5多糖分子量测定-PPT精选文档
多糖测定
功效成分粗多糖含量测定方法A.粗多糖含量测定方法1.1 范围本标准规定了保健食品中以葡聚糖为主要结构分子量在10000以上的水溶性粗多糖的测定方法。
本标准适用于保健食品中以葡聚糖为主要结构分子量在10000以上的水溶性粗多糖的测定。
本方法最低检出浓度：5.0mg/L。
本方法最佳线性范围：5.0ug/ml—200ug/ml。
1.2 原理食品中分子量>10000的高分子物质在80%乙醇溶液中沉淀，与水溶液中单和低聚糖分离，用碱性二价铜试剂选择性的从其它高分子物质中沉淀具有葡聚糖结构的水溶性多糖，用苯酚-硫酸反应以碳水化合物形式比色测定其含量，其颜色强度与水溶性粗多糖中葡聚糖的含量成正比，以葡聚糖为标准参照物并以此计算食品中水溶性粗多糖含量。
1.3 试剂本方法所用试剂除特殊注明外，均为分析纯；所用水为去离子水或同等纯度蒸馏水。
1.3.1 乙醇溶液(80%):20ml水中加入无水乙醇80mL,混匀。
1.3.2氢氧化钠溶液(100g/L):称取100g氢氧化钠,加水溶解并稀释至1L,加入固体无水硫酸钠至饱和,备用。
1.3.3铜试剂储备液: 称取3.0gCuSO4.5H2O,30.0g柠檬酸钠,加水溶解并稀释至1L, 混匀备用。
1.3.4铜试剂溶液：取铜储备液50mL，加水50mL，混匀后加入固体无水硫酸钠12.5g并使其溶解。
临用新配。
1.3.5洗涤剂：取水50mL，加入10mL铜试剂溶液，10mL氢氧化钠溶液，混匀，临用新配。
1.3.6硫酸溶液（10%）：取100mL浓硫酸加入到800mL左右水中，混匀，冷却后稀释至1L。
1.3.7苯酚溶液（50g/L）：称取精制苯酚5.0g，加水溶解并稀释至100mL，混匀。
溶液置冰箱中可保存一月。
1.3.8 葡聚糖标准储备溶液:精密称在硫酸干燥器中干燥至恒重的葡萄糖标准0.5000g,加溶解,并定容至50mL,混匀,置冰箱中保存。
此溶液每毫升含10.0mg葡萄糖。
5多糖分子量测定
第4章 章
多糖的干燥和纯度鉴定
渗透压法： 一、渗透压法： 利用膜渗透压计(Membrane Osmometer，简称MO仪) 可以测定范围在1万～50万之间的多糖分子量。本法 不需用标准品. 原理] [原理]:把多糖水溶液装在半透膜制成的透析袋内， 袋外为溶剂(水)，水分子可以自由通过半透膜，多糖 分子则不能通过透析膜，因此袋内的多糖分子必将吸 引更多的水分子渗入袋内，形成一定的渗透压。渗透 压与溶液中的溶质分子数有关，可以用范特荷甫公式 表示，即 πV=nRT (1-1) 式中π——渗透压； V——溶液体积； n——溶液摩尔数； R——气体常数； T——绝对温度。
第4章 章
多糖的干燥和纯度鉴定
[操作] 操作] (1) 精确称取样品100～200 mg，放在500 mL具磨砂口的圆 底烧瓶中，加蒸馏水3 mL，使样品吸水润湿，再加浓度为O．4 mol／L的醋酸5 mL和浓度为O．8 mol／L的KCN的溶液5 mL，盖 上玻璃塞后于39℃温度保温48小时。然后用酸将反应液酸化至 甲基红呈酸性。 (2)通以空气，驱逐反应液中剩留的氰化物，然后加浓度为 20％的氢氧化钠溶液10mL。 (3)以蒸汽蒸馏法将氨蒸出并吸收于一定体积(VHCL,)的标准 盐酸中。蒸馏完毕，以标准氢氧化钠滴定盐酸(吸收溶液)，记 录所消耗的氢氧化钠的体积(VNAOH)。 (4)样品的分子量: M=样品质量/[( HCL*0 01) NAOH*0 01) M=样品质量/[(VHCL*0.01)-(VNAOH*0.01) 样品质量
第4章 章
RT M= π × D CC-O
第4章 章
多糖的干燥和纯度鉴定
二、端基法 原理] [ 原理] 测定单位重量样品中所含可测端基之数，计算检样的分子 量. 例如,对某一种多糖的分子结构，业已明确知道它每一个分 子链含有一个可测端基和每毫克中所含的可测端基为A mmol， 那么，该多糖的分子量应该是1／A。 可见检样的分子量,是它每毫克重量中所含可测端基的毫摩 尔数的倒数，在端基法测定分子量时，分子量计算的通式为: 检样重量mg 可测端基(mmol)=检样的分子量(Mn) mg／ (mmol)=检样的分子量 检样重量mg／可测端基(mmol)=检样的分子量(Mn) 用端基法测分子量要求检样的化学结构须具备如下两个条件： (1)每一个分子链端须具有可以用化学方法作分析的基团， 以便采用一定的定量分析方法，对该端基作定量分析。 (2)检样的每一个分子链，它所含可测端基的数目，不但须 明确，而且数目应固定不变。
分子量和分子量分布的测定方法PPT课件
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高分子溶液的光散射测定，一般都是用很稀的溶 液，故外干涉可以不予考虑，但是当高分子的分子量 较大，分子尺寸达到300Å 以上时，内干涉非常明显， 因此就必须考虑，而且正是这种散射光波的内干涉现 象，反映了溶液中高分子的形状和大小，致使光散射 也是研究高分子溶液中高分子形态的有效工具。
1.4.1 渗透压法
（1）原理 低分子稀溶液—范荷夫方程
RT CM
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高分子溶液渗透压公式
C
RT
1 Mn
A2C
A2 第二维里系数 χ1 Huggins参数
A2 12V~1221
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（5）散射光强与入射光的波长成反比 I ∝ 1/4 （6）散射光强与观察距离的平方成反比 I ∝ 1/r2 （7）溶液中溶质分子的散射光强度还与溶液的折光 指数以及溶液的折光指数随浓度的变化有关
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I
n2
n
2
C
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（8）散射光强与观察角度也有着依赖关系。当入射 光是一种偏振光，而散射质点的尺寸比入射光在介 质中的波长小得多时，就没有内干涉现象。
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端基分析法
（1）适用对象： ① 分子量不大（3×104以下）； ② 结构明确，每个分子中可分析基团的数目必须
知道； ③ 链的末端带有可以定量分析的基团。
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BOD5检测方法【精选文档】
BOD5检测方法一、测定方法碘量法二、方法依据《生活饮用水卫生规范》（2001）三、测定范围适用于测定饮用水源水中的生化需氧量（BOD5）。
水样呈酸性或含苛性碱，余氯、亚硝酸盐、亚铁盐、硫化物及某些有毒物质对测定有干扰，应分别处理后测定。
四、测定原理生化需氧量（BOD5)是指在有氧条件下，微生物分解水中有机物的生物化学过程所需溶解氧的量。
取原水或经过稀释的水样，使其中含足够的溶解氧，将该样品同时分为两份，一份测定当日溶解氧的质量浓度，而将另一份放入20℃培养箱内培养五天后再测其溶解氧的质量浓度，两者之差即为五日生化需氧量。
五、试剂1、氯化钙溶液（27.5g/L）:称取27.5g无水氯化钙(CaCl2)溶于纯水中，稀释至1000mL。
2、氯化铁溶液(0.25g/L)：称取0。
25g氯化铁（FeCl3·6H2O）,溶于纯水中,稀释至1000mL。
3、硫酸镁溶液（22。
5g/L)：称取22.5g硫酸镁（MgSO4。
7H2O),溶于纯水中，稀释至1000mL.4、磷酸盐缓冲溶液（pH7。
2）：称取8。
5g磷酸二氢钾（KH2PO4）,21.75g磷酸氢二钾（K2HPO4），33。
4g磷酸氢二钠(Na2HPO4）和1。
7g氯化铵（NH4Cl）溶于纯水中，稀释至1000mL。
5、稀释水：在20L玻璃瓶内装入一定量的蒸馏水（含铜量小于0。
01mg/L）,在20℃条件下用水泵或无油空气压缩机连续通入经活性炭过滤的空气8h，予以曝气,静置5~7天，使溶解氧稳定，其溶解氧质量浓度应为8~9mg/L.6、接种稀释水6。
1接种液：将生活污水在20℃条件下放置24～36h，取上清液,备用。
6。
2接种稀释水：于每升稀释水中加入接种液10～100mL。
7、葡萄糖一谷氨酸溶液:称取于103℃烘烤1h的葡萄糖和谷氨酸各150mg于纯水中，稀释至1000mL，临用时配制。
8、硫酸溶液[c(H2SO4）=0.5mol/L］。
多糖的分子量测定
多糖的分子量测定常用的是凝胶滤过法。
将充分膨胀好的SephadexG-200、G-150或G-75湿法装柱，用一定离子强度的氯化钠水溶液进行平衡，然后将各种不同的已知分子量的多糖分别相继上柱，同一离子强度的氯化钠水溶液洗脱，分步收集，苯酚-硫酸法监测，分别求得洗脱体积Ve，然后再将兰葡聚糖（M V>200万）上同一条柱，求出柱的空体积V o，根据V e/V o与logM之间存在着线性关系，可绘制标准曲线。
最后，将待测样品按上述不变的条件上柱，求得待测多糖的V e。
通过标准曲线上的V e/V o，查得待测多糖的分子量对数，便可求出M。
对于黏度大的多糖，可采用黏度法求得。
亦有用蒸汽压渗透法（VPO，基本原理是根据理想溶液的拉乌尔定律，参考文献：崔锡红, 等. 蒸汽压渗透法分析异丁烯的数均分子量. 河南化工. 2001, 1: 32. 骆传环. 蒸气压渗透计测定多糖分子量. 现代科学仪器, 1994, 4:11.）、超速离心法（骆传环, 等. 香姑多糖的分子量测定. 科学技术与工程. 2006, 6(8): 1058~1060）、光散射法（LS，光散射法测定高分子量基于高分子溶液的瑞利散射，垂直偏振光通过溶液产生的不同角度散射光的强度与溶质分子的大小即分子量成正比。
参考文献：魏立平, 姜雄平. 光散射法在医学分子生物学中的应用. 国外医学分子生物学分册. 2000, 22(2): 123.）、玻璃纤维纸电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳（原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
多糖 分子量
多糖分子量
多糖是一类由多个单糖分子通过糖苷键缩合而成的复杂糖类物质，具有高分子化合物的特征。
多糖的分子量因种类和结构的不同而有很大差异，可以从几千到数百万Da（道尔顿）不等。
多糖的分子量测定方法有以下几种：
1. 凝胶滤过法：常用的方法之一，通过将多糖样品加入凝胶柱，利用分子筛效应分离不同分子量的多糖。
常用的凝胶柱有Sephadex G-200、G-150或G-75。
通过测定洗脱体积与分子量的关系，可以计算出多糖的分子量。
2. 黏度法：适用于测定黏度较大的多糖样品。
通过测量多糖溶液的黏度，结合溶液的浓度和温度，计算多糖的分子量。
3. 蒸汽压渗透法（VPO）：基于理想溶液的拉乌尔定律，适用于分析高分子量多糖。
通过测量多糖溶液的蒸汽压，结合溶液的浓度和温度，计算多糖的分子量。
4. 超速离心法：通过测量多糖溶液的超速离心沉降速度，结合溶液的浓度和温度，计算多糖的分子量。
5. 光散射法：基于高分子溶液的瑞利散射原理，通过测量多糖溶液的光散射强度，计算多糖的分子量。
需要注意的是，不同的测定方法各有优缺点，选择合适的测定方法取决于多糖的性质和实验条件。
在实际应用中，通常会根据多糖的来源、结构和性质，选择最合适的分子量测定方法。
多糖分子量测定
多糖分子量测定引言：多糖是由若干个单糖分子通过糖苷键连接而成的高分子化合物。
多糖广泛存在于生物体内，具有重要的生物学功能。
测定多糖的分子量是研究多糖结构和性质的重要手段之一。
本文将介绍常见的多糖分子量测定方法及其原理。
一、凝胶渗透色谱法（GPC）凝胶渗透色谱法是一种常用的多糖分子量测定方法。
它利用凝胶柱的孔隙作用，根据不同分子量的多糖在凝胶柱中的渗透性差异进行分离和测定。
该方法操作简便，测定范围广，适用于大多数多糖的分子量测定。
二、动态光散射法（DLS）动态光散射法是一种基于多糖分子在溶液中的扩散速率来测定分子量的方法。
利用激光照射样品，测量样品中散射光的强度和时间的关系，通过斯托克斯-爱因斯坦公式计算多糖分子的扩散系数，从而得到多糖的分子量。
三、凝胶电泳法凝胶电泳法是通过多糖在电场中的迁移速率来测定其分子量的方法。
根据多糖的电荷性质和分子量大小，多糖在凝胶电泳胶中的迁移速率不同，从而实现多糖的分离和分子量测定。
四、核磁共振波谱法（NMR）核磁共振波谱法是一种精确测定多糖分子量的方法。
通过核磁共振技术，可以得到多糖分子中的氢、碳等核的共振信号，进而计算多糖的分子量。
五、质谱法质谱法是一种高灵敏度、高分辨率的多糖分子量测定方法。
通过将多糖分子离子化，然后在质谱仪中进行离子分析，可以得到多糖分子的质荷比，从而计算分子量。
六、比色法比色法是一种常用的多糖分子量测定方法。
通过多糖与某些化学试剂反应产生的可比色化合物，利用比色计测定其吸光度，从而计算多糖的分子量。
七、荧光法荧光法是一种灵敏度高、选择性好的多糖分子量测定方法。
通过多糖与荧光染料结合形成荧光复合物，利用荧光光谱仪测定其荧光强度，从而计算多糖的分子量。
结论：多糖分子量的测定是研究多糖结构和性质的重要手段。
凝胶渗透色谱法、动态光散射法、凝胶电泳法、核磁共振波谱法、质谱法、比色法和荧光法是常用的多糖分子量测定方法。
不同的方法适用于不同类型的多糖和测定要求。
多糖的分子量测定
多糖的分子量测定常用的是凝胶滤过法。
将充分膨胀好的SephadexG-200、G-150或G-75湿法装柱，用一定离子强度的氯化钠水溶液进行平衡，然后将各种不同的已知分子量的多糖分别相继上柱，同一离子强度的氯化钠水溶液洗脱，分步收集，苯酚-硫酸法监测，分别求得洗脱体积Ve，然后再将兰葡聚糖（M V>200万）上同一条柱，求出柱的空体积V o，根据V e/V o与logM之间存在着线性关系，可绘制标准曲线。
最后，将待测样品按上述不变的条件上柱，求得待测多糖的V e。
通过标准曲线上的V e/V o，查得待测多糖的分子量对数，便可求出M。
对于黏度大的多糖，可采用黏度法求得。
亦有用蒸汽压渗透法（VPO，基本原理是根据理想溶液的拉乌尔定律，参考文献：崔锡红, 等. 蒸汽压渗透法分析异丁烯的数均分子量. 河南化工. 2001, 1: 32. 骆传环. 蒸气压渗透计测定多糖分子量. 现代科学仪器, 1994, 4:11.）、超速离心法（骆传环, 等. 香姑多糖的分子量测定. 科学技术与工程. 2006, 6(8): 1058~1060）、光散射法（LS，光散射法测定高分子量基于高分子溶液的瑞利散射，垂直偏振光通过溶液产生的不同角度散射光的强度与溶质分子的大小即分子量成正比。
参考文献：魏立平, 姜雄平. 光散射法在医学分子生物学中的应用. 国外医学分子生物学分册. 2000, 22(2): 123.）、玻璃纤维纸电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳（原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
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第4章
多糖的干燥和纯度鉴定
膜渗透压计示意图
第4章
多糖的干燥和纯度鉴定
[操作] 以右旋糖酐分子量的测定为例。 (1)仪器准备：将脱气后的蒸馏水充满下池。浸泡好的半透膜 覆盖其上并注意勿使气泡进入。将上池压紧。按操作要求逐步 旋紧中心螺丝 ( 约8 小时) ，装上针阀及校正杯进行仪器校正 ( 约 12小时)，取下针形阀及校正杯，装上进样管，用溶剂充分冲洗 后，开动记录仪，划出基线(约12小时)。
用端基法测分子量要求检样的化学结构须具备如下两个条件： (1) 每一个分子链端须具有可以用化学方法作分析的基团， 以便采用一定的定量分析方法，对该端基作定量分析。 (2) 检样的每一个分子链，它所含可测端基的数目，不但须 明确，而且数目应固定不变。
第4章
多糖的干燥和纯度鉴定
下面介绍几种常用的测定多糖还原端基的定量分析方法: 3，5一二硝基水杨酸比色法 本方法在还原糖与3，5一二硝基水杨酸反应时，产生颜色。 测定检样时，用一个已知分子量和已知浓度的溶液作参比，经 过比色，计算检样的分子量。
第六章 多糖的分子量测定
样品 (4)分子量计算： Rπ —渗透压 π /C D—密度 1
O.209
2
0.403
3
0.626 0.8 1.238
O.3 0.5 1.435 4 1.271 7
将π /C对C作图求得 π /C c→0为1.50。T=24℃ ，D=0.9973代人式得: M≈168O00.
RT M= π × D CC-O
第4章
多糖的干燥和纯度鉴定
二、端基法 [ 原理] 测定单位重量样品中所含可测端基之数，计算检样的分子 量. 例如,对某一种多糖的分子结构，业已明确知道它每一个分 子链含有一个可测端基和每毫克中所含的可测端基为 A mmol ， 那么，该多糖的分子量应该是1／A。 可见检样的分子量,是它每毫克重量中所含可测端基的毫摩 尔数的倒数，在端基法测定分子量时，分子量计算的通式为: 检样重量mg／可测端基(mmol)=检样的分子量(Mn)
第4章
多糖的干燥和纯度鉴定
一、渗透压法：
利用膜渗透压计 (Membrane Osmometer，简称MO仪) 可以测定范围在 1 万～ 50 万之间的多糖分子量。本法 不需用标准品. [原理]:把多糖水溶液装在半透膜制成的透析袋内， 袋外为溶剂(水)，水分子可以自由通过半透膜，多糖 分子则不能通过透析膜，因此袋内的多糖分子必将吸 引更多的水分子渗入袋内，形成一定的渗透压。渗透 压与溶液中的溶质分子数有关，可以用范特荷甫公式 表示，即 π V=nRT (1-1) 式中π ——渗透压； V——溶液体积； n——溶液摩尔数； R——气体常数； T——绝对温度。
第4章
多糖的干燥和纯度鉴定
由于不同分子量大小的多糖具有不同的性 质，在多糖的应用中，如以其作为试剂使用 于某些实验时，往往需要在它的分子量大小 方面作选择。可见,不论在多糖性质的研究， 或是在它的用途等方面，都涉及分子量方面 的问题，往往需要测定它的分子量。因而测 定分子量成为研究和制备多糖的一项经常性 工作。
第5章
多糖的分子量测定
多糖的分子量测定是研究多糖性质的一项 较为重要的工作。多糖的性质往往与它的分 子量大小有关。例如，多糖溶液的粘度不但 随浓度的增大而升高，而且与多糖分子量大 小有关。一般说来，分子量增大，粘度增高。 在生物学研究中，发现某些多糖由于分 子量大小方面的差别，所产生的某些效应也 有一定差异。
第4章
多糖的干燥和纯度鉴定
测定多糖分子量时，为了避免因存在杂质而影 响测定结果，需要把检测的样品(简称样品或 检样)适当提纯。用于分子量测定的样品，纯 度要求虽然不十分高，但至少要达到 : (1)去除杂质和水分。 (2) 把不同化学结构的组分相互分开，使它们在 测定分子量中不相互干扰。 (3)把不同分子量大小的组分相互分开。 另外,在用某些方法进行分子量测定时，需要先 将小分子量的盐和单糖除去。
(2)样品准备：每一测定的样品需配3～5个不同浓度的溶液。 本试验中用右旋糖酐配制成 O.209 g／100 mL(C1)，O.403 g／ 100 mL(C2)及O.626 g／lOO mL(C3)3种浓度的溶液。 (3)样品测定：先用浓度为C1的样品由进样管注入上池，清洗 3次，再注满进行测量，直到记录仪达到平衡。划出的直线与基 线之间的距离即为该浓度溶液的π 值。 同法测定C2，C3溶液的π 值。
[试剂] 3，5一二硝基水杨酸溶液：称取666 mg经2次重结晶的3，5 一二硝基水杨酸，溶解于 200 mL 浓度为 1 mol ／L 的氢氧化钾溶 液中。 [操作] (1)称取样品100～200 mg放人100 mm×20 mm试管，加15 mL试 剂，经过搅拌使样品溶解，然后在65℃的恒温水浴中保温1小时 ，待冷却至室温后，将反应液移入50 mL容量瓶，用水淋洗反应 管多次，淋洗液并入容量瓶，添加水至刻度。
第4章
多糖的干燥和纯度鉴定
因
n=W/M， W=CV, 代人上式简化后得: M=RT/(π /C ) (1—2) C:浓度 有些研究者认为应当考虑溶剂在不同温度时的密度D，即 M=RT/(π /c*D) (1—3) D:密度 [仪器和试剂] 本试验采用的膜渗透压计为德国Knauer公司的膜渗透仪. 与该公司特制的专为测定水溶性物质用的双层膜作为半透膜, 溶剂为脱气蒸馏水。
第4章
多糖的干燥和纯度鉴定
(2) 用同样方法，取试剂15 mL 放人试管，经保温，待冷却到 室温后，移人容量瓶加水到 50 mL ，作为对照溶液。比色时用 500nm滤光板。
(3)如果检测的样品是淀粉，则可用麦芽糖作参比物。取麦芽 糖4mg，与检样的显色反应同样操作。 (4)从50 mL容量瓶中取一部分作适当稀释，配制成几个不同 浓度的溶液,测定它们的光密度，作浓度光密度曲线图。 图中的麦芽糖浓度，可以用麦芽糖的毫摩尔表示，读取样 品的光密度之后，从该曲线查对其相应的毫摩尔数，从而计算 样品的分子量: