好氧反硝化菌的化学_物理法诱变育种研究

20min 并 以 200mL 的 装 液 量 分 装 至 规 格 相 同 的
250mL 锥形瓶中的 DM 培养基中。为保证瓶中空气与
外界气体的交换，以封口膜封口。在 30℃下、气浴恒温
摇床上进行摇瓶培养。每隔 24h，用装有 0.2μm 混合
纤维膜的针式过滤器过滤抽取 5mL 液体样品，测定
其 NO2--N 和 NO3--N 浓度。因整个过程中 NH4+-N 和 TKN 浓度未检出，因而以 TIN 和 NO3--N 去除率来评
DES 浓度 1.8%（V/V） 时两个时间段的致死率由 明显变化，可通过延长诱变时间提高致死率，绘制较 好的致死曲线。
DES 浓度(V/V) 0.6 1 1.5 1.8 2.5
LI Yong-zhi1， WANG Ping2*， LIAO Xiao-hong3， DIAO Hui-fang4
（1.School of Chemical and Environmental Engineering，Beijing Technology and Business University，Beijing 100037，China；2.Beijing Representative Office，American Hach Company，Beijing 100004，China）
照射前先预热）照射，诱变时间取 10s、20s、40s、50s 和
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第 33 卷
70s ； 确 定 最 佳 诱 变 时 间 后 在 最 佳 诱 变 时 间 下 诱 变 处理。
2 结果与讨论
2.1 菌株化学诱变 2.1.1 最佳诱变浓度的选择
4 个浓度的 DES 诱变结果做比较，菌落计数见表
1。通过对表 1 内数据进行比较，选择 DES 浓度 1.8% （V/V）为最佳诱变浓度，其原因是：DES 浓度为 0.6%、 1.5%、1%时，2 个时间段的致死率变化不大且致死率 不高，且浓度为 2.5%（V/V）其致死率不升反降。
胞计数，算出致死率，绘制致死曲线，根据致死曲线确
定致死率为 70%~80%为最佳诱变剂量[6]。
致死率＝
对照每毫升活菌数－处理变后菌株的筛选
使用 BTB 培养基进行划线，用于好氧反硝化菌
的筛选，在 30℃恒温培养箱培养 48h，用接种环在
BTB 培养基平板的最后一个区域挑单一菌落，再次在
摘 要：以实验室 SBR 反应器分离出的好氧反硝化菌（WXZ-17）为原始菌株，以硫酸二乙酯（DES）为诱变剂进行化学诱变。通过反硝化 性能测定筛选较好的正突变体 1 号，其 NO3--N 还原率比原始菌株 WXZ-17 高 20.33%，做为物理诱变的出发菌株以紫外线为诱变剂进行物 理诱变，优选出的 1~6 号的 NO3--N 还原率达到 56.11%，比原始菌株 WXZ-17 号的 NO3--N 还原率高 24.4%，且 NO2--N 基本没有积累。通过 化学—物理相结合的复合诱变法，成功有效地改良了 WXZ-17 号菌株。
在确定了最佳诱变浓度后，在此浓度下确定最佳
诱变时间。选取诱变浓度 1.8%，放入恒温摇床振荡，振
荡处理时间为 20min、40min、80min、120min 和 150min。
到处理时间后，立即加入 10mL 的 25%硫代硫酸钠终
止反应。
1.6 计算致死率、绘制致死曲线
将培养 24h 后的平板取出，用菌落计数器进行细
NO2--N：采用 N-（1-萘基）-乙二胺光度法； NO3--N：采用紫外分光光度法； 菌体生长吸光度（OD600）：采用吸光度法，用 721 可见分光光度计在光密度为 600nm 处测吸光度值； COD：采用美国 HACH 快速测定仪； pH 值：采用 9157BN 型 Thermo Orion pH 计。 1.4 菌株预处理 1.4.1 菌株斜面的活化 从冰箱取出一支纯化后的 WXZ-17 号菌株斜 面，接种到新鲜灭菌的营养琼脂斜面培养基上，置 30℃恒温培养箱培养 24h 进行活化。 1.4.2 菌悬液的制备 将锥形瓶中加入生理盐水灭菌，将灭菌后的生理 盐水混合液注入经活化的菌种斜面，用接种环把菌种 刮取下，再倒回玻珠瓶，反复二次后，塞好棉塞，放入 恒温摇床，振荡培养 60min，将振荡后的孢子悬液经 过无菌二层镜头纸漏斗过滤，得到菌悬液。 1.5 对好氧反硝化菌进行化学诱变 1.5.1 最佳诱变浓度的选择 根据 DES 的理化性质，配制 0.6%、1%、1.5%和
1.8%（V/V）四个不同浓度的 DES 溶液体系，分别诱变
30min、40min，到处理时间后，立即加入 10mL 的 25%
硫代硫酸钠中止反应，稀释涂布，每个时间稀释三个
浓度，分别为 10-5、10-6 和 10-7。每个稀释浓度做 3 个
平行。诱变后计数，选择最佳诱变浓度。
1.5.2 最佳诱变时间的选择
Abstract：Selecting aerobic denitrification strain （WXZ -17） isolated from SBR reactor in the laboratory as the original strain，chemical mutation was done with DES as mutagen. Screening the best mutant No. 1 as the original strain of physical mutation through measured denitrification ability of mutants，its reduction rate of NO3--N was 20.33% higher than the original strain. Mutating with UV as mutagen，the reduction rate of NO3--N of the strain No. 1～6 selected was 24.4% higher than the original strain WXZ -17 with NO2 --N accumulation. Aerobic denitrification ability of WXZ -17 was effectively improved through chemi-physical mutation. Key words：aerobic denitrifiers；chemical mutation；UV-ray mutation
（2）反 硝 化 培 养 基（DM）（/L）：KNO3 0.722g； KH2PO4 1g；MgSO4·7H2O 1g；碳源 （柠檬酸三钠） 3.06g。
（3）LB 琼脂营养培养基（/L）：NaCl 10g；琼脂粉 20g；蛋白胨 10g；酵母浸粉 5g。
（4）BTB 琼 脂 营 养 培 养 基（/L）：KNO3 1.0g； KH2PO4 1.0g；FeCl2·6H2O 0.5g；CaCl2·2H2O 0.2g； MgSO4·7H2O1.0g；琥珀酸钠 8.5g；溴百里酚蓝（BTB） 1mL（取 0.1g 溴百里酚蓝溶于 10mL 酒精）。 1.3 分析方法[5]
第3期
李永智，等 好氧反硝化菌的化学- 物理法诱变育种研究
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响，提高其酶活性，使好氧反硝化进行得更彻底。先进 行化学诱变，筛选出反硝化性能较好的菌株，在化学诱 变的基础上再进行物理诱变，用化学诱变与物理诱变 相结合的方式筛选出更优越、适应性更好的好氧反硝 化菌。也为今后的诱变育种研究提供微生物学依据。
1 材料与方法
1.1 菌源 WXZ-17 号菌株，经 PCR 扩增、16S rDNA 测序
结合同源性分析鉴别为睾丸酮丛毛单胞菌 （实验室 SBR 反应器中分离菌株） 1.2 培养基
（1）液 体 培 养 基（LB）（/L）：KNO3 1.0g；KH2PO4 1.0g；FeCl2·6H2O 0.5g；CaCl2·7H2O 0.2g；MgSO4· 7H2O 1.0g；碳源（柠檬酸三钠）6.2g。
本论文旨在对本实验室筛选出的好氧反硝化菌 采用复合诱变达到优化育种的目的，通过化学、物理 诱变剂对原始菌株的硝酸还原酶、亚硝酸还原酶的影
收稿日期：2008-11-13；修回 2008－02－12 基金项目：国家“十一五”科技支撑计划课题（2007BAK36B07） 作者简介：李永智（1983- ），男，硕士，主要从事废水生物脱氮方面的研究，（手机）13811393769（电子信箱）lyz831023@；* 通讯作者，女， 教授，主要从事水处理研究，（电话）010-68984481（电子信箱）wangp@。
BTB 培养基进行划线，筛选得到纯菌株，然后接种到
斜面培养基在 30℃条件下的生化培养箱中培养 24h
后在 0~4℃条件下储存。
1.8 好氧反硝化性能测定
将菌株接种到经灭菌的 LB 培养基中，30℃下、气
浴恒温摇床上以 160r/min 进行液体培养，过夜培养
15h 左右，再以 5%的接种量接种到经 0.1MPa 下灭菌
第 33 卷 第 3 期 2010 年 3 月
Environmental Science & Technology
VMola. r3.3第 N3230o1.卷30
好氧反硝化菌的化学 - 物理法诱变育种研究
李永智 1， 汪苹 2*， 廖小红 3， 刁惠芳 4
（1.北京工商大学化学与环境工程学院，北京 100037； 2.美国哈希公司北京代表处，北京 100004）
价菌株的好氧反硝化性能。
1.9 对筛选得到的菌株进行物理诱变
1.9.1 诱变对象
经化学诱变后，选取部分突变体进行反硝化性能
测试，筛选出反硝化性能较好的正突变体作为紫外线
诱变出发菌株。
1.9.2 紫外线处理
将 10mL 菌悬液放入玻璃双重皿中，内放无菌转
子。在磁力搅拌器下用紫外灯（30W，照射距离 20cm，