重组质粒的构建
重组质粒构建流程
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重组质粒的构建经验 [技巧]
![重组质粒的构建经验 [技巧]](https://img.taocdn.com/s3/m/f026746187c24028915fc3fa.png)
重组质粒的构建经验 [技巧]重组质粒的构建经验~~~昨天我在版中我看很多谷友询问重组质粒的构建问题，有些谷友说构建质粒需要一个月，甚至更长时间，这让我联想我刚做分子生物学时候的曲折。
重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。
在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。
但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。
在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能为谷友提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。
所涉及内容如下: 1) 克隆基因的酶切位点问题 2) 载体酶切的问题 3) 连接片段浓度比的问题在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。
一、克隆基因的酶切位点问题 1、克隆位点选择的问题。
首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。
然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。
这是常识，不赘述。
2、保护碱基数目的问题。
在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。
但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。
这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。
一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行;而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA片段上。
如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。
下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。
NcoI 4 NdeI 6 NheI 3 NotI 8 PmeI 6SacI 3 SalI 3 SmaI 3 HindIII 3 BstI 8 SphI 4XhoI 3 XbaI 3 SmaI 4 案例分析一:本人最初曾选用NdeI克隆位点，未注意到保护碱基数目的问题，设计PCR引物时，引入NdeI酶切位点后，只加上两个保护碱基，一个月内没有进展，始终不能成功构建重组载体。
重组质粒的构建
重组质粒的构建重组质粒的构建是基因工程的核心步骤之一，其目的是将目的基因插入到质粒载体中，以实现目的基因的稳定表达和克隆化。
以下是重组质粒构建的主要步骤：1.目的基因获取首先需要获取目的基因。
目的基因可以从基因文库、PCR、基因组测序等方法中获取。
根据需要选择合适的方法，将目的基因克隆到质粒载体中。
2.载体质粒选择选择适合的质粒载体是重组质粒构建的关键步骤之一。
根据目的基因的特点和表达要求，选择适合的质粒载体。
常见的质粒载体有pET、pUC、pBluescript等。
3.限制性酶切限制性酶切是重组质粒构建的重要步骤之一。
通过限制性酶切，将目的基因和质粒载体分别切开，露出粘性末端，以便于连接反应。
4.连接反应将切好的目的基因和质粒载体的粘性末端连接在一起，形成重组质粒。
连接反应需要使用T4DNA连接酶或其它连接酶进行催化。
连接反应需要在适宜的温度和pH 条件下进行一定时间，以确保重组质粒的正确构建。
5.转化宿主细胞将连接反应得到的重组质粒转化到宿主细胞中。
常见的宿主细胞有细菌、酵母、昆虫等。
转化方法有多种，如电穿孔法、化学转化法等。
转化后需要在适宜的培养条件下进行培养，以获得大量的重组质粒。
6.克隆筛选克隆筛选是重组质粒构建的重要步骤之一。
通过克隆筛选，可以确定重组质粒是否正确构建。
常见的克隆筛选方法有蓝白斑筛选、酶切法等。
7.序列验证最后需要对重组质粒进行序列验证，以确保目的基因的正确插入和序列的准确性。
序列验证可以通过Sanger测序等方法进行。
DNA重组质粒的构建概述
DNA重组质粒的构建概述引言DNA重组质粒是现代生物学研究中常用的工具，它可以用来携带外源基因并在目标生物体中表达，从而实现对基因功能的研究和利用。
本文将概述DNA重组质粒的构建过程，包括选择质粒载体、外源基因的克隆插入以及构建质粒的鉴定等内容。
选择质粒载体质粒是细胞内独立存在的环状DNA分子，广泛存在于细菌和酵母等单细胞生物中。
在构建DNA重组质粒时，选择一个适合的质粒载体非常关键。
常用的质粒载体有pUC19、pET28a、pET-DEST42等，在选择时可以根据实验需求考虑载体大小、选择标记物和基因表达系统等因素。
外源基因的克隆插入1. DNA片段的获取首先，需要获取外源基因的DNA片段。
这可以通过PCR扩增、基因合成或其他方法来获得。
在PCR扩增时，需要设计一对引物，使其能够特异性地扩增目标基因。
合成基因片段时，可以利用现代合成生物学的技术，将目标基因序列按照设计的引物进行人工合成。
2. 酶切和连接接下来，使用限制酶将质粒载体和外源基因片段酶切开。
酶切的目的是产生互补的黏性末端，使得质粒载体和外源基因片段可以互相连接。
选择适当的限制酶在切割时产生互补的黏性末端，使得连接更加有效。
然后，将质粒载体和外源基因片段连接在一起。
这可以使用DNA连接酶和连接试剂，在适当的条件下进行连接。
连接后的质粒称为重组质粒。
3. 转化宿主细胞将构建好的重组质粒转化到适当的宿主细胞中，使其能够在细胞内进行复制和表达。
常用的宿主细胞有大肠杆菌和酵母等。
构建质粒的鉴定通过一系列实验，对构建好的质粒进行鉴定，以确保其正确性和完整性。
常用的鉴定方法有限制酶切鉴定、测序验证、PCR扩增鉴定等。
1. 限制酶切鉴定利用正确的限制酶将质粒进行切割，然后经过琼脂糖凝胶电泳进行分析。
根据不同的切割模式，可以判断质粒是否正确构建。
2. 测序验证通过测序技术对质粒进行测序分析，确保质粒中的外源基因片段的完整性和准确性。
3. PCR扩增鉴定使用特异性引物对质粒进行PCR扩增，在琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物的大小，判断质粒中的目标基因是否存在。
重组质粒构建注意事项
重组质粒构建注意事项重组质粒构建是现代生物学中常用的技术手段，其能够利用DNA重组技术将感兴趣的基因片段插入到质粒中，从而探究基因的功能、调控及其在生物体中的作用。
下面是重组质粒构建中需要注意的一些关键问题。
1.选择合适的质粒载体：质粒是一种能够自主复制的小型DNA分子，其可以含有多个对基因表达有重要影响的元件，如启动子、终止子、选择性标记基因等。
因此，选择合适的质粒载体对于重组质粒构建至关重要。
一般而言，常用的质粒载体有pUC19、pBR322、pBluescript等，根据实验需要选择适合的质粒载体。
2.选择合适的限制性内切酶：限制性内切酶是能够识别特定的DNA序列并具有切割作用的酶。
在重组质粒构建中，常需要利用限制性内切酶切割质粒载体和目标基因片段的DNA，从而产生互补的粘性末端，便于二者连接。
因此，选择适合的限制性内切酶对于重组质粒的构建是非常重要的。
3.设计合适的引物：引物是在PCR扩增反应中用于识别目标DNA序列的短小DNA片段。
在重组质粒构建中，利用引物扩增目标基因片段是必不可少的步骤。
因此，设计合适的引物非常重要。
引物应具有良好的特异性，能够特异性地扩增目标基因片段，并且不会与质粒载体序列发生非特异性扩增。
此外，引物还可以设计一些限制性内切酶切割位点，以便于后续的连接工作。
4.进行寡核苷酸连接反应：连接反应是指将质粒载体和目标基因片段进行连接的步骤。
常用的方法有T4 DNA连接酶的连接反应和PCR引物连接法。
在连接反应中，需要注意合适的反应条件，例如连接反应的时间、反应体系的pH值、温度等，对连接效果有重要影响。
5.转化宿主细胞：转化是指将重组质粒导入宿主细胞中。
在进行转化实验时，需要注意选择合适的宿主细胞，例如大肠杆菌（E. coli）等，以及适当的培养基、适宜的温度和容器。
此外，还需要注意进行适当的筛选压力，如在含有选择性抗生素的培养基中进行培养，筛选能够稳定带有重组质粒的转化子。
重组质粒的构建.
重组质粒的构建实验流程—质粒构建基因提取—1、2、3基因提取—1、2、3PCR反应扩增目的基因—4、3PCR反应扩增目的基因—4、3DNA片段回收—5、3DNA片段回收—5、3重组质粒检测：（1）PCR (2)双酶切—8、5重组质粒检测：（1）PCR (2)双酶切—8、5测序测序重组质粒提取—2、 3重组质粒提取—2、 3菌种保藏—7菌种保藏—7目的片段与载体连接及转化—6目的片段与载体连接及转化—6实验操作1、 LB培养基配置LB培养基用于一般细菌培养，特别用于分子生物学试验中大肠杆菌的保存和培养。
其中蛋白胨、酵母膏粉提供氮源、维生素和生长因子，NaCl维持均衡的渗透压，葡萄糖提供碳源，琼脂是培养基的凝固剂。
【试剂】胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast Extract）、NaCl、琼脂（Agar）【实验步骤】1、 LB固体培养基配方（配置100ml培养基）胰蛋白胨（Tryptone） 1g酵母提取物（Yeast Extract） 0.5gNaCl 1g琼脂（Agar） 1.5g单蒸水 100ml蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速，另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品、或在称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一种药品，瓶盖也不要盖错。
2、液体培养基除不加琼脂外，其余同固体培养基一样。
3、包扎用报纸封住瓶口，再用皮筋捆扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
4、灭菌将上述培养基以1.05kg/cm2、121.3℃、20min高压蒸汽灭菌。
如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入4℃冰箱内暂存。
灭菌后，将锥形瓶放入烘箱烘干，烘干后，4℃保存。
5、 LB固体培养基倒板配置：如上述配方配置100ml的LB固体培养基。
抗生素的加入：将凝固的培养基放入微波炉内加热至完全融化，然后置于55℃的水浴中，待培养基温度降至55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。
重组质粒构建(protocol)
重组质粒的构建（beta版）一、引物设计:1.选择合适的载体。
酶切位点及其顺序（酶切位点的顺序一定不能颠倒;注意ATG和stop codon）。
2.在NCBI上再次确认目的片段的碱基序列。
1，使用word2，设计引物：primer-upPrimer-down3，另设计一对引物扩增CDS区，引物位于CDS区之外，扩增产物包含完整的CDS区。
引物长度约20个碱基。
4，核对----送公司合成。
5，对公司合成的引物快速离心，在超净台按照管子上标注的体积加入高压水（dd2H2O），配成100umol/ul(100uM),-20℃保存。
使用时按1：3比例稀释成25uM工作浓度。
二、PCR（P出目的片段）：（一）、PCR P出目的片段：2,pcr: cDNA 1ul10x PFU buffer 2.5ul ℃ 5mindNTP 1ul ℃ 30secF’-Primer 1ul ℃ 30secR’-Primer 1ul ℃ X minPFU 0.5ul ℃ 5mindd2H2O 18ul（X是根据片段的长度设定，1000bp/min，退火温度根据Tm值来计算，一般低于Tm值5℃）3，跑胶、回收:（1），配胶：0.6g 琼脂糖60ml 1X TAE0.6ul (待温度降到50-60℃左右时)25分钟后，即可点样跑胶。
（2），跑胶：130-150V、25-30分钟左右。
（3），紫外灯下观察，切胶（要带防护手套和口罩）4，胶回收（胶回收试剂盒）:按照试剂盒的protocol来做，在胶回收的最后一步，Elution Buffer预先在55-65℃温箱中水浴，放在37℃温箱中2min。
对胶回收的产物跑胶验证。
可建立10ul的体系：回收产物5ul、6xloading buffer 2ul、dd2H2O 5ul。
三、酶切、链接：1，目的片段酶切：（酶切时间根据酶的活性,70℃15-20min灭活）insert (胶回收产物) 10ul10 x buffer 2ul20ul的体系dd2H2O 6ulEcoRI 1ulHindⅢ1ul2，载体酶切：（1~2小时）Vector （1ug/ul）：5 ul（总量5ug）10 x buffer 2ul20ul的体系dd2H2O 11ulEcoRI 1ulHindⅢ1ul为方便以后使用，载体可以一次性多切点。
构建重组质粒基本方法
构建重组质粒基本方法重组质粒是一种重要的遗传工程工具，用于将外源基因导入到宿主细胞中，从而实现特定基因的表达与功能研究。
构建重组质粒的基本方法可以概括为：选择质粒骨架、引物设计与合成、PCR扩增外源基因片段、DNA连接与重组、质粒扩增与提取、质粒鉴定与筛选，以下分别进行详细介绍。
一、选择质粒骨架在构建重组质粒时，首先需要选择一个合适的质粒骨架。
质粒骨架是指一个可复制的质粒DNA分子，常见的质粒骨架有pUC、pBR322、pET等。
质粒骨架上通常包含有宿主细胞可以识别的起始子和起始子附近的终止子，用于启动和终止转录过程，同时还包含选择标记基因，如抗生素抗性基因，以及其他在分子克隆中常用的诸如多克隆位点、限制酶切位点等。
二、引物设计与合成在构建重组质粒时，需要利用引物来扩增并克隆外源基因片段。
引物一般是两条DNA可控引物，其中一条是正向引物，另一条是反向引物。
引物的设计需要注意以下几点：引物的长度通常为15-30个碱基对，引物应该具有合适的Tm值，并且在引物双链的末端至少有2个碱基对是纯G或纯C。
引物可以使用商业引物合成公司合成。
三、PCR扩增外源基因片段使用引物扩增外源基因片段是构建重组质粒的一个关键步骤。
PCR反应一般包括DNA模板、引物、dNTPs和DNA聚合酶。
根据需要，可以使用特异性引物对目标基因进行PCR扩增，然后通过凝胶电泳检查PCR产物长度和纯度，并使用PCR产物进行下一步处理。
四、DNA连接与重组将PCR扩增得到的外源基因片段与质粒骨架进行连接和重组。
连接通常通过使用限制酶切和连接酶来实现。
限制酶切是利用限制酶切剪切DNA，生成具有互补粘性末端的DNA片段，然后将外源基因片段与质粒骨架进行连接。
连接酶可以使DNA片段之间的末端骨架参与phosphodiester结合反应，从而形成连体分子。
五、质粒扩增与提取将重组质粒转化到宿主细胞中，通过培养和培养基筛选来扩增质粒。
质粒扩增一般在含有抗生素的琼脂糖平板上进行，抗生素可以选择对宿主细胞有毒作用但不对重组质粒有毒的抗生素。
重组质粒构建流程
重组质粒构建流程导言在分子生物学研究中，质粒是一种重要的工具，可用于携带外源DNA，转导到靶细胞内进行表达或操纵基因。
在许多应用中，需要从头开始构建特定的质粒来满足实验需求。
本文将介绍重组质粒的构建流程，包括质粒设计、DNA片段的合成、连接和转化等步骤。
质粒设计重组质粒的构建首先需要进行质粒设计。
在设计过程中，需要考虑以下几个方面：质粒拓扑结构、宿主细胞、选择标记、启动子、终止子等。
其中，质粒拓扑结构是质粒构建的基础，可以选择环状质粒或线性质粒；宿主细胞是质粒的宿主细胞，需要考虑宿主细胞的特性和适用范围；选择标记是用于筛选携带外源DNA的宿主细胞，可以选择抗生素抗性标记、荧光蛋白标记等；启动子和终止子则是用于调控外源DNA的表达水平。
DNA片段的合成在质粒构建中，需要合成一系列DNA片段，包括载体骨架、选择标记、启动子、基因、终止子等。
DNA片段的合成可以通过多种方法进行，包括化学合成、PCR扩增、酶切和连接等。
在合成过程中，需要确保DNA片段的正确性和纯度，以保证后续的连接和转化效率。
连接连接是质粒构建的关键步骤，通过连接不同的DNA片段来构建目标质粒。
连接的方法包括酶切和连接、PCR扩增和连接、重组DNA技术等。
在连接过程中，需要确保连接效率和准确性，避免产生错误连接或杂交产物。
此外，对于大片段DNA的连接，还需要考虑连接的稳定性和转化效率。
质粒的放大和提取连接完成后，需要将质粒放大到足够的数量，并提取纯净的质粒DNA。
放大的方法可以选择细菌发酵、真菌发酵等，根据质粒的特性选择合适的宿主细胞进行放大。
质粒提取的方法包括碱裂解法、隐式裂解法等，确保提取的质粒DNA的纯度和完整性。
质粒的转化最后一步是将构建好的质粒转化到目标宿主细胞中，进行表达或操纵基因。
转化的方法可以选择化学转化、电转化、热激转化等，根据宿主细胞的特性和实验需求选择合适的转化方法。
在转化过程中，需要考虑转化效率、亲和性和表达水平等因素，确保转化的质粒可以稳定存在和表达。
重组表达质粒的构建
重组表达质粒的构建重组表达质粒的构建1．原核表达载体选择质粒载体是重组蛋⽩表达的关键⼯具，其结构如下图。
重组蛋⽩表达，我们⾸先要将基因插⼊到表达载体上，插⼊的位置为多克隆位点。
质粒载体上有很多的功能元件，这些元件对于蛋⽩的表达都是⾄关重要的。
尽管我们经过系统的分析和预测，但是仍有很多蛋⽩不能顺利表达、表达量很低或者表达状态不好。
这个时候我们需要尝试构建不同的表达载体以期得到最好的效果，这些载体的主要区别是启动⼦和融合标签的差异。
蛋⽩表达优化主要⼯作也就是尝试构建不同融合表达标签，使⽤不同的宿主表达菌，测试不同的表达条件，筛选出最优表达体系。
常⽤的融合标签有GST、MBP、Trx、6His、SUMO等，这些标签主要功能是促表达、促可溶、信号标记或助纯化。
福因德⽣物可以提供以下系列载体以供科研表达研究。
我们选择表达载体的时候不但要考虑蛋⽩怎么表达成功，更要考虑蛋⽩怎么纯化出来，纯化的问题主要是考虑纯化标签和酶切位点的选择，下表我们列举了常见的纯化标签和酶切位点。
以上为原核表达常⽤的标签和酶切位点,其性质也都作了简要的介绍，各专业⽹站或专业书籍已对此做详尽解释，科研⼯作者可根据具体实验设计⽅案，组合设计以上标签和酶切位点的使⽤。
特别值得注意的是，选⽤和设计蛋⽩酶切位点的时候⾸要考虑的是序列内部有没有蛋⽩酶位点，同时要考虑酶切的效率和蛋⽩酶试剂成本。
⼀般商业化载体，在标签蛋⽩与载体多克隆位点之间都设计有酶切位点。
标签可设计在N-端也可在C-端,设计在N-端的优势是,可通过标签⾼效翻译起始位点带动插⼊蛋⽩的表达,可溶性标签的⾼效表达更可促进蛋⽩的可溶性表达;同时,⼤部分的蛋⽩内切酶的切割位点在C-端,所以标签设计在N-端可将标签切割完全。
在设计标签序列与酶切位点的时候还要考虑N-端稳定性原则，也就是所谓宿主细胞的N-端规则（N-end rule）,这个要避免；同时，还应该检查是否引⼊了可与别的蛋⽩相互作⽤的序列或者蛋⽩酶切位点。
初一生物重组质粒的构建过程
初一生物重组质粒的构建过程在初一的生物学课程中，学生们将学习到生物重组质粒的构建过程。
生物重组质粒是一种重要的实验技术，被广泛应用于基因工程领域。
下面我们将详细介绍重组质粒的构建过程及其应用。
一、重组质粒的定义和价值重组质粒是由自然或人工合成的DNA片段通过体外重组技术构建而成的环状DNA分子。
它通常由两部分组成：载体DNA和插入DNA。
其中，载体DNA是一个可自主复制的DNA分子，插入DNA则是我们所关注的具有特定基因片段的DNA。
通过重组质粒的构建，我们可以将特定的基因片段导入到载体DNA中，使其能够在细胞中稳定复制。
这为我们的研究提供了一个有效的工具，可以用于分析和研究目标基因的功能以及其在生物体内的表达等方面。
二、重组质粒构建的基本步骤1. 选择适当的载体DNA在构建重组质粒之前，我们首先需要选择适当的载体DNA。
常用的载体包括质粒、噬菌体和人工合成的DNA片段等。
选择载体时需要考虑到其大小、复制能力、稳定性以及对细胞的适应性等因素。
2. 获得目标基因的DNA片段接下来，我们需要获得目标基因的DNA片段。
这可以通过PCR扩增、限制酶切或人工合成等方法来获取。
获得DNA片段后，我们需要进行酶切反应，将其制备成具有粘性末端的DNA片段。
3. 连接载体与目标基因片段连接过程中，我们使用DNA连接酶来将载体DNA和目标基因片段进行连接。
DNA连接酶具有连接末端的能力，可以将两条DNA片段通过磷酸二酯键连接起来形成一个完整的环状DNA分子。
连接完成后，我们需要进行酶切鉴定以确认连接的有效性。
4. 转化重组质粒最后一步是将重组质粒导入到宿主细胞中。
这一过程被称为质粒转化。
转化可以通过热冲击、电穿孔或利用嗜热菌的特殊性质等方法来实现。
转化完成后，我们还需要将细胞进行培养和筛选，以获得含有重组质粒的目标细胞。
三、重组质粒的应用重组质粒的构建为我们的研究提供了一个强有力的工具。
它在基因工程领域的应用非常广泛，并取得了许多重要的成果。
重组质粒的构建
重组质粒的构建实验流程—质粒构建实验操作一、LB培养基配置LB培养基用于一般细菌培养，特别用于分子生物学试验中大肠杆菌的保存和培养。
其中蛋白胨、酵母膏粉提供氮源、维生素和生长因子，NaCl维持均衡的渗透压，葡萄糖提供碳源，琼脂是培养基的凝固剂。
【试剂】胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast Extract）、NaCl、琼脂（Agar）【实验步骤】1、LB固体培养基配方（配置100ml培养基）胰蛋白胨（Tryptone） 1g酵母提取物（Yeast Extract）0.5gNaCl 1g琼脂（Agar）1.5g单蒸水100ml蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速，另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品、或在称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一种药品，瓶盖也不要盖错。
2、液体培养基除不加琼脂外，其余同固体培养基一样。
3、包扎用报纸封住瓶口，再用皮筋捆扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
4、灭菌将上述培养基以1.05kg/cm2、121.3℃、20min高压蒸汽灭菌。
如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入4℃冰箱内暂存。
灭菌后，将锥形瓶放入烘箱烘干，烘干后，4℃保存。
5、LB固体培养基倒板○1配置：如上述配方配置100ml的LB固体培养基。
○2抗生素的加入：将凝固的培养基放入微波炉内加热至完全融化，然后置于55℃的水浴中，待培养基温度降至55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。
○3倒板：一般10ml倒1个板子，培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10—15min。
○4保存:将培养皿倒置放于4℃保存，一个月内使用。
二、质粒的提取（protocol）1、大肠杆菌的培养：从平板培养基上挑选单菌落接种至5ml的含有抗生素的LB液体培养基中，37℃过夜培养。
【注：培养液不宜过量，过量时会因菌量太大而溶菌不充分，纯化时会影响质粒的纯度。
】2、5ml菌液倒入5ml离心管中，10,000xg，1min离心，弃上清。
实验二 重组质粒的构建
实验二重组质粒的构建一、实验步骤1.提取质粒DNA2.酶切（EcoRI+SpeI）注意事项：①酶量，反应时间及体积： One unit of enzyme is defined asthe quantity needed to cut 1μg of DNA in 50ul in onehour。
反应时间的选择。
一般酶切鉴定30分钟就可以了,如果酶减少，可延长反应时间（16h)；反应体系不应太小,常规的酶切一般要维持在10-50ul。
酶的体积不要超过总体积的10%（甘油应在5%以下）。
②酶的使用：酶应永远放冰上，应是最后一个被加入到反应体系中，用完后及时放回冰箱③DNA的制备：待切割的DNA应当已去除酚，氯仿，乙醇，EDTA, 去污剂或过多盐离子等④缓冲液：不同酶需不同离子强度缓冲液，使用前应将缓冲液完全溶解并充分混匀。
⑤混匀：很重要，注意不可振荡⑥反应温度：通常37 ℃⑦终止反应：终止液，热失活，酚/ 氯仿抽提⑧星号活性：在非理想条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列。
3.: 酶切产物纯化4.连接二、实验结果与分析1.酶切结果检测图1 EcoRI和SpeI双酶切GST-T及proB载体结果1%琼脂糖凝胶电泳检测图注：M：DL5000DNAmarker；1号泳道;未酶切proB 质粒DNA；10、11号泳道：EcoRI和SpeI双酶切proB载体结果；16、17泳道：EcoRI和SpeI双酶切GST-T载体结果分析：①由图1可知，1号泳道的未酶切proB质粒DNA未显示有条带，其原因可能是所点的未酶切proB标准品浓度过低，条带亮度过低难以识别。
②10和11泳道中大小约为5000bp的较亮条带是proB载体，但有轻微拖尾现象，条带呈圆弧型，应该是因为点样量较大。
经EcoRI和SpeI双酶切后，环状的质粒DNA被分成两个部分，分别为约5000bp和40bp的片段，其中40bp的小片段因分子量小，迁移速度快而跑出了琼脂糖凝胶，在图中无法看到。
构建重组质粒需要的酶
构建重组质粒需要的酶
一、重组质粒介绍
重组质粒，又被称为重组DNA，是使用分子生物学方法，从两种或多种原始序列中分离出DNA片段，并将片段再拼接起来，形成一段新
的序列，以此模仿出预定反应体系的一种技术。
重组质粒可以提高基
因表达，修复突变位点或位点，提供一种非常强大的载体，以生物工
学的方式向宿主提供基因或蛋白。
二、构建重组质粒需要的酶
重组质粒的构建的基本步骤主要包括片段的分离、引物的引导反应、酶的修饰以及插入部位的定位等。
在该过程中，除了提供片段和
引物以外，还需要酶的帮助。
重组质粒构建通常需要多种酶，其中最常用的酶有去氧核糖核酸（DNA）酶、核苷酸酶、内切酶、胞嘧啶酶家族和连接酶家族等。
除了DNA酶，还可以使用RNA修饰、内切酶和规玻环分子，使DNA可以插入重组质粒。
除此之外，可以使用胞嘧啶酶，延长重组质粒的进行时间。
三、使用重组质粒的应用
重组质粒的应用非常广泛，其中最基本的是基因工程，其中可以
利用重组质粒来进行基因修饰，以实现对基因表达的调控和改造，以
满足载体的特殊需求。
此外，还可以用于CD-80抗原表达、舌头抗原
表达等等。
此外，重组质粒还可以用于诊断，例如用重组质粒进行应用在新冠病毒核酸检测中。
四、结语
重组质粒具有改造和表达DNA的功能，是遗传工程的基础，同时也被广泛应用于基因进化、表达、诊断等领域，其中制备重组质粒的基本过程，涉及多种酶的作用。
重组质粒构建PPT课件
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质粒(Plasmid)
质粒是独立于宿主细胞（如细菌）染色体 之外的可进行复制和遗传的遗传单位-双链 闭合环状超螺旋DNA分子。是一种环状的 双链DNA分子，大小从1K-200Kb。
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❖ 通常质粒含有某些染色体没有的基因，负责 编码某些功能蛋白，这些功能并不是细菌生 存所必需的，但在一定环境下，可对细菌宿 主的生存有利。由质粒产生的表型包括对抗 生素的抗性（R因子）、产生抗生素、降解复 杂有机化合物、产生大肠杆菌素（大肠杆菌 素因子col）、肠毒素及限制酶、修饰酶等。
核心技术：DNA重组技术 （ recombinant DNA technique ）
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2
基因克隆的基本程序：
分—切—接—转—筛
PCR
酶切
连接 转化&转染
目的基因DNA片段的获得
抗性或标记筛选
外源DNA分子与载体DNA分子的体外重组
重组DNA分子转移到适当的受体菌或细胞
重组DNA 分子克隆的筛选和鉴定
DNA重组质粒的构建
医学生物所 病毒免疫室
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基因克隆 gene cloning
应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体 DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子 （重组体），继而通过转化或转染宿主细菌或 细胞、筛选出含有目的基因的转化子细菌或细 胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子 拷贝。
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插入型载体——含单一的限制性酶切位点 ，可接受酶的两个切 点，可接受20kb左右的外源片段，可用 于基因组DNA构建。-35-
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❖ 粘性质粒(cosmid) 是一种人工改造的载体,双链环状DNA，
含有λDNA的 cos区+质粒，克隆容量：40 ~
重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定
重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定实验目的：1.学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
2.学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。
3.学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。
4.掌握利用Cacl2感受态细胞的方法。
5.学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
6.掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。
7.学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。
实验原理：外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。
重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
1.重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。
其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。
单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。
实验报告构建重组质粒(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习DNA体外重组技术的原理和方法。
2. 掌握重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定技术。
3. 熟悉实验操作步骤和注意事项。
二、实验原理DNA体外重组技术是指将外源DNA片段与载体DNA片段在体外进行连接，形成重组DNA分子的技术。
通过该技术，可以将外源基因导入宿主细胞，实现基因表达和功能研究。
三、实验材料1. 载体：pUC19质粒2. 目的基因：基因片段3. 限制性核酸内切酶：EcoRI、BamHI4. DNA连接酶：T4 DNA连接酶5. DNA聚合酶：Klenow片段6. 琼脂糖凝胶电泳试剂7. DNA标记物8. 转化试剂：CaCl2、SDS、乙醇9. 受体细胞：大肠杆菌DH5α四、实验步骤1. 目的基因的扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计一对引物，引物长度一般为20-25bp，5'端添加EcoRI和BamHI酶切位点。
（2）PCR扩增：以基因片段为模板，引物为引物，进行PCR扩增。
2. 载体的酶切（1）将pUC19质粒和PCR扩增的目的基因分别用EcoRI和BamHI进行酶切。
（2）回收酶切片段：琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，回收目的片段。
3. DNA连接（1）将回收的目的基因片段和载体片段混合，加入DNA连接酶，进行连接反应。
（2）将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。
4. 转化后细胞的培养与筛选（1）将转化后的细胞在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜。
（2）取适量菌液进行PCR检测，筛选出阳性克隆。
5. 阳性克隆的鉴定（1）提取阳性克隆的质粒DNA。
（2）用EcoRI和BamHI进行酶切，琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段。
（3）将酶切片段与标记物进行对比，验证重组质粒的正确性。
五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：在PCR产物中，可见一条与预期片段大小相符的条带。
2. 酶切结果：在琼脂糖凝胶电泳中，可见目的基因片段和载体片段的酶切片段。
3. 阳性克隆的鉴定：在琼脂糖凝胶电泳中，可见与预期片段大小相符的条带，证明重组质粒构建成功。
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重组质粒构建生物学——屠仁军(新浪) 一、载体与外源片段（PCR产物）的双酶切为了保证做连接反应时有足够的外源DNA片段，应该加入1ug的DNA进行酶切反应；两种酶分别加1ul，10×buffer 2ul，1ug的DNA，加水至20ul。
（因此要跑胶分析DNA以及载体的浓度，取1-2ul，电泳检测其含量。
1ul体积太少，可以将其稀释在9ul水中，再加loading buffer。
6ul 15000bp的marker，2500bp条带的亮度约是100ng DNA。
可对比marker的亮度算出酶切回收的DNA的浓度，以便于确定连接反应时的用量。
Image J软件可以做灰度分析。
）双酶切反应结束后，使用PCR cleanup试剂盒回收DNA与载体。
回收完之后用同样的方法分析其浓度。
（也可以用分光光度计直接测量DNA的浓度，但是，一般酶切反应之后其浓度会比较小，取1ul 稀释100倍之后浓度很低，可能已经低于仪器的测量范围，而电泳灵敏度很高，还可一排除杂带、RNA、蛋白质等对浓度的干扰。
）二、连接反应载体100ng，DNA片段根据大小，1ul buffer，1ul T4连接酶，加水至10ul；16℃连接12-16h。
载体（约0.03pmol）与外源DNA的摩尔比大约1：3-1：10之间，根据载体与DNA片段的长度，可算出需要的量。
因为载体的大小一般在5kb-10kb，因此，严格的算出0.03pmol的载体的质量意义不大，大约100ng即可。
如果时间比较紧张，可以25℃连接15min，之后可取5ul进行转化，剩余5ul于16℃继续连接。
三、质粒转化到感受态大肠杆菌中从-70℃中取出感受态，指尖轻转融化后立即插入冰上，5ul连接产物+100ul感受态大肠杆菌，充分混匀后冰浴30min，然后42°热激90s，热激时不要晃动EP管。
然后立即插入冰上，静置2min。
（连接产物的量尽量不超过感受态体积的5%，否则会降低转化效率，从而得不偿失。
）在超净台中向EP管中加入700ul 无抗性LB培养基，然后37℃摇床培养45min-1h；4000rpm离心3min，在超净台中弃去700ul上清，然后轻轻吹打残留的菌液沉淀，涂平板；（涂平板的玻璃棒要在酒精灯上烧热灭菌，后冷却）37℃培养箱先正放15min，之后倒置培养12-16h。
（超过16h，则阳性克隆周围会生出卫星菌落，原因是阳性克隆会分泌水解氨苄的酶到培养基中，水解其周围的氨苄，因此，平板上的DH5α、杂菌等会生长。
）四、重组子的挑取培养挑选单克隆到2ml LB培养基中，37℃培养8-16h，可提质粒。
（要在管壁上部用注射器的针头烧热，戳个小洞，因为大肠杆菌是好氧的，无菌会生长缓慢）其实在挑克隆培养的时候就可以PCR鉴定，先配好PCR反应体系，在超净台中，同一个克隆，一半用于摇菌培养，一半用小的枪头挑取在对应的PCR体系里涮一下，即可作为模版进行PCR反应。
PCR时要做阴性、阳性对照。
阴性对照，用枪头在没有菌落的培养基上沾一下做模版（PCR灵敏度很高，要排除连接体系中的残留的DNA对结果影响的可能），阳性对照用最初PCR扩增DNA片段时的模版。
也可以等37℃培养8-16h之后取1ul菌液做模版鉴定，或者提质粒之后，用质粒做模版进行鉴定，均可。
五、质粒的提取与电泳检测1. 在超净台中取300ul菌液与无菌EP管中，4℃保存，待鉴定是否成功后取100ul菌液+100ul 50%甘油保种，送200ul菌液到公司测序，不正确的丢掉即可。
（如果质粒量很多，也可以送5-10ul质粒测序）2.取1ml菌液到新的EP管,12000 rpm离心30s，弃上清，再将700ul剩余菌液于同一EP管，12000 rpm离心30s，弃上清。
然后瞬时离心，将残留液体吸干。
（枪头不能重复使用）3.加入预冷的200ul溶液I(4℃低温保存)。
反复吹打混匀。
（一定要混匀，不然会影响裂解效果，可以用涡旋混合器震荡混匀）4.加入200ul溶液II，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管3-5次。
（不要剧烈震荡，防止基因组DNA、质粒断裂，可以悬空加试剂，这样不用换枪头，而且比较快，下同）5. 观察到溶液变清后，立即加入预冷的200ul 溶液III。
颠倒3-5次，颠倒时用手指轻弹离心管底部，混匀。
冰浴5min。
12000rpm 离心10min。
6.取400ul上清至另一干净的离心管中（尽量不要吸到白色的沉淀物质，如果效果不理想，可以转移400ul上清至新离心管，12000rpm，5min，之后在转移上清），加入500ul异丙醇，充分混匀。
室温放置2min，12000rpm离心10min。
7. 弃上清，加入700ul 75%的乙醇，轻轻颠倒两次，12000rpm 离心5min，重复操作一次。
8.弃上清，然后瞬时离心，用Tip头将残留酒精吸干。
空气中干燥10min。
9.加入50-100ul Elution Solution(65℃预热)溶解质粒。
10.取1ul质粒，加9ul DDW，2ul 6*loading buffer，混匀电泳检测质粒浓度。
六、酶切鉴定或者PCR检测大约酶切1ug质粒进行鉴定。
如果质粒含量太少，即便能够切下目的条带，也有可能看不到。
（为了节约，鉴定时取0.25-0.5ul的酶，20ul体系，酶切30min-1h，即可电泳跑胶）PCR检测，则将提取的质粒稀释10-100倍到适合做模版的浓度（taq酶的说明书上有说明），利用目的片段的引物，使用普通的taq 酶PCR即可。
注意事项：1.移液器使用结束后调回最大量程放归远处。
2.本实验属于微量操作，用量极少的步骤必须严格注意吸取量的准确性并确保样品全部加入反应体系中。
3.不论是酶切还是连接反应，加样的顺序应该是，先加双蒸水，其次是缓冲液和DNA，最后加酶。
而酶液要在加入前从-20℃的冰箱取出，酶管放置冰上，取酶液时吸头应从表面吸取，防止由于插入过深而使吸头外壁沾染过多的酶液。
取出的酶液应立即加入反应混合液的液面以下，并充分混匀。
4.Ep管的盖子应盖紧，防止水浴过程中水汽进入管内，并做好标记以防样品混淆。
5.制备凝胶时，应避免琼脂糖溶液在微波炉里加热时间过长，否则溶液将会暴沸蒸发，影响琼脂糖浓度。
制胶时要除去气泡。
拔梳子时要特别小心，以防凝胶与支持物脱离。
6.上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿。
也不要快速挤出吸头内的样品，避免挤出的空气将样品冲出样品孔。
7.紫外线对眼睛和皮肤均有伤害，对眼睛尤甚。
观察电泳条带时要确保紫外光源得到适当遮蔽，并应戴好目镜或眼罩，避免皮肤直接暴露在紫外线下。
割胶回收动作要快，避免紫外照射时间过长，使得DNA突变。
8.实验中注意更换枪头，以避免试剂的污染，悬空滴加试剂的话，可以连续使用。
碱裂解法质粒提取的原理溶液I，50 mM葡萄糖/25 mM Tris-Cl/10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH/1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾/2 M 醋酸。
溶液I的作用葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。
EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。
如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
溶液II的作用这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。
如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。
很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。
有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS 呢？那是为下一步操作做的铺垫。
这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
基因组DNA的断裂会带来麻烦。
溶液III的作用溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。
最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。
如果你这样怀疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。
大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。
如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。
既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N 的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。
因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。
但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。
这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。
如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。
大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。
这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。
那么2 M的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。