酵母人工染色体

细胞工程酵母人工染色体

一、酵母人工染色体（YAC）的基本元件

酵母染色体DNA自主复制序列（ARS）

酵母染色体的着丝粒序列（CEN）

酵母染色体的端粒序列（TEL）

选择标记：用于重组克隆的筛选

如：pYAC4是一个大肠杆菌穿梭质粒，含有Amp大肠杆菌筛选标记。

二、YAC克隆系统的特点

YAC作为可提供大片段DNA的方法，简化了构建染色体延伸区域图谱和分离完整基因的过程（200～500kb，甚至1000kb）。

用酵母为宿主重新构建大的人类基因区段，可将小的重叠的YAC 变成一个大的YAC。

酵母作为一种真核生物，为其它真核的DNA提供了更合适的环境。

三、YAC的构建

酵母人工染色体的构建程序

完整的染色体DNA的提取

基因组DNA酶切大片段的获取

✓用于脉冲电泳（PFGE）的高分子量标记的制备

✓目的DNA的酶切最适条件（控制内切酶量实现）

✓最适DNA大片段回收

YAC载体臂的制备

YAC臂与目的DNA大片段的连接

YAC重组体对酵母的转化

YAC基因库的保存

YAC基因库的鉴定

随机挑取100个YAC转化子，制备完整DNA，脉冲电泳分离，Southern转移，标记探针，预杂交。

目的基因YAC克隆的筛选

PCR法对YAC克隆进行筛选，菌落原位杂交作为辅助手段进行筛选

目的基因YAC克隆的鉴定

用目的基因的序列、pBR322和PCR产物微探针进行杂交鉴定

四、YAC的主要用途

◆YAC克隆重叠群是物理图谱的主要框架。

◆用YAC克隆构建的物理图谱在复杂的生物基因组分析和

DNA测序中发挥着重要作用。

◆在基因功能研究中，基因嵌入及转基因技术都可采用YAC

克隆系统。

五、YAC的缺点

◆插入片段大，稳定性较差，不易操作；

◆插入的大片段常发生缺失，使文库不完整；

◆YAC与酵母天然染色体分子结构相似，分离时难与天然染色体

分开；

◆文库中的嵌合现象严重；

◆因插入片段大，往往发生序列重排，造成序列错乱。

思考题

1. 酵母人工染色体有什么作用？

2. 酵母人工染色体的构建程序是什么？

3. 酵母人工染色体有什么优缺点？