重组质粒的构建

重组质粒构建

生物学——屠仁军(新浪) 一、载体与外源片段（PCR产物）的双酶切

为了保证做连接反应时有足够的外源DNA片段，应该加入1ug的DNA进行酶切反应；两种酶分别加1ul，10×buffer 2ul，1ug的DNA，加水至20ul。（因此要跑胶分析DNA以及载体的浓度，取1-2ul，电泳检测其含量。1ul体积太少，可以将其稀释在9ul水中，再加loading buffer。6ul 15000bp的marker，2500bp条带的亮度约是100ng DNA。可对比marker的亮度算出酶切回收的DNA的浓度，以便于确定连接反应时的用量。Image J软件可以做灰度分析。）

双酶切反应结束后，使用PCR cleanup试剂盒回收DNA与载体。回收完之后用同样的方法分析其浓度。（也可以用分光光度计直接测量DNA的浓度，但是，一般酶切反应之后其浓度会比较小，取1ul 稀释100倍之后浓度很低，可能已经低于仪器的测量范围，而电泳灵敏度很高，还可一排除杂带、RNA、蛋白质等对浓度的干扰。）

二、连接反应

载体100ng，DNA片段根据大小，1ul buffer，1ul T4连接酶，加水至10ul；16℃连接12-16h。

载体（约0.03pmol）与外源DNA的摩尔比大约1：3-1：10之间，根据载体与DNA片段的长度，可算出需要的量。因为载体的大小一般在5kb-10kb，因此，严格的算出0.03pmol的载体的质量意义不大，大约100ng即可。如果时间比较紧张，可以25℃连接15min，之后可取5ul进行转化，剩余5ul于16℃继续连接。

三、质粒转化到感受态大肠杆菌中

从-70℃中取出感受态，指尖轻转融化后立即插入冰上，5ul连接产物+100ul感受态大肠杆菌，充分混匀后冰浴30min，然后42°热激90s，热激时不要晃动EP管。然后立即插入冰上，静置2min。（连接产物的量尽量不超过感受态体积的5%，否则会降低转化效率，从而得不偿失。）在超净台中向EP管中加入700ul 无抗性LB培养

基，然后37℃摇床培养45min-1h；4000rpm离心3min，在超净台中弃去700ul上清，然后轻轻吹打残留的菌液沉淀，涂平板；（涂平板的玻璃棒要在酒精灯上烧热灭菌，后冷却）37℃培养箱先正放15min，之后倒置培养12-16h。（超过16h，则阳性克隆周围会生出卫星菌落，原因是阳性克隆会分泌水解氨苄的酶到培养基中，水解其周围的氨苄，因此，平板上的DH5α、杂菌等会生长。）

四、重组子的挑取培养

挑选单克隆到2ml LB培养基中，37℃培养8-16h，可提质粒。（要在管壁上部用注射器的针头烧热，戳个小洞，因为大肠杆菌是好氧的，无菌会生长缓慢）

其实在挑克隆培养的时候就可以PCR鉴定，先配好PCR反应体系，在超净台中，同一个克隆，一半用于摇菌培养，一半用小的枪头挑取在对应的PCR体系里涮一下，即可作为模版进行PCR反应。

PCR时要做阴性、阳性对照。阴性对照，用枪头在没有菌落的培养基上沾一下做模版（PCR灵敏度很高，要排除连接体系中的残留的DNA对结果影响的可能），阳性对照用最初PCR扩增DNA片段时的模版。也可以等37℃培养8-16h之后取1ul菌液做模版鉴定，或者提质粒之后，用质粒做模版进行鉴定，均可。

五、质粒的提取与电泳检测

1. 在超净台中取300ul菌液与无菌EP管中，4℃保存，待鉴定是否成功后取100ul菌液+100ul 50%甘油保种，送200ul菌液到公司测序，不正确的丢掉即可。（如果质粒量很多，也可以送5-10ul质粒测序）

2.取1ml菌液到新的EP管,12000 rpm离心30s，弃上清，再将700ul剩余菌液于同一EP管，12000 rpm离心30s，弃上清。然后瞬时离心，将残留液体吸干。（枪头不能重复使用）

3.加入预冷的200ul溶液I(4℃低温保存)。反复吹打混匀。（一定要混匀，不然会影响裂解效果，可以用涡旋混合器震荡混匀）

4.加入200ul溶液II，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管3-5次。

（不要剧烈震荡，防止基因组DNA、质粒断裂，可以悬空加试剂，这样不用换枪头，而且比较快，下同）

5. 观察到溶液变清后，立即加入预冷的200ul 溶液III。颠倒3-5次，颠倒时用手指轻弹离心管底部，混匀。冰浴5min。12000rpm 离心10min。

6.取400ul上清至另一干净的离心管中（尽量不要吸到白色的沉淀物质，如果效果不理想，可以转移400ul上清至新离心管，12000rpm，5min，之后在转移上清），加入500ul异丙醇，充分混匀。室温放置2min，12000rpm离心10min。

7. 弃上清，加入700ul 75%的乙醇，轻轻颠倒两次，12000rpm 离心5min，重复操作一次。

8.弃上清，然后瞬时离心，用Tip头将残留酒精吸干。空气中干燥10min。

9.加入50-100ul Elution Solution(65℃预热)溶解质粒。

10.取1ul质粒，加9ul DDW，2ul 6*loading buffer，混匀电泳检测质粒浓度。

六、酶切鉴定或者PCR检测

大约酶切1ug质粒进行鉴定。如果质粒含量太少，即便能够切下目的条带，也有可能看不到。（为了节约，鉴定时取0.25-0.5ul的酶，20ul体系，酶切30min-1h，即可电泳跑胶）

PCR检测，则将提取的质粒稀释10-100倍到适合做模版的浓度（taq酶的说明书上有说明），利用目的片段的引物，使用普通的taq 酶PCR即可。

注意事项：

1.移液器使用结束后调回最大量程放归远处。

2.本实验属于微量操作，用量极少的步骤必须严格注意吸取量的准确性并确保样品全部加入反应体系中。

3.不论是酶切还是连接反应，加样的顺序应该是，先加双蒸水，其次是缓冲液和DNA，最后加酶。而酶液要在加入前从-20℃的冰箱