医学类医学免疫学创新性实验伤寒沙门菌多克隆抗体的制备
多克隆抗体的制备方法与原理
抗体的制备方法与原理一、抗血清的制备有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。
（一）用于免疫的动物作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。
若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。
（二）免疫途径免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。
途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
（三）佐剂由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。
佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg 卡介苗就成为完全佐剂。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。
免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。
多克隆抗体的制备
50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出血清球蛋白； 8%～12%PEG6000可沉淀IgG。
超滤法： 利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小的抗原 物质进行滤筛。
电泳
层析法： 凝胶过滤层析 离子交换层析 亲和层析 疏水层析 反相层析
精分离
蛋白鉴定
抗体亲合常数测定
亲合常数测定采用非竞争酶免疫试验法：
先确定在某一抗原浓度时抗体可以达到饱和；
以该抗原浓度为实验条件，饱和时的OD值作为OD-100， 找出OD-50时的抗体浓度和相应的抗原浓度；
根据公式Ka= n-1
计算抗体的Ka值。
2(n[Ab’]t-[Ab ]t)
t代表测定时的温度； n=[Ab]t/[Ab’]t； [Ab]t 表示抗原浓度较高的Amax的一半； [Ab’]t表示抗原浓度较低的Amax的一半。
免疫原的制备
免疫原（immunogen）： 指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞 的抗原最重要的性质是免疫原性（immunogenicity）.
免疫原种类： 天然抗原、人工合成抗原； 蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原。
细胞性抗原制备： 绵羊红细胞（SRBC）- 溶血素； 细菌- 抗菌抗体（动物免疫血清）。
白等，其中以牛血清白蛋白最为常用。
（2）多肽类聚合物：是由人工合成的多肽聚合物，也是一类良 好的载体，常用的有多聚赖氨酸。
（3）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纤维素 (CMC)等皆可与半抗原结合，加入福氏完全佐剂可诱导动物 产生良好的抗体。
连接方法：
物理法：是用物理吸附法将载体与半抗原连接，其原 理是通过电荷和微孔来吸半抗原，吸附载体主要有 PVP和CMC等；
免疫学实验 实验一多抗制备
a.根据抗原性不同，分为完全抗原和不完全抗原。 b.根据化学性质分为蛋白质抗原、类脂抗原、多糖抗 原和核酸抗原。
c.根据物理性状分为颗粒性抗原和可溶性抗原。常见 的颗粒性抗原主要是细菌或动物细胞。
B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体。
• 多克隆抗体：由多种抗原决定簇刺激机体，相应地
就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂 在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多 原的制备与纯化 • 动物免疫 • 血清分离纯化与鉴定
1.抗原的制备与纯化
• 抗原：是一类能够诱导机体免疫应答并能与相应抗体 或T细胞受体发生特异反应的物质。具有免疫原性和 免疫反应性。
接种 37℃ 18-24h
洗下菌苔
（用含0.5%苯 酚的NS）
100℃ 45min
离心
4000rpm,10min
得到原液
稀释
109/ml应用液
2、免疫方法：
选择体重2-3kg的健康家兔，将已经稀 释好的抗原按下列剂量及程序做皮内或 静脉注射。第一天注射1ml，第8天注射 1ml，第15天注射2ml，末次注射后7天 颈动脉放血，测效价。
NS稀释至 2～5%
绵羊红细胞的制备流程图
摇动 1520min
周可
4℃
保
存
3
NS洗涤3 次 2000r/mi n
10min
取适量
100℃水浴 45min杀菌
无菌试验
液体培养或 斜面培养 37℃24h
细菌细胞抗原的制备流程图 O菌体抗原
返回
2.动物的选择
• 动物的选择常根据抗体的用途和量来决定，也 与抗原的性质有关。
多克隆抗体制备和关键技术点
多克隆抗体制备方法和关键技术点抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原刺激所产生的抗体称之为单克隆抗体（MonoclonalAntibody）。
由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一种抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类抗体。
抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。
抗原上那部分可以引起机体产生抗体的分子结构，叫做抗原决定簇。
一个抗原上可以有好几个不同的抗原决定簇，因而使机体产生好几种不同的抗体，最终产生出抗体是浆细胞。
只针对一个抗原决定簇起作用的浆细胞群就是一个纯系，纯系的英文为Clone，音译就是克隆。
由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。
单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。
另一方面，即使是同一种抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。
抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（Monoclone antibody）。
由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类抗体。
多克隆抗体是由异源抗原（大分子抗原、半抗原偶联物）刺激机体产生免疫反应，有机体浆细胞分泌的一组免疫球蛋白。
多克隆抗体由于其可识别多个抗原表位、可引起沉淀反应，制备时间短，成本低的原因广泛应用于研究和诊断方面。
多克隆抗体的制备
免疫方法
选定动物后，在免疫过程中应考虑免疫剂量、免疫途径、 免疫次数、免疫间隔等因素。
免疫原的剂量：免疫原的接种剂量按免疫原性的强弱、动 物的个体状态和免疫时间来确定。首次免疫时，剂量不宜 过大，以免产生免疫麻痹。 免疫途径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴 结 等，视不同的免疫方案而异。对于不易获取的宝贵抗原可 采用淋巴结免疫法。 免疫间隔时间是影响抗体产生的重要因素，其中首次与第二 次免疫的间隔时间尤为重要，一般以10～20天为佳，二次后 间隔时间一般为7～10天，若间隔时间太长，则刺激减弱， 抗体效价不高。
纯度鉴定： 抗体纯度的鉴定可采用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、 双向扩散试验、免疫电泳等方法。 IgG含有重链和轻链，纯IgG的SDS-PAGE结果应有两条蛋白电泳 带（分子量约53kD和22kD），若出现多条电泳带则表明制备的抗 体混有杂蛋白，需进一步纯化。
结合活性鉴定：测定抗体亲力的方法较多，如平衡透析法、 ELISA或RIA竞争结合试验等。
免疫佐剂
某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，可增 强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应 答类型，此类物质称为免疫佐剂 (immunoadjuvant)，简称佐剂。
佐剂的种类
佐剂一般包括以下几类： 无机佐剂：如氢氧化铝、明钒等；
生物性佐剂：如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日 咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的B亚单位、胞壁酰 二肽和细胞因子等；
增强吞噬细胞的吞噬作用（被佐剂吸附的抗原易被吞噬细 胞吞噬），促进对抗原的处理，刺激淋巴细胞增生，从而增 强和扩大免疫应答的效应。
动物免疫
免疫动物的选择：
抗原来源与动物种属的关系：抗原的来源与免疫动物种属 差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系或 亲缘关系越近，免疫效果越差。
多克隆抗体技术及其制备技术
多克隆抗体技术及其制备技术1.多克隆抗体的概念抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。
抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B 淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（Monclone antibody）。
由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD 等五类抗体。
2.免疫动物供免疫用的动物主要是哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、山羊、马、骡和豚鼠及小鼠等。
动物的选择常根据抗体的用途和量来决定，也与抗原的性质有关。
如要获得大量的抗体，多采用大动物；如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物；如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备抗体；如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制备；一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备。
免疫用的动物最好选择适龄的健康雄性动物，雌性动物特别是妊娠动物用于制备免疫抗体则非常不合适，有时甚至不产生抗体。
由于对免疫应答的个别差异，免疫时应同时选用数只动物进行免疫。
抗原是多种多样的，而且千差万别。
就其化学成分而言，有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。
就抗原性而言，有完全抗原和不完全抗原。
为了获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原，如要制备用于筛选细菌表达的cDNA文库或免疫印迹的抗血清，最好选用可降解的蛋白质抗原。
不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构、物理形状和弥散速度等。
抗原的免疫剂量是依照给予动物的种类、免疫周期以及所要求的抗体特性等不同而不同。
多克隆抗体的制备
第一节抗原的制备除完整的细胞可作为抗原外，各种不同的细胞内存在的各种分子量不同的物质，也都具有全抗原或半抗原的性质，某种抗原物质可能是某一类细胞所特有的，可作为这种细胞的一个标志。
由于细胞存在着许多性质不同的抗原物质，有时要从这众多的物质中提取、纯化某种抗原物质，以供科学研究之用。
一、抗原的提取抗原的制备是一件十分细致的工作，要制备一个高纯度的抗原，需要付出艰巨的努力，制备工作涉及物理学、化学和生理学等许多领域的知识。
根据物理或化学特性建立起来的分离、纯化方法的主要原理不外乎科二个方面：①利用混合物中几个组分分配率的差别将他们分配到可用机械方法分离的两或几个物相中，如盐析、有机溶剂抽提、层析和结晶等；②把混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同的区域而达到分离的目的，如电泳、超速离心和超滤等。
由于组织细胞内存着许多分子结构和理化性质不同的抗原物质，其分离方法也不一样，就是同一类大分子物质，因选材不同，所使用的方法也很大差别。
因此很难有一个通用的标准方法供提取任何生物活性物质使用，所以在提取前必须针对所欲提取的物质，充分查阅文献资料，选用合适的方法。
如果要提取一个结构及性质未知的抗原物质，更需要经过各种方法的比较探索，才能找到一些工作规律和获得预期的效果。
抗原物质的制备，大概要经过如下过程：①材料的选择和预处理；②细胞的粉碎（细胞器的分离）。
③提取；④纯化；⑤浓缩或干燥，保存。
现分别简述如下。
（一）材料的选择及预处理选择什么材料主要根据实验目的而定。
通常选含量高、工艺简便、成本低的材料。
材料选定后，通常要进行预处理，剔除结缔组织、脂肪组织等，把组织块剪碎。
若取材后不立即进行提取，则应冷冻保存，动物组织更要深低温保存。
某些容易失活的物质，一般宜采用新鲜材料。
（二）细胞的粉碎除了提取体液、组织间液内的多肽、蛋白质、酶不需粉碎细胞外，凡要提取组织内、细胞膜上及胞内的生物活性物质，都必须把组织和细胞粉碎，使活性物质充分释放到溶液内。
多克隆抗体的制备ppt课件
多克隆抗体的制备
根据化学基团不同，连接方法主要有以下几类：
带游离氨基或羧基以及二种基团皆有的半抗原：羧基可用混合酸酐 法和碳二亚胺法与载体氨基形成稳定的肽键，带氨基的半抗原则可与 载体羧基缩合。
带有羟基、酮基、醛基的半抗原：不能直接与载体连接，需要用化 学方法如琥珀酸酐法、O-羧甲基、羟胺法等方法将之转变为带有羧基 的
半抗原衍生物后才能与载体连接。
带有酚基的半抗原，可用一氯醋酸钠法或重氮化的对氨基苯甲酸法， 生成带有羧基的半抗原衍生物。
多克隆抗体的制备
谢谢
请提出您的宝贵意见！
多克隆抗体的制备
多克隆抗体的制备及 抗体活性测定
张江中试平台
多克隆抗体的制备
主要内容
• 多克隆抗体制备的基本原理 • 多克隆抗体制备的操作步骤 • 抗体活性的实验原理、操作流程和结果判断
多克隆抗体的制备
原理
1、克隆(clone)： 是指无性繁殖细胞系，由单一个祖先细胞 分裂繁殖而形成的一簇细胞系。在这个家族的所有成员中， 如无发生突变其基因是完全相同的。
选择性沉淀：
选择某抗原理化特性，采用相应沉淀剂或溶液环境， 如：
核酸去除 盐析沉淀法 有机溶剂沉淀法 高分子聚合物沉淀法
多克隆抗体的制备 50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出血清球蛋白；
超滤法： 利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小
的抗原物质进行滤筛。 电泳
多克隆抗体的制备
精分离
层析法： 凝胶过滤层析 离子交换层析 亲和层析 疏水层析 反相层析
改变抗体类型，使产生抗体由IgM型转变为IgG型；
多克隆抗体的制备方法
抗体的制备方法与原理一、抗血清的制备有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。
（一）用于免疫的动物作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。
若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。
（二）免疫途径免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。
途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
（三）佐剂由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。
佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成为完全佐剂。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。
免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。
多克隆抗体的制备
泰实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳【实验目的】⒈ 加深对抗体基本知识的了解。
⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。
⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。
一、多克隆抗体的制备【实验原理】当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。
多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。
将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。
如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。
通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。
首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。
但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。
免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。
三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。
通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。
【实验材料】⒈ 实验动物初次抗原注射后的周次0 1 2 3 4 5 6 7初次免疫 二次免疫血清中抗体的水平成年兔。
⒉实验器材特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。
⒊实验试剂⑴抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。
⑵福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂：【实验方法】⒈抗原的制备抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。
由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。
实验一多克隆抗体的制备（可溶性抗原）
实验一多克隆抗体的制备（可溶性抗原）上海师范大学实验报告专业、年级生物科学班级姓名学号课程名称免疫学实验名称多克隆抗体的制备（可溶性抗原）实验日期基本原理免疫动物是通过给待免疫的动物注射抗原，使其获得相应的抗体的过程。
抗原给予的方法不仅对免疫应答的起始有较大影响，而且决定着对新注射抗原的免疫吞噬和吞噬后加工处理的细胞类型，并影响对其发生免疫应答的外周淋巴器官。
材料(一)动物：健康雄性家兔2只(二)器材：剪刀、镊子、注射器(2ml、50ml)附针头(9号、6号)、称量瓶(10ml)、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶(200ml)、手术器械一套、血管夹、黑丝线、塑料放血管等。
(三)试剂1.灭菌生理盐水；2.纯化人IgG(10mg／ml)；3.消毒酒精及碘酒；4.弗氏不完全佐剂（FCA）5.弗氏完全佐剂（FIA）6.弗氏完全佐剂乳化抗原(FCA-IgG)的制备：吸2ml FCA于研钵中，逐滴加入1mg／ml 纯化人IgG 1 ml，边滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。
7. 弗氏不完全佐剂乳化抗原(FIA-IgG)的制备：吸2ml FIA于研钵中，逐滴加入1mg／ml纯化人IgG 1 ml，边滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。
免疫方法1.用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分毛，以酒精及碘酒消毒皮肤；2.第一次免疫: 用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂(FCA)乳化的抗原(人IgG)下称FCA-IgG)液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。
3.第二次免疫：间隔14天后，于两侧腘窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入FIA-IgG，每个淋巴结注0.1ml，其余注入淋巴结附近皮下共1ml。
如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧腘窝及鼠蹊部皮下。
4.间隔10天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价(即试血)。
效价至少应达到1∶16以上时才能放血。
免疫学实验-多克隆抗体的制备
羊毛脂+液体石蜡+卡介苗 首次免疫用完全佐剂，再次免疫用不完全佐剂。 羊毛脂、液体石蜡：油包水乳液，增加滞留时间。 卡介苗：增强免疫系统敏感性。提升抗原递呈能
力。
9
2018/3/19
多克隆抗体的分离与纯化
抗血清的制备： 取血，离心
亲和层析纯化： ProteinA/G（中性亲和，酸性解离），所有抗体。 抗原亲和纯化，特异抗体。
抗体的产生及功能
抗体的产生： B细胞被激活后分化为浆细胞并分泌抗体。
抗体的免疫学功能： 识别病原菌表面抗原 阻止病原菌侵袭体细胞 介导特异性免疫攻击
3
抗体的科研应用
免疫沉淀 免疫共沉淀 免疫印迹 免疫荧光染色 流式细胞术
2018/3/19
7
抗体的临床应用
检测待测抗原 妊娠检测 血型鉴定 病原菌鉴定
2018/3/19
JLU
免疫学实验-多克隆抗体的制备
吉林大学 生命科学学院 生物实验教学示范中心 王飞 fei@
内容提要
1
抗体的产生及免疫功能
2
抗体的临床及科研应用
3
抗体制备原理
4
ELISA法测定抗体效价
5
实验项目简介
1
2018/3/19
免疫系统概述
Immune system：protect against disease Major target: detect and distinguish pathogens
4.These bind to any antibodies which are attached to antigen. Excess conjµgante is washed away after a period of incubation
多克隆抗体的制备方法
多克隆抗体的制备及效价测定多克隆抗体的制备步骤一、器材剪刀(剪兔毛用)一把、弯头眼科手术镊子(游离血管用)一把、直头眼科手术剪(剪血管用)一把，手术刀架，手术刀片，注射器(1ml、10ml，25ml)附针头，兔子固定架，灭菌三角烧瓶(200ml)或平皿(直径18cm)、弯头止血钳四把，直头止血钳两把，手术缝合线，塑料放血管，纱布等。
二、试剂生理盐水(或PBS)弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant，FCA)弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant，FIA)二甲苯，酒精棉，脱脂棉，2% NaN3三、免疫原：蛋白或KLH偶联的多肽。
每次免疫100-200μg免疫原。
四、兔子的选择兔子的重量应在四斤以上，两耳光滑，明显可见耳静、动脉，健康。
五、免疫用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1:1混合。
抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。
每个区域大约用1/4的免疫原。
这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。
注：抗原注射以前需要收集一些正常血清，已备检测抗体时作为阴性对照。
待兔子在新环境中稳定，大概需要四天左右时间，可以进行耳动脉取血。
取血量约5ml足矣。
免疫用的抗原必须纯化，否则影响抗体的质量。
抗原经FCA或FIA充分乳化后才能注射。
将抗原液与佐剂等比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化，乳化过程比较费时、费力，但若乳化不充分，会影响免疫的效果，振荡后，1000rpm离心一分钟，如水相和油相不分层即可注射。
首次免疫用FCA，以后都用FIA。
免疫方法可采用背部多点注射法。
即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射，每点注0.1ml，间隔2周后再于上述部位选不同点注射(不要选择临近位点，否则溃疡愈合不好)。
每次免疫的抗原量约100μg。
免疫次数在四五次即可，抗原用量大可以减少次数。
六、取血：免疫一周后，可以耳动脉取血检测抗体效价。
多克隆抗体制备流程
多克隆抗体制备流程多克隆抗体制备流程有问题？丁香实验库全新大升级，10000+ 实验方法任你选前往丁香实验抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。
一般而言，抗体按靶位点不同主要分为单克隆抗体和多克隆抗体，由多个B淋巴细胞克隆产生的，受到多种抗原决定簇刺激并可以与多种抗原表位结合的抗体就是多克隆抗体，本篇主要讲述兔源性多克隆抗体制备的相关流程。
抗原有两个基本特性，即抗原性和免疫原性。
有抗原性的物质不一定有免疫原性，所以由此引出半抗原和完全全抗原，半抗原必须经过经过一定的改造（偶联蛋白载体BSA，OVA或者HSA等大分子物质）方能成为完全。
一般而言完全抗原分子量越大（大于10KDa），结构越复杂引起免疫反应的能力也就越强。
抗体就是能与特异性抗原结合的免疫球蛋白，抗体一般分为多克隆抗体和单克隆抗体，多克隆抗体能与抗原的多个表位结合。
本篇主要讲述兔来源的多克隆抗体的生产步骤多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→ 效价检测和终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。
具体实验步骤如下：1.兔子的准备挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），使其适应新的生活环境，至少稳定几天再进行首次取血.预采血（作阴性参照用）1.1 将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静；1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃)；1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨胀；1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)；1.5小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口；1.6将收集的血液置于37`C灭活30min,最后置于4`C过夜使其凝结释放血清；1.7将凝结好的血液在10000r／min离心10min； h.收集上清，即为血清。
2. 兔子的免疫2.1 注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。
多克隆抗体的制备方法与原理
抗体的制备方法与原理一、抗血清的制备有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。
（一）用于免疫的动物作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。
若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。
（二）免疫途径免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。
途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
（三）佐剂由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。
佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg 卡介苗就成为完全佐剂。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。
免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
▪ 二、大白兔皮内免疫方法 ▪ 1.先将大白兔固定,剪去背部兔毛,注意不
要剪破皮肤。然后用酒精棉球进行消毒。
▪ 2.用2ml注射器吸取1ml伤寒沙门菌液进行 皮内注射,共4-6点,每点大约0.2ml。
▪ 3. 每周免疫1次,连续3-4次。
▪ 三、小鼠腹腔免疫方法 ▪ 1.用左手抓取小鼠固定,消毒腹部皮
肤。
▪ 2.用1ml注射器吸取伤寒沙门菌0.2ml 进行腹腔注射。
▪ 3.每周免疫1次,连续3-4次。
五、进行实验记录: 包括实验名称 指导教师 年级专业 参加实验学生 整个实验过程 意见和建议
▪ 兔标记方法: ▪ 1班:剪去头左侧毛 ▪ 5班:剪去腹左侧毛
进行实验记录: 包括实验名称 指导教师 年级专业 参加实验学生 整个实验过程 意见和建议
一、大白兔耳缘静脉免疫方法: 1.将大白兔固定,将耳缘静脉附近的毛剪去, 并用酒精棉球消毒。 2.用2ml注射器吸取1ml(初次0.5ml)伤寒沙 门菌液经耳缘静脉注入大白兔体内。 3.每周免疫1次,连续3-4次。 注意:先自耳缘静脉远端注射。
2. 用2ml注射器吸取1ml伤寒沙门菌液进行皮 内注射,共4-6点,每点大约0.2ml。
3. 每周免疫1次,连续3-4次。
三、小鼠腹腔免疫方法 1.用左手抓取小鼠固定,消毒腹部皮肤。 2.用1ml注射器吸取伤寒沙门菌0.2ml进行腹腔
注射。 3.每周免疫1次,连续3-4次。
四、兔标记方法: 1班:剪去头左侧毛 2班:头右侧 3班:脖左侧 4班:脖右侧 5班:腹左侧 6班:腹右侧 7班:臀左侧 8班:臀右侧
2. 抗原和抗体在体内外均可以发生特异性结 合,可利用肥大氏反应检测动物血清中伤寒 沙门菌抗体的含量。
实验材料: 1. 新西兰雄性大白兔共16只,2只/班,昆明鼠48
只,6只/班 2. 灭活伤寒沙门菌 3. 注射器(免疫用、采血用)、碘酒酒精棉球等 4. 肥大氏反应用实验材料
一、大白兔耳缘静脉免疫方法
医学免疫学创新性实验 -----伤寒沙门菌多克隆抗体的制备
实验目的:
1. 学习家兔、小鼠的免疫方法,饲养技术,观制备血清的方法;
3. 学习并利用肥大氏反应检测血清中抗体的 效价的方法。
实验原理:
1. 灭活伤寒沙门菌注入动物体内后,作为异物 抗原,将刺激免疫系统,由B细胞产生多克隆 抗体。
1. 将大白兔固定,将耳缘静脉附近的毛剪去,并 用酒精棉球消毒。
2. 用2ml注射器吸取1ml (初次0.5ml)伤寒沙门 菌液经耳缘静脉注入大白兔体内。
3. 每周免疫1次,连续3-4次。
注意:先自耳缘静脉远端注射。
二、大白兔皮内免疫方法
1. 先将大白兔固定,剪去背部兔毛,注意不要 剪破皮肤。然后用酒精棉球进行消毒。