线粒体蛋白提取方法
线粒体的提取与纯化
mt DNA的分离及纯化按戴建华等报道的方法，就具体情况稍加改进，步骤如下（除特别说明，均在4℃下完成）：1.1 取新鲜肝组织，放在缓冲液A（0.25M 蔗糖，0.01M Tris·Hcl，0.001M Na2-EDTA，pH8.0）中漂洗2~3次，尽可能去除表面血污、结缔组织及脂肪组织后剪碎。
按组织重﹕缓冲液A=1﹕5~10加入缓冲液A，用玻璃匀浆器冰浴匀浆。
1.2 1000 g•min-1离心15min；取上清液；15000 g•min-1离心20min，弃上清，沉淀用缓冲液B （0.25M 蔗糖，0.05M Tris·Hcl，0.007M Mg Cl2，p H7.5）洗涤，按0.5m L•g-1肝的比例加入缓冲液B 悬浮沉淀后加入DNase I 至终浓度为100 µg•m L-1，30℃下作用30min。
1.3 冰浴冷却，加入2倍体积的DNase I反应终止液（0.25M蔗糖，0.1M Na2-EDTA，pH8.0）。
15000g•min-1离心20min。
沉淀用DNaseI反应终止液洗涤一次，重复离心。
1.4 按0.5 m L•g-1肝加入缓冲液C（0.1M Nacl，0.05M Tris·Hcl，0.01M Na2-EDTA，p H8.5）悬浮沉淀，加入SDS至终浓度为1%~1.5%，吸打混匀后37℃保温15min。
1.5 用等体积的苯酚，苯酚/氯仿（1:1），氯仿/异戊醇（24:1）各抽提一次。
取水相，加0.2 倍体积1M Na Ac和2倍体积的预冷无水乙醇，混匀后放在4℃冰箱中过夜。
1.6 15000g•min-1离心30min后去上清；沉淀用70%乙醇洗涤2次，干燥，TE（0.01M Tris·Hcl，0.001M Na2-EDTA，pH8.0）溶解。
1.7 加入预处理的RNase I 至终浓度为50µg•m L-1，37℃保温1h。
线粒体研究思路及方法
线粒体研究思路及方法1.引言1.1 概述线粒体是细胞中的一个重要细胞器，它是细胞内的“动力中心”，对于维持细胞的正常功能起着至关重要的作用。
随着科学技术的不断进步，对线粒体的研究也日趋深入。
了解线粒体的研究思路和方法对于揭示其功能、生理和病理过程具有重要意义。
线粒体的研究思路主要包括传统的研究思路和新兴的研究思路。
传统的研究思路主要依赖于细胞学、遗传学和生物化学等基础科学的方法和技术，通过对线粒体的形态、结构和功能进行观察和分析，来揭示其在细胞代谢、能量供应和细胞信号传导等方面的作用机制。
然而，传统方法存在着技术手段有限、观察分析精度不高等缺点，难以全面深入地研究线粒体。
随着新兴技术的发展，包括基因工程、蛋白质组学和转化技术在内的新方法和新工具为线粒体研究提供了更多的可能性。
通过基因工程技术可以对特定线粒体相关基因进行敲除、过表达、突变等处理，从而研究其对线粒体功能的影响。
蛋白质组学技术可以高通量地鉴定和定量线粒体蛋白，进一步揭示线粒体功能的组成和变化。
转化技术可以将外源基因导入线粒体，从而实现对线粒体的定位和操控。
除了研究思路的创新，线粒体的研究方法也在不断发展。
细胞培养方法可以提供大量的线粒体样本，为线粒体的研究提供了可靠的实验材料。
而分离纯化方法则可以将线粒体与其他细胞组分分离开来，方便对线粒体进行更深入的研究和分析。
综上所述，线粒体的研究思路和方法在不断地革新和发展中。
传统思路和新兴思路的结合，以及不断更新的研究方法为我们揭示线粒体的奥秘提供了更好的途径和手段。
未来的研究将继续深入探究线粒体的生理功能和相关疾病的发生机制，为健康和疾病治疗提供更有效的技术和策略。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以按照以下方式编写：文章结构本文按照以下结构进行组织：引言、正文和结论。
引言部分分为概述、文章结构和目的。
正文分为线粒体研究思路和线粒体研究方法两个部分。
结论部分包括总结研究思路和展望未来研究方向。
线粒体蛋白组学流程
线粒体蛋白组学流程
线粒体蛋白组学研究流程主要包括以下几个步骤：
1. 线粒体分离纯化：首先从生物样本中分离纯化线粒体，常用方法包括超速离心、密度梯度离心等。
2. 蛋白提取：对纯化的线粒体进行裂解，提取其中的蛋白质，确保充分溶解而不破坏蛋白结构。
3. 蛋白酶解：将提取的蛋白酶解成肽段，便于后续质谱分析。
4. 质谱分析：将酶解产物通过液相色谱与质谱联用技术（LC-MS/MS）进行定性和定量分析。
5. 数据处理与分析：通过生物信息学方法解析质谱数据，鉴定线粒体中的蛋白质种类及其含量变化，构建线粒体蛋白组图谱。
6. 功能注释与验证：对鉴定出的蛋白质进行功能注释，探究其在生理病理过程中的作用，并可能通过实验验证其功能。
简而言之，线粒体蛋白组学通过分离纯化、酶解、质谱检测和数据分析等步骤，系统研究线粒体内蛋白质的组成和变化规律。
线粒体膜蛋白-胞浆蛋白提取方法
1. 取 2×107 个细胞①，在 4℃，500×g 条件下离心 2-3 分钟，小心吸取培养基， 尽可能吸干，收集细胞。
产品简介： 贝博线粒体膜蛋白/胞浆蛋白提取试剂盒提供全套试剂，适用于从各种原代或传代细
胞和各种实体组织，如脑、脊髓、神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道、肾脏、心脏、肌肉、 血管、结缔组织等哺乳动物组织中提取线粒体膜蛋白和胞浆蛋白。提取过程简单方便。制备 的线粒体蛋白不仅纯度高，保持天然活性，而且绝少交叉污染。提取的蛋白可用于 Western Blotting、转录活性分析、Gel shift 凝胶阻滞实验、免疫共沉淀、酶活性测定等蛋白研究。
储存条件： 试剂 AB 于 2-8℃保存，长期存放于-20℃保存； 试剂 D 于 2-8℃保存 试剂 C 和 E 室温保存； 蛋白酶抑制剂-20℃保存。
有效期： 一年。
注意事项： ● 本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。 ● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管 底，避免开盖时试剂损失。 ● 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。 ● 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清 洗并彻底清除残留清洁剂。 ● 避免皮肤或粘膜与试剂接触。
胞浆蛋白/线粒体膜蛋白提取试剂盒
产品组成：
产品组成
BB-3178-1
BB-3178-2
规格
50T
100T
试剂 AB
10ml
20ml
试剂 C
植物线粒体膜蛋白提取
植物线粒体膜蛋白提取试剂盒简介：线粒体(Mitochondria)是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需的能量主要由在线粒体内进行的氧化所产生的能量来供应。
Leagene 植物线粒体膜蛋白提取试剂盒可从植物样本中提取线粒体膜蛋白，操作简单快捷，可在40-45min 内完成操作，含有蛋白酶抑制剂，可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。
该试剂盒主要用于从植物样本中提取线粒体膜蛋白，提取出来的膜蛋白具有天然活性，提取的蛋白可用于Western Blot 、免疫组化、酶活性测定等下游实验。
该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：操作步骤(仅供参考)：1、 配制线粒体膜蛋白提取液：取适量的MP 裂解液、蛋白酶抑制剂混合液(100×)、PMSF(100mM)置于室温溶解混匀，按MP 裂解液：蛋白酶抑制剂混合液(100×)：PMSF(100mM)=，使蛋白酶抑制剂混合液、PMSF 工作浓度为1×、1mM ，即为线粒体膜蛋白提取液。
4℃保存，1天有效。
2、 取植物组织或叶片，洗净、剪碎，加入5ml 预冷的线粒体膜蛋白提取液，在冰浴条件下迅速研磨或匀浆。
研磨或匀浆过程亦可置于液氮中充分研磨，再加入预冷的线粒体膜蛋白提取液。
3、 将匀浆液经200目细胞筛或3层纱布过滤，4℃ 1800g 离心，弃沉淀，留取上清。
4、 取上清液，4℃ 17000g 离心，弃上清液，留取沉淀。
5、 取50-150μl 线粒体膜蛋白提取液悬浮沉淀，即为线粒体膜蛋白，-70℃保存备用，进行后续的PAGE 、Western 、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
注意事项：1、 如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减编号 名称PS0203 50T PS0203 100T Storage试剂(A): MP 裂解液250ml 500ml 4℃ 试剂(B): 蛋白酶抑制剂混合液(100×) 2.5ml 5ml -20℃ 避光 试剂(C): PMSF(100mM) 5ml10ml-20℃使用说明书1份少裂解液的用量。
蛋白提取方法及注意事项
组织蛋白提取材料准备：组织、冰块、称、超声匀浆器、试剂各种试剂比例：PMSF：Lysis Buffer = 1:1001、将组织称重，减去EP管重量2、每100mg组织加入1mL(1mg ,10ul)试剂，冰上裂解半小时3、匀浆（注意低温操作），开20秒，关2秒，共打20次，每次用水冲洗，擦干，超声完后放冰上4、将匀浆液移至1.5mL预冷离心管5、离心，12000转，4℃，30分钟6、取上清至新的预冷的EP管7、BCA定量8、放入—80℃线粒体蛋白提取材料准备（放冰盒中）：线粒体试剂、EP管、EP管中的组织、枪头、PBS1、用冷PBS清洗细胞2次，洗后吸干上清2、加入A200uL，放冰上10分钟3、匀浆30-40次，每次用清水清洗匀浆器头4、离心500rpm，4℃，5分钟5、将上清移至离心管6、离心1100rpm，4℃，20分钟7、沉淀中加入200uLB，混匀8、离心1100rpm，4℃，20分钟9、弃上清10、加入80-150uL裂解液，放冰上20分钟，每隔5分钟高速震荡15秒，11、得线粒体蛋白12、定量后放-80℃冰箱。
细胞总蛋白提取材料准备：试剂（—20℃）、细胞培养板、EP管（已标记）均放置于冰盒中操作，以防止蛋白降解。
1、吸掉培基2、加入PBS，约1ml/孔左右，用手晃匀3、约5min后倒去PBS，并用枪将PBS尽量吸尽4、加入试剂，摇床振荡10分钟，再置冰上10分钟。
培养器皿面积（cm2）培养液量（ml）细胞量裂解液（ul）96 孔培养板0.32 0.1 10524孔培养板 2 1.0 5×10512孔培养板 4.5 2.0 1066孔培养板9.6 2.5 2.5×106803.5 cm 培养皿8 3.0 2×1066 cm 培养皿21 5.0 5.2×10632010 cm 培养皿55 10.0 13.7×10680025cm2培养瓶25 5.0 5×10675cm2培养瓶75 15～30 2×1075、用黄色枪头将各孔中cell刮下，保证孔底部分都要刮到，根据分组将细胞悬液吸入各个EP管中。
胞质和线粒体蛋白质提取试剂盒使用说明
胞质和线粒体蛋白质提取试剂盒使用说明产品编号：C7610包装规格：50Assays产品组成:胞质提取Buffer55mL线粒体溶解Buffer5mL蛋白酶抑制剂60μL磷酸酶抑制剂300μLDTT60μL产品简介胞质和线粒体蛋白质提取试剂盒提供独特的组份可以提取动物细胞及组织中的胞质蛋白和线粒体蛋白。
该方法先将完整的有活性的线粒体和胞质蛋白分离，再处理后获得高纯度的有活性胞质蛋白和变性的线粒体蛋白，不需要超速度离心，方法简单，可靠，快速。
可用于1D，2D电泳，Western Blot，Elisa等蛋白质实验。
提取的完整线粒体也可以经过活性溶解液处理，再用于免疫共沉淀，凋亡，细胞信号传导，能量代谢等生理学研究，或进行线粒体DNA提取，用于基因组学后续研究。
本试剂盒可以每次从1×107个培养细胞或200mg组织中提取所需要的蛋白质，可以使用50次。
产品特点1.整个实验过程大约只需要1小时左右。
2.可以从50×107个培养细胞或50×200mg组织中提取所需要的蛋白质或活性线粒体。
3.活性线粒体的提取量高，高效线粒体溶解Buffer提取的蛋白质，可以用于线粒体蛋白质组学研究。
4.不需要超速度离心，可以同时处理多个样品。
运输和保存条件常温下运输，收到后将线粒体溶解Buffer、DTT和蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂于-20℃保存，胞质提取Buffer于2-8℃保存，保质期1年。
操作步骤1.收集不少于1×107细胞，用冷PBS（pH7.4）洗涤细胞两次，每次3000rpm（800g）离心5min；组织样本（200mg）尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织，于冰上剪碎，再用冷PBS（pH7.4）洗涤三次。
2.在上述细胞或组织样本中加入1mL胞质提取Buffer（使用前每mL胞质提取Buffer加入1μL蛋白酶抑制剂，5μL磷酸酶抑制剂和1μL DTT），置玻璃匀浆器冰上均质30～50次，置于冰上冷却。
植物线粒体膜蛋白提取方法
植物线粒体膜蛋白提取试剂盒产品组成：产品组成 BB-3173-1 BB-3173-2规格 50T 100T提取液A 200ml 400ml提取液B 25ml 50ml提取液C 250ul 500ul膜蛋白溶解液 10ml 20ml蛋白酶抑制剂混合物 100ul 200ul储存条件：蛋白酶抑制剂-20℃保存；提取液2-8℃保存；膜蛋白溶解液室温保存。
有效期：一年。
产品简介：线粒体(mitochondria)是真核细胞中产生能量的重要细胞器，细胞中的能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。
跨膜蛋白承担各种生物功能，在生物的各种发展过程中扮演重要角色。
膜蛋白样品的制备需要充分考虑到与下游的胶分析及质谱分析等应用配套，因此膜蛋白样本制备成为一个难以逾越的挑战。
贝博植物线粒体膜蛋白提取试剂盒用简便快速的方法可以从各种植物样本中提取线粒体膜蛋白，提取过程简单方便，可在一小时内提取得到高质量的线粒体膜蛋白。
该试剂盒含有蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高质量的蛋白提供了保证。
该试剂盒提取的膜蛋白具有天然活性，提取的蛋白可用于Western Blotting、免疫共沉淀、酶活性测定等各种下游蛋白研究实验。
使用方法：1.取新鲜植物样本叶片，洗净擦干后去除叶梗和粗脉。
2.取洗净擦干后并去除叶梗和粗脉的2g植物组织样本剪碎，采用以下一种方法处理：1.加入3ml提取液A后用匀浆机/匀浆器匀浆。
2.置于研钵中用液氮研磨，研磨后加入3ml冷的提取液A 。
3.加入3ml提取液A直接置冰上研磨。
3.将匀浆用250目细胞筛或3层纱布或脱脂棉过滤。
或者在4℃，100×g力条件下离心1分钟，收集上清，弃沉淀。
4.将滤液700g 离心10分钟。
取上清。
5.将上清11000-12000g离心20分钟。
6.弃上清，在沉淀中加入500ul提取液B和2ul蛋白酶抑制剂混合物，充分混匀后在冰上静置1-2小时，中间每隔15-20分钟高速涡旋振荡15秒。
胞浆线粒体蛋白抽提
胞浆线粒体蛋白抽提
试剂：胞浆线粒体分离试剂盒，碧云天，产品编号C3601，负20°冰箱分装保持。
步骤：1.收集细胞，并用冰PBS洗1-2次。
2.预处理：每1⨯ 106个细胞加50μl（这个是最多加50，否则提出的蛋白可能会太稀）线粒体分离剂（临用前在线粒体分离剂中加入100:1的PMSF），轻轻（必须轻，以免损坏线粒体膜）悬浮细胞，冰浴放置10-15min。
3.匀浆：用1ml注射器反复快速抽吸置于1.5mlEP管中的细胞，约10次。
（注：目的是刚好损坏细胞膜，而不损坏线粒体膜，可以取2μl细胞匀浆与5μl台盼蓝于玻片上，混匀后取小半片盖玻片盖住，显微镜观察刚好使大部分细胞台盼蓝染色即可，我的经验是10次的样子）
4.离心，600g，4℃，10min，弃沉淀（此沉淀为细胞核）
5.上清离心，11000g，4℃，10min
6.离心后小心吸出上清即为胞浆。
（每50μl约得到20μl的胞浆2-3μg/μL浓度）
7.沉淀再次离心吸去上清，每1⨯ 106个细胞加入10μl线粒体裂解液（临用前在线粒体裂解液中加入100:1的PMSF）即为线粒体蛋白。
我只做过胞浆细胞色素C检测，由于线粒体蛋白需要细胞量较大，没做线粒体蛋白细胞色素C检测。
WesternBlot概述及步骤
WesternBlot概述及步骤W estern Blot概述及步骤Western Blot概述及步骤Western Blot（WB）是通过聚丙烯酰胺电泳根据分⼦量⼤⼩分离蛋⽩后转移到杂交膜上，然后通过⼀抗/⼆抗复合物对靶蛋⽩进⾏特异性检测的⽅法。
WB进⾏蛋⽩质分析最流⾏和作成熟的技术之⼀，超过60% 的⽣命科学⼯作者使⽤该⽅法。
根据凝胶电泳的类型，WB可分为：*还原（变性）WB：最常⽤的⼀类，使⽤SDS-PAGE电泳。
主要是来检测蛋⽩质的特性、存在与否、蛋⽩质的同源性以及估计蛋⽩质的分⼦量等*⾮还原（⾮变性）WB：主要⽤来分析蛋⽩质的结构、保持蛋⽩的活性的。
⼀般不使⽤SDS、DTT等变性剂。
成功完成Western Blot检测，必须满⾜4个条件：*凝胶洗脱：转移期间蛋⽩质必须从凝胶中洗脱出来，如果蛋⽩质还截留在凝胶中，将⽆法在膜上进⾏分析* 吸附到膜上：在转移过程中蛋⽩质必须吸附到膜上，如果蛋⽩不吸附，将⽆法在膜上进⾏分析*处理期间仍截留在膜上：在转移后的处理过程中蛋⽩质必须保持吸附在印迹膜上*处理过程中可接近：被吸附的蛋⽩质必须能够与检测试剂接触，如果蛋⽩质被掩盖则⽆法检测成功进⾏WB检测，则设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到WB的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！⼀般需要设置的对照如下：*阳性对照：明确表达检测蛋⽩的组织或细胞，⽤于检测抗体的⼯作效率*阴性对照：明确不表达检测蛋⽩组织或细胞，⽤于检测抗体的特异性*⼆抗对照：不加⼀抗，⽤于检测⼆抗的特异性*内参对照：检测标本的质量和⼆抗系统*空⽩对照：不加⼀抗和⼆抗；⽤于检测膜的性质和封闭的效果Western Blot概述及步骤Western Blot（WB）是通过聚丙烯酰胺电泳根据分⼦量⼤⼩分离蛋⽩后转移到杂交膜上，然后通过⼀抗/⼆抗复合物对靶蛋⽩进⾏特异性检测的⽅法。
WB进⾏蛋⽩质分析最流⾏和作成熟的技术之⼀，超过60% 的⽣命科学⼯作者使⽤该⽅法。
线粒体的提取与纯化
mt DNA的分离及纯化按戴建华等报道的方法，就具体情况稍加改进，步骤如下（除特别说明，均在4℃下完成）：1.1 取新鲜肝组织，放在缓冲液A（0.25M 蔗糖，0.01M Tris·Hcl，0.001M Na2-EDTA，pH8.0）中漂洗2~3次，尽可能去除表面血污、结缔组织及脂肪组织后剪碎。
按组织重﹕缓冲液A=1﹕5~10加入缓冲液A，用玻璃匀浆器冰浴匀浆。
1.2 1000 g•min-1离心15min；取上清液；15000 g•min-1离心20min，弃上清，沉淀用缓冲液B （0.25M 蔗糖，0.05M Tris·Hcl，0.007M Mg Cl2，p H7.5）洗涤，按0.5m L•g-1肝的比例加入缓冲液B 悬浮沉淀后加入DNase I 至终浓度为100 µg•m L-1，30℃下作用30min。
1.3 冰浴冷却，加入2倍体积的DNase I反应终止液（0.25M蔗糖，0.1M Na2-EDTA，pH8.0）。
15000g•min-1离心20min。
沉淀用DNaseI反应终止液洗涤一次，重复离心。
1.4 按0.5 m L•g-1肝加入缓冲液C（0.1M Nacl，0.05M Tris·Hcl，0.01M Na2-EDTA，p H8.5）悬浮沉淀，加入SDS至终浓度为1%~1.5%，吸打混匀后37℃保温15min。
1.5 用等体积的苯酚，苯酚/氯仿（1:1），氯仿/异戊醇（24:1）各抽提一次。
取水相，加0.2 倍体积1M Na Ac和2倍体积的预冷无水乙醇，混匀后放在4℃冰箱中过夜。
1.6 15000g•min-1离心30min后去上清；沉淀用70%乙醇洗涤2次，干燥，TE（0.01M Tris·Hcl，0.001M Na2-EDTA，pH8.0）溶解。
1.7 加入预处理的RNase I 至终浓度为50µg•m L-1，37℃保温1h。
植物线粒体蛋白提取方法
产品组成：
产品组成 规格
线粒体提取液 A 线粒体蛋白提取液 B 蛋白酶抑制剂混合物
BB-3172-1 50T 200ml 20ml 100ul
BB-3172-2 100T 400ml 40ml 200ul
储存条件：： ● 本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。 ● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管 底，避免开盖时试剂损失。 ● 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。 ● 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清 洗并彻底清除残留清洁剂。 ● 避免皮肤或粘膜与试剂接触。
ii.置于研钵中用液氮研磨，研磨后加入 3ml 冷的提取液 。 iii.加入 3ml 提取液直接置冰上研磨。 2. 将匀浆用 250 目细胞筛或 3 层纱布或脱脂棉过滤。或者在 4℃，100×g 力条件 下离心 1 分钟，收集上清，弃沉淀。 3. 将滤液 700g 离心 10 分钟，取上清。 4. 将上清 11000g 离心 20 分钟。 5. 弃上清，留沉淀。 6. 每 200ul 蛋白提取液 B 中加入 1ul 蛋白酶抑制剂混合物混匀。用 200-400ul 蛋 白提取液 B 重悬沉淀，在 4℃条件下振荡 20 分钟，至无明显沉淀。 7. 在 4℃，14000g 条件下离心 15 分钟。 8. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到线粒体蛋白。 9. 将上述蛋白提取物定量②后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验③。
试剂盒以外自备试剂和仪器
● 移液器、吸头
● 离心机及离心管
● 涡旋振荡器
● 冰箱，冰盒
使用方法：
使用注意事项： 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
线粒体DNA的提取方法
2.线粒体在37℃下裂解4 h后(或60℃下裂解40min)，往裂解液中加 入等体积的酚-氯仿异戊醇，轻轻混匀，静置5 m in。在12 000rpm 4℃下离心 10 min。吸出上清，再用酚 - 氯仿 / 异戊醇抽提，吸取上 清，加入?RNase,在37℃下保温30m in后,加入酚-氯仿/异戊醇抽提， 吸出上清，再用氯仿 /异戊醇抽提。吸出上清 ,加入1/10 体积的乙 酸钠和两倍体积的异丙醇，置- 20 ℃ 2 h 或过夜。 2. The material were lysed in 2% SDS, constantly shaking the mixture. If the tissue coalesces, warm the tubes in a 60℃water bath for 40 min (or in a 37℃water bath for 4h) until the organelles are fully lysed. Shake the mixture intensively for 10min with an equal volume of equilibrated phenol. Centrifuge for 10min at 12,000 rpm. Remove the upper aqueous phase. The RNase treatment was done at 37℃ for 30minutes. Then add phenol∶chloroform∶isoamyl alcohol （ 25∶24∶1 ） . Repeat the procedure. Add chloroform∶isoamyl alcohol （24∶1）. Repeat the procedure. Precipitate the DNA with 1/10 vol of 3M NaAC and 2 vol of isopropanol at -20℃ for 2-3h or overnight.
线粒体蛋白提取
线粒体蛋白提取1.线粒体蛋白抽取液配方(pH7.4)：250mM蔗糖，20mM HEPES，10mM KCl,1.5mM MgCl2,1mM EDTA,1mM EGTA,1mM DTT, 17ug/mL PMSF, 8ug/mL aprotinin, 2ug/mL leupeptin；-20℃保存。
2.步骤：（1）收集5X10E7细胞，并用PBS洗细胞；（2）往细胞沉淀加入2mL上述抽取液，并混匀，可以采用超声或匀浆器方法破膜，程度至苔盼兰染色约90%的细胞为蓝色。
（3）750g，4℃离心5分钟，收集上清，此时沉淀即为细胞膜成分。
（4）13000rpm,4℃离心30分钟, 弃上清，此时沉淀即为线粒体成分。
（5）用100uL列解液重悬沉淀，-80℃保存备用.培养悬浮细胞全蛋白裂解的方法1.细胞裂解液（pH8.0）的配方：20mM Tris-Cl，1% NP-40, 137mM NaCl, 20mM DTT,2mM Sodium Vanadate，1ug/mL Aprotinin, 1ug/mL leupetin, 1mM PMSF；配好后分装-20℃保存，其中PMSF和蛋白酶抑制剂量使用时现加。
2.裂解方法：按1X106细胞/100uL的比例加细胞裂解液,混匀后冰浴30分钟, 12,000rpm, 4℃,离心10min, 实验时取25uL的上清加5uL 6X上样缓冲液煮沸5分钟使蛋白变性后，12000rpm离心5分钟，取上清和预染Marker加样电泳。
或-80℃保存备用。
细胞核蛋白质的提取2009-04-28 21:28一、试剂准备缓冲液A 缓冲液B10mmol/L HEPES-KOH pH7.9 20mmol/L HEPES-KOH pH7.91.5mmol/L MgCL2 1.5mmol/L MgCL210mmol/L KCL 420mmol/L NaCL0.5mmol/L DTT 0.2mmol/L EDTA0.2mmol/L PMSF 25% Glycerol0.5mmol/L DTT0.2mmol/L PMSF二、操作步骤1．去细胞培养液，用PBS（含0.05mmol/LPMSF）洗两次，用刮板将细胞刮下，计数细胞，收集于适当体积离心管，用少量PBS冲洗平皿一并吸入离心管。
线粒体分离试方法
线粒体分离试方法线粒体的分离实验方法有多种，以下是其中两种常见的方法：方法一：1.取苗约5克，加三倍体积0.25 mol/L蔗糖-提取缓冲液，在预冷的研钵内快速研磨成匀浆。
2.8层纱布过滤，滤液经3000 g 4℃离心10 min，去除杂质。
3.上清液再用10000 g 4℃离心10 min，沉淀为线粒体。
4.沉淀用2ml 0.25 mol/L蔗糖-提取缓冲液重悬，同上离心一次，弃上清。
5.线粒体沉淀保存用0.3 M甘露醇重新悬浮。
6.吸滴线粒体重悬液于载波片上，再加滴詹纳斯绿染色液，室温下静置染色15 min，用显微镜观察，线粒体呈蓝绿色，小棒状或哑铃状。
方法二：1.将过夜酵母培养物无菌转移到两个15ml离心管中。
2.在4℃下以500g离心10分钟。
3.小心去除上清液，不要干扰沉淀。
4.使用微量移液器在1ml氯化钠（0.9%）中小心冲洗沉淀。
5.使用微量移液器丢弃离心管中的氯化钠。
6.将沉淀重悬于1ml冰冷的裂解缓冲液中，并使用微量移液器充分混合。
7.在4℃的摇床上孵育10分钟。
8.在4℃下以1000g离心10分钟，小心去除上清液。
9.将细胞沉淀重悬于1.5ml冰冷的破碎缓冲液中，并使用针头的钝端完成细胞破碎。
10.将裂解物在4℃下以1000g离心10分钟。
11.将上清液转移到新鲜的15mL管中，并混合从步骤7中获得的上清液。
12.在4℃下以6000g离心10分钟并弃去上清液。
13.用线粒体储存缓冲液清洗颗粒。
14.在4℃下以6000g离心20分钟。
这两种方法的主要步骤包括细胞或组织的匀浆、离心、去除杂质和线粒体的沉淀及重悬等。
在实际操作时，可以根据实验的具体需求和条件选择合适的方法，并严格按照步骤进行操作，以获得高质量的线粒体样本。
提取线粒体的原理和方法
提取线粒体的原理和方法
嘿，朋友们！今天咱来聊聊提取线粒体的那些事儿。
线粒体啊，就像是细胞里的小“发电站”，给细胞提供着能量呢！那怎么把这些小家伙给弄出来呢？
其实啊，就跟咱在一堆杂物里找宝贝差不多。
咱得先把细胞给破开，这就好比打开一个装满各种东西的大箱子。
然后呢，通过一些巧妙的办法，把线粒体从其他乱七八糟的东西里分离出来。
你想想，细胞就像一个大杂烩，里面啥都有，线粒体只是其中小小的一部分。
咱得想办法让线粒体“脱颖而出”呀！这可不容易，但也不是没办法。
比如说，可以利用线粒体和其他成分的一些不同特性。
就好像不同的东西在水里的沉浮不一样，咱就可以根据这个来把线粒体给“捞”出来。
或者用一些特殊的化学试剂，让线粒体乖乖地聚集到一起，这不就好抓它们了嘛！这就好像用一块磁铁去吸引一堆铁钉里的特定几个铁钉一样。
哎呀，这过程可得细心再细心，就跟咱挑珍珠似的，不能马虎。
要是不小心，可能就把线粒体给弄丢了或者弄不纯啦。
提取线粒体可不只是在实验室里玩玩哦，这可是有大用处的呢！咱可
以通过研究线粒体，了解细胞是怎么工作的，就像了解一个机器的内部构造一样。
这对很多疾病的研究和治疗都很重要呢！
比如说，有些疾病可能就是线粒体出了问题。
那咱要是能把线粒体研究透了，不就能更好地找到治疗的办法了嘛！
所以啊，提取线粒体虽然有点麻烦，但真的很有意义呢！这就像是打开了一扇通往细胞奥秘的大门，让我们能看到更多神奇的东西。
总之呢，提取线粒体就像是一场有趣的探索之旅，虽然会遇到一些小困难，但只要咱有耐心、有技巧，就一定能成功把这些小“发电站”给揪出来！大家加油哦！。
线粒体提取
二.植物线粒体的制备 1.原理
ATP
2.制备方法 差速分离法
用500-2000×g短时间(约10min)离心 以去除沉淀的细胞碎片 等固体物质保留上清液
将上清液在11 000—20 000×g 下离心，以沉淀线粒体。
沉淀线粒体
3.材料 本次使用绿豆芽。植物的各个部分都可用
来制备线粒体，但应该避免那些组织坚实、细 胞壁老化及含叶绿体的材料。最好采用黄化幼 苗或贮藏组织。用作制备线粒体的材料应该是 新鲜、生长势旺盛。
介质中，常含有： ① 0.25-0.4mol/L蔗糖或甘露醇，使与细胞溶液成等渗的； ② 50mmol/L的pH7-8缓冲液（通常用tris),以中和酸性的
细胞内含物； ③ 巯基化合物如10mmol/L的二硫苏糖醇或巯基乙醇，以
减少在活性中心具有半胱氨酸残基的酶因氧化而失活； ④10mmol/L浓度Mg2+,以阻止细胞质和细胞器中核蛋白体
（2）线粒体悬浮液蛋白含量测定 取两支试管，准确加入0.1ml线粒体悬浮液，0.9ml蒸 馏 水 ， 5ml 考 马 斯 亮 蓝 G-250 ， 摇 匀 ， 放 2min ， 于 595nm下比色。
（3）结果计算 根据所测吸光度，在标准曲线上查相应的蛋白质含 量，即为0.1ml线粒体悬浮液中蛋白质g数，再转变为 mg数即可。
0-4℃（2—4 ℃）以减少 自溶变化。这些变化是由 于把正常区隔开来的酶和 底物混合到一起的结果。
匀浆液用4层纱布过滤
残渣 弃 （部分未破碎的组分）
上清液 12000g 离心15min
上清液 弃
加3ml悬浮液，悬浮线粒体
滤液 3000g 离心10min
沉淀 弃
（细胞碎片、细胞核等） 沉淀 留 （线粒体）
把线粒体的蛋白也提取出来
把线粒体的蛋白也提取出来果子导读这篇帖子本来应该是大年初一发的的，但是我给忘记了。
今天补上。
看到豆子今天的帖子和感想，能有这样优秀的伙伴在身边是一种幸运。
提蛋白只是一个简单的操作，但是豆子老师连讲了5期，这只是她技能的一个小点，还有一大批帖子等着我们，这一年，有高师姐和豆子老师在，我自己很期待。
本来还想讲几句，但是此刻心里翻江倒海，五味杂陈，不知道如何开口。
医院前门的包子铺没有开，导致我几天没有吃早饭，后门没有什么餐馆开门，中午就像游魂一样找吃的，昨天开始消毒细胞培养箱，整个过程需要两天。
过年会给连续的工作带来打击，工作的停顿从放假前3天就开始，一直持续到放假后3天，加起来都要两周，而那种因为放假而停下来的热情，不知道要什么时候才能完全恢复，老家还有一句话，正月里面都是年。
以下是今天豆子老师的正文：最近看了很多场的团拜会的表演，觉得好像有种说不出的感觉，但恍惚中星星点点仿佛照亮了什么，自己好像是舞蹈队的队长，一场下来有时候会表演四五个节目，自己好像爱好唱歌，音乐老师都说挺好的（可能只是鼓励，反正我把他当真了），自己能吹竖笛还是满分，鼓乐队的都特别想要我，但是还是被舞蹈队打败了，O(∩_∩)O~，自己仿佛朗诵的也不错，脱稿演讲也有那么多次，自己或许文章写的还可以，还上过报纸。
原来竟是勾起了自己尘封多年的记忆。
我们有不同的自己，可以高山流水，阳春白雪，可以喜欢李煜潜来珠帘动，惊觉银屏梦，可以有长江东去浪淘尽的魄力，可以有润物细无声的温柔，有惟吾德馨的高雅，平平凡凡也是不错。
不管做何种选择，自己一定是舒服的开心的就好，所以我看到很多人说好像自己忘记了很多东西，我觉得其实并不是忘记了，只是没有一个契机让自己想起来，你的记忆就放在那里等你去取，但是放在哪里却需要自己去找。
今天讲讲线粒体蛋白的提取线粒体的重要性我想大家肯定都知道，线粒体主要是提供细胞内各种物质代谢所需要的能量。
能量是我们进行一切事情的前提条件，想要研究线粒体的功能以及物理化学性质，提取线粒体必不可少，线粒体大量存在于代谢旺盛的细胞中，如动物的心肌，脑，肝，肾等器官和组织的细胞中，今天也是照旧提到几种方法。
线粒体提取步骤
线粒体提取步骤线粒体的提取步骤制备程序：a.组织匀浆：称取50-200 mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS冲洗，用剪刀剪为0.5cm2碎块放入小容量玻璃匀浆器内。
估计组织块总体积。
加入1.5 ml冰预冷的Mito Sdution。
上下研磨组织20次。
b. 培养细胞匀浆：消化细胞，PBS洗涤，800 × g 5~10 min离心收集细胞。
计数。
每次提取需要2-5 × 107个细胞。
加入1.5 ml冰预冷的Mito Sdution重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内。
用间隙严密的研杵研磨细胞30-40次。
1. 将组织或细胞匀浆物转移到离心管。
800 × g 离心 5 min 4 ºC。
细胞核、大的膜碎片、未裂解细胞等在管底,弃去。
2. 收集上清液并转移到新的离心管。
800 × g 离心5 min at 4 ºC。
弃沉淀3. 将上清液转移到新的离心管。
10,000 × g 离心10 min 4 ºC。
离心后的上清含胞浆成分，将上清转移到新离心管，可收集用于对照实验。
线粒体沉淀在管底。
4. 洗涤线粒体：清除管内壁粘连的液体和碎片，加入0.2 ml Mito Sdution轻弹管底重悬线粒体沉淀，12,000 × g 离心10 min 4 ºC。
弃上清，线粒体沉淀在管底。
5. 用Mito Sdution或合适后续实验的自备缓冲液重悬线粒体沉淀50 µl/每100 mg组织或100 µl/5 × 107个细胞。
测定蛋白浓度。
立即使用或−70 ºC保存。
注意：1. 为保证获得完整的线粒体，第一是全程低温操作，将样品管放在冰水浴而不是碎冰块中。
第二是快速。
微量制备比大规模制备操作更方便和快速，因而更容易获得完整的线粒体。
第三，在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞是制备线粒体的最关键环节。
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有效期： 一年。
产品简介： 贝博线粒体蛋白提取试剂盒提供全套试剂，适用于从各种原代或传代细胞和各种实体
组织，如脑、脊髓、神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道、肾脏、心脏、肌肉、血管、结缔 组织等哺乳动物组织中提取线粒体蛋白。提取过程简单方便。制备的线粒体蛋白不仅纯度 高，保持天然活性，而且绝少交叉污染。提取的蛋白可用于 Western Blotting、转录活性分析、 Gel shift 凝胶阻滞实验、免疫共沉淀、酶活性测定等蛋白研究。
产品号 BB-3108 BB-3103 BB-3401 BB-3721 BB-3151 BB-3124 BB-3152 BB-3301 BB-3311 BB-3703
线粒体蛋白提取试剂盒
产品组成：
产品组成 规格
线粒体试剂 A 线粒体试剂 B 蛋白裂解液 蛋白酶抑制剂混合物
BB-3171-1 50T 10ml 10ml 5ml 100ul
BB-3171-2 100T 20ml 20ml 10ml 200ul
储存条件： 线粒体试剂 AB 于 2-8℃保存，长期存放于-20℃保存； 蛋白裂解液室温保存； 蛋白酶抑制剂-20℃保存。
每隔 5 分钟高速涡旋振荡 15 秒。 11. 即得线粒体蛋白。 12. 将上述蛋白提取物定量②后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验③。
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产品号 BB-3101 BB-3102 BB-3411 BB-3501 BB-3121 BB-3122 BB-3123 BB-3125 BB-3105 BB-3702
产品 磷酸化蛋白富集试剂盒 膜蛋白提取试剂盒 BCA 蛋白定量试剂盒 蛋白 Marker 细菌膜蛋白提取试剂盒 植物总蛋白提取试剂盒 植物膜蛋白提取试剂盒 蛋白酶抑制剂混合物 磷酸酶抑制剂混合物 SDS-PAGE 上样 Buffer
本试剂盒提取的蛋白不可用于 2D 电泳。如下游实验需要用于 2D 电泳，请使用货号 BB-3191 107 个细胞①，在 4℃，500×g 条件下离心 2-3 分钟，小心吸取培养基， 尽可能吸干，收集细胞。
2. 用冷 PBS 洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。 3. 加入 200μl 冷的试剂 A，置冰上 10 分钟。 4. Dounce 匀浆器匀浆 30-40 下，然后在 4℃，500×g 条件下离心 5 分钟。 5. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管。 6. 在 4℃，11000×g 以上条件下离心 20 分钟。 7. 在沉淀中加入 200μl 冷的试剂 B，混匀。 8. 在 4℃，11000×g 以上条件下离心 20 分钟。。 9. 弃上清。 10. 在沉淀中加入 80ul-150ul 裂解液和 1-2ul 蛋白酶抑制剂混合物，置冰上 20 分钟，