5多糖分子量测定-PPT精选文档
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(2)样品准备：每一测定的样品需配3～5个不同浓度的溶液。 本试验中用右旋糖酐配制成 O.209 g／100 mL(C1)，O.403 g／ 100 mL(C2)及O.626 g／lOO mL(C3)3种浓度的溶液。 (3)样品测定：先用浓度为C1的样品由进样管注入上池，清洗 3次，再注满进行测量，直到记录仪达到平衡。划出的直线与基 线之间的距离即为该浓度溶液的π 值。 同法测定C2，C3溶液的π 值。
[试剂] 3，5一二硝基水杨酸溶液：称取666 mg经2次重结晶的3，5 一二硝基水杨酸，溶解于 200 mL 浓度为 1 mol ／L 的氢氧化钾溶 液中。 [操作] (1)称取样品100～200 mg放人100 mm×20 mm试管，加15 mL试 剂，经过搅拌使样品溶解，然后在65℃的恒温水浴中保温1小时 ，待冷却至室温后，将反应液移入50 mL容量瓶，用水淋洗反应 管多次，淋洗液并入容量瓶，添加水至刻度。
用端基法测分子量要求检样的化学结构须具备如下两个条件： (1) 每一个分子链端须具有可以用化学方法作分析的基团， 以便采用一定的定量分析方法，对该端基作定量分析。 (2) 检样的每一个分子链，它所含可测端基的数目，不但须 明确，而且数目应固定不变。
第4章
多糖的干燥和纯度鉴定
下面介绍几种常用的测定多糖还原端基的定量分析方法: 3，5一二硝基水杨酸比色法 本方法在还原糖与3，5一二硝基水杨酸反应时，产生颜色。 测定检样时，用一个已知分子量和已知浓度的溶液作参比，经 过比色，计算检样的分子量。
第5章
多糖的分子量测定
多糖的分子量测定是研究多糖性质的一项 较为重要的工作。多糖的性质往往与它的分 子量大小有关。例如，多糖溶液的粘度不但 随浓度的增大而升高，而且与多糖分子量大 小有关。一般说来，分子量增大，粘度增高。 在生物学研究中，发现某些多糖由于分 子量大小方面的差别，所产生的某些效应也 有一定差异。
第4章
多糖的干燥和纯度鉴定
测定多糖分子量时，为了避免因存在杂质而影 响测定结果，需要把检测的样品(简称样品或 检样)适当提纯。用于分子量测定的样品，纯 度要求虽然不十分高，但至少要达到 : (1)去除杂质和水分。 (2) 把不同化学结构的组分相互分开，使它们在 测定分子量中不相互干扰。 (3)把不同分子量大小的组分相互分开。 另外,在用某些方法进行分子量测定时，需要先 将小分子量的盐和单糖除去。
第4章
多糖的干燥和纯度鉴定
由于不同分子量大小的多糖具有不同的性 质，在多糖的应用中，如以其作为试剂使用 于某些实验时，往往需要在它的分子量大小 方面作选择。可见,不论在多糖性质的研究， 或是在它的用途等方面，都涉及分子量方面 的问题，往往需要测定它的分子量。因而测 定分子量成为研究和制备多糖的一项经常性 工作。
第4章
多糖的干燥和纯度鉴定
一、渗透压法：
利用膜渗透压计 (Membrane Osmometer，简称MO仪) 可以测定范围在 1 万～ 50 万之间的多糖分子量。本法 不需用标准品. [原理]:把多糖水溶液装在半透膜制成的透析袋内， 袋外为溶剂(水)，水分子可以自由通过半透膜，多糖 分子则不能通过透析膜，因此袋内的多糖分子必将吸 引更多的水分子渗入袋内，形成一定的渗透压。渗透 压与溶液中的溶质分子数有关，可以用范特荷甫公式 表示，即 π V=nRT (1-1) 式中π ——渗透压； V——溶液体积； n——溶液摩尔数； R——气体常数； T——绝对温度。
膜渗透仪的主要部件是渗透池,由半透膜分隔成上下两池, 下池底部中央有一压敏换能元件。操作时先将下池充满纯水， 加上半膜后再将上池充满测定的溶液。在恒温条件下使两池达 成平衡，压力之差由换能器输出信号放大后记录，求得π 值.
第4章
多糖的干燥和纯度鉴定
膜渗透压计示意图
第4章
多糖的干燥和纯度鉴定
[操作] 以右旋糖酐分子量的测定为例。 (1)仪器准备：将脱气后的蒸馏水充满下池。浸泡好的半透膜 覆盖其上并注意勿使气泡进入。将上池压紧。按操作要求逐步 旋紧中心螺丝 ( 约8 小时) ，装上针阀及校正杯进行仪器校正 ( 约 12小时)，取下针形阀及校正杯，装上进样管，用溶剂充分冲洗 后，开动记录仪，划出基线(约12小时)。
第4章
多糖的干燥和纯度鉴定
(2) 用同样方法，取试剂15 mL 放人试管，经保温，待冷却到 室温后，移人容量瓶加水到 50 mL ，作为对照溶液。比色时用 500nm滤光板。
(3)如果检测的样品是淀粉，则可用麦芽糖作参比物。取麦芽 糖4mg，与检样的显色反应同样操作。 (4)从50 mL容量瓶中取一部分作适当稀释，配制成几个不同 浓度的溶液,测定它们的光密度，作浓度光密度曲线图。 图中的麦芽糖浓度，可以用麦芽糖的毫摩尔表示，读取样 品的光密度之后，从该曲线查对其相应的毫摩尔数，从而计算 样品的分子量:
RT M= π × D CC-O
第4章
多糖的干燥和纯度鉴定
二、端基法 [ 原理] 测定单位重量样品中所含可测端基之数，计算检样的分子 量. 例如,对某一种多糖的分子结构，业已明确知道它每一个分 子链含有一个可测端基和每毫克中所含的可测端基为 A mmol ， 那么，该多糖的分子量应该是1／A。 可见检样的分子量,是它每毫克重量中所含可测端基的毫摩 尔数的倒数，在端基法测定分子量时，分子量计算的通式为: 检样重量mg／可测端基(mmol)=检样的分子量(Mn)
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多糖的干燥和纯度鉴定
因
n=W/M， W=CV, 代人上式简化后得: M=RT/(π /C ) (1—2) C:浓度 有些研究者认为应当考虑溶剂在不同温度时的密度D，即 M=RT/(π /c*D) (1—3) D:密度 [仪器和试剂] 本试验采用的膜渗透压计为德国Knauer公司的膜渗透仪. 与该公司特制的专为测定水溶性物质用的双层膜作为半透膜, 溶剂为脱气蒸馏水。
第六章 多糖的分子量测定
样品 (4)分子量计算： R—气体常数（848） 浓度C (g／100 mL) T—绝对温度 渗压” π —渗透压 π /C D—密度 1
O.209
2
0.403
3
0.626 0.8 1.238
O.3 0.5 1.435 4 1.271 7
将π /C对C作图求得 π /C c→0为1.50。T=24℃ ，D=0.9973代人式得: M≈168O00.
[试剂] 3，5一二硝基水杨酸溶液：称取666 mg经2次重结晶的3，5 一二硝基水杨酸，溶解于 200 mL 浓度为 1 mol ／L 的氢氧化钾溶 液中。 [操作] (1)称取样品100～200 mg放人100 mm×20 mm试管，加15 mL试 剂，经过搅拌使样品溶解，然后在65℃的恒温水浴中保温1小时 ，待冷却至室温后，将反应液移入50 mL容量瓶，用水淋洗反应 管多次，淋洗液并入容量瓶，添加水至刻度。
用端基法测分子量要求检样的化学结构须具备如下两个条件： (1) 每一个分子链端须具有可以用化学方法作分析的基团， 以便采用一定的定量分析方法，对该端基作定量分析。 (2) 检样的每一个分子链，它所含可测端基的数目，不但须 明确，而且数目应固定不变。
第4章
多糖的干燥和纯度鉴定
下面介绍几种常用的测定多糖还原端基的定量分析方法: 3，5一二硝基水杨酸比色法 本方法在还原糖与3，5一二硝基水杨酸反应时，产生颜色。 测定检样时，用一个已知分子量和已知浓度的溶液作参比，经 过比色，计算检样的分子量。
第5章
多糖的分子量测定
多糖的分子量测定是研究多糖性质的一项 较为重要的工作。多糖的性质往往与它的分 子量大小有关。例如，多糖溶液的粘度不但 随浓度的增大而升高，而且与多糖分子量大 小有关。一般说来，分子量增大，粘度增高。 在生物学研究中，发现某些多糖由于分 子量大小方面的差别，所产生的某些效应也 有一定差异。
第4章
多糖的干燥和纯度鉴定
测定多糖分子量时，为了避免因存在杂质而影 响测定结果，需要把检测的样品(简称样品或 检样)适当提纯。用于分子量测定的样品，纯 度要求虽然不十分高，但至少要达到 : (1)去除杂质和水分。 (2) 把不同化学结构的组分相互分开，使它们在 测定分子量中不相互干扰。 (3)把不同分子量大小的组分相互分开。 另外,在用某些方法进行分子量测定时，需要先 将小分子量的盐和单糖除去。
第4章
多糖的干燥和纯度鉴定
由于不同分子量大小的多糖具有不同的性 质，在多糖的应用中，如以其作为试剂使用 于某些实验时，往往需要在它的分子量大小 方面作选择。可见,不论在多糖性质的研究， 或是在它的用途等方面，都涉及分子量方面 的问题，往往需要测定它的分子量。因而测 定分子量成为研究和制备多糖的一项经常性 工作。
第4章
多糖的干燥和纯度鉴定
一、渗透压法：
利用膜渗透压计 (Membrane Osmometer，简称MO仪) 可以测定范围在 1 万～ 50 万之间的多糖分子量。本法 不需用标准品. [原理]:把多糖水溶液装在半透膜制成的透析袋内， 袋外为溶剂(水)，水分子可以自由通过半透膜，多糖 分子则不能通过透析膜，因此袋内的多糖分子必将吸 引更多的水分子渗入袋内，形成一定的渗透压。渗透 压与溶液中的溶质分子数有关，可以用范特荷甫公式 表示，即 π V=nRT (1-1) 式中π ——渗透压； V——溶液体积； n——溶液摩尔数； R——气体常数； T——绝对温度。
膜渗透仪的主要部件是渗透池,由半透膜分隔成上下两池, 下池底部中央有一压敏换能元件。操作时先将下池充满纯水， 加上半膜后再将上池充满测定的溶液。在恒温条件下使两池达 成平衡，压力之差由换能器输出信号放大后记录，求得π 值.
第4章
多糖的干燥和纯度鉴定
膜渗透压计示意图
第4章
多糖的干燥和纯度鉴定
[操作] 以右旋糖酐分子量的测定为例。 (1)仪器准备：将脱气后的蒸馏水充满下池。浸泡好的半透膜 覆盖其上并注意勿使气泡进入。将上池压紧。按操作要求逐步 旋紧中心螺丝 ( 约8 小时) ，装上针阀及校正杯进行仪器校正 ( 约 12小时)，取下针形阀及校正杯，装上进样管，用溶剂充分冲洗 后，开动记录仪，划出基线(约12小时)。
第4章
多糖的干燥和纯度鉴定
(2) 用同样方法，取试剂15 mL 放人试管，经保温，待冷却到 室温后，移人容量瓶加水到 50 mL ，作为对照溶液。比色时用 500nm滤光板。
(3)如果检测的样品是淀粉，则可用麦芽糖作参比物。取麦芽 糖4mg，与检样的显色反应同样操作。 (4)从50 mL容量瓶中取一部分作适当稀释，配制成几个不同 浓度的溶液,测定它们的光密度，作浓度光密度曲线图。 图中的麦芽糖浓度，可以用麦芽糖的毫摩尔表示，读取样 品的光密度之后，从该曲线查对其相应的毫摩尔数，从而计算 样品的分子量:
RT M= π × D CC-O
第4章
多糖的干燥和纯度鉴定
二、端基法 [ 原理] 测定单位重量样品中所含可测端基之数，计算检样的分子 量. 例如,对某一种多糖的分子结构，业已明确知道它每一个分 子链含有一个可测端基和每毫克中所含的可测端基为 A mmol ， 那么，该多糖的分子量应该是1／A。 可见检样的分子量,是它每毫克重量中所含可测端基的毫摩 尔数的倒数，在端基法测定分子量时，分子量计算的通式为: 检样重量mg／可测端基(mmol)=检样的分子量(Mn)
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因
n=W/M， W=CV, 代人上式简化后得: M=RT/(π /C ) (1—2) C:浓度 有些研究者认为应当考虑溶剂在不同温度时的密度D，即 M=RT/(π /c*D) (1—3) D:密度 [仪器和试剂] 本试验采用的膜渗透压计为德国Knauer公司的膜渗透仪. 与该公司特制的专为测定水溶性物质用的双层膜作为半透膜, 溶剂为脱气蒸馏水。
第六章 多糖的分子量测定
样品 (4)分子量计算： R—气体常数（848） 浓度C (g／100 mL) T—绝对温度 渗压” π —渗透压 π /C D—密度 1
O.209
2
0.403
3
0.626 0.8 1.238
O.3 0.5 1.435 4 1.271 7
将π /C对C作图求得 π /C c→0为1.50。T=24℃ ，D=0.9973代人式得: M≈168O00.