℃甚至-20℃ 以下保存
二、荧光抗体的标记及染色
➢ 常用的荧光素： FITC黄绿色；RB200、TRITC橙红色；PE红色；AMC 蓝色；Cy3橙红色；Cy5红色；德克萨斯红橙红色
➢ 动物肝粉吸收荧光抗体中非特异性成分 ➢ 层析或透析去除游离荧光素，纯化荧光抗体 ➢ 将抗体的浓度调整到高稀释度 ➢ 选择适合的切片方法 ➢ 封固剂、镜油必须无自发荧光 ➢ 用高渗盐浸洗，降低非特异性染色背景 ➢ 伊文氏蓝衬染法
二、抗 原 的 保 存 与 修 复
➢ 抗原修复:免疫组化在制片的过程中由于广泛的蛋白
交联而使其组织的某些抗原决定簇发生遮蔽、致使
免疫细胞化学的信号减无借弱花助或果微消掌蛋波失握白辐等盐酶射不酸—产良浓轻生效度度的应、消高。水化热所解酶效以，
使遮蔽的组织抗原决定应簇胰及重蛋高新温白速暴度酶分露、—子的时中运方间度动法、消能，以化量即最酶解抗大开原
抗体的稀释
➢ 抗原抗体反应要比例合适才能达到预期效果 ➢ 使用前根据预实验结果得出抗体的最佳稀释度
抗体的保存
➢ 分装密封保存，避免对抗体的污染 ➢ 并注明标记（批号、名称、效价、量） ➢ 根据厂家提供的保存条件保存 ➢ 避免反复冻融而使抗体效价降低
设立对照的目的在于证明
四、结 果和肯判定阳断性结果的特异性， 采用主已要知针抗对原第阳一性抗标体本。与 待检标本同时进行
➢对照实阳阴验性性：对对必照照须先离性阳设用前抗性用心标性立与血体抗抗已接后本反待清已原对体用以生知法再应应测或确所反照缓排物过和进呈是抗非认致应以冲除素量间行阴与原免阳非，排液组或法抗接组性天同疫性 特间除代织内常原法化，然一血反异接假替细源采与均染其抗种清应性法阳第胞性用第可色目原动代不反常性一内酶。一采，的相物替是应采抗所。抗用此在同免第异。用体含直体时于的疫一嗜直。，的接反的确抗应阳认原，
标记抗体B
抗原B 标本
标记抗体A 抗原A
载玻片
非特异性荧光产生
➢ 某些组织细胞、衰老细胞有自发荧光 ➢ 抗体不纯所出现的交叉反应 ➢ 标记抗体质量差，游离荧光素干扰 ➢ 标记抗体浓度过高 ➢ 免疫荧光染色时间过长 ➢ 洗涤时间不够
非特异性荧光消除
➢ 用非免疫血清或10%牛血清白蛋白温育切片封闭 非特异抗原Βιβλιοθήκη 点➢确证实验：空白实验
替代试验
吸收或阻断试验
阳性细胞显色分布类型 细胞质 细胞核 细胞膜表面
阳性细胞显色：抗原分布于细胞核
阳性显色深浅反映抗原存 在的数量，可以作为 定性的依据 定位的依据 定量的依据
阳性细胞呈散在分布
阳性细胞分布分为 散在分布 灶性分布 弥散分布
阳性细胞呈灶性分布
阴性结果和抗原不表达
仪器的质量控制
相关技术设备、仪器和器具定期校对、对试管、 吸管、移液器等消毒。
第二节 免疫荧光组织化学技术
定义:采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探
针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗 体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在 荧光显微镜下，分辨出抗原(或抗体）的所在位置 及其性质，并可利用荧光定量技术计算其含量。 以达到对抗原(或抗体）物质定位、定性和定量测 定的目的。
体可以鉴定多种抗原 缺点：非特异荧光、操作时间较长
补体法： 优点：敏感度较高、标
记一种抗体可以鉴定 多种 抗原、适用于任 何动物的抗原抗体系 统 缺点：非特异荧光、需 新鲜补体、操作麻烦
抗体 抗原 标本
标记抗补体抗体 固定补体
载玻片
双标记荧光免疫染色法： 用两种荧光素分别标记 不同抗体，对同一标本 中的相应两种抗原同时 显示