高效液相色_PPT幻灯片
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W：峰宽 ； σ：曲线拐点处峰宽的一半，即 峰高0.607处峰宽的一半。
保留时间（retention time,tR）：从进样开 始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时 间。
分离度（resolution,R）：相邻两峰的保留 时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率， 表示相邻两峰的分离程度。
拖尾因子（tailing factor,T）：T=B/A,用以 衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子 （symmetry factor）或不对称因子。
预柱与保护柱：
在体内药物分析中，为延长色谱柱的使用 寿命，不降低柱效，常在进样器前装一根 预柱，其作用是平衡流动相和吸附流动相 中的杂质，使其不污染分析柱。
为了防止分析柱被较脏的样品和流动相中 的杂质污染，常在进样器与分析柱之间， 装一根填料与分析柱完全相同的短柱作为 保护柱。
保护柱 （预柱）
(二) 进样器
进样阀（六通阀）、自动进样装置
六
通
进
样
进样针
阀
流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的 六通阀进样装置，其结构如图所示：
(三) 色谱柱
由柱管和固定相组成 分析柱、制备柱 性能评价
比如色谱柱的分离效率、对指定溶质的选择性、在不 同PH介质中的稳定性、重现性、色谱柱压力、柱子 的样品负载量、回收率等等。 通常，以指定的一组标准溶质为样品，测定他们在 柱子上的理论塔板数，作为柱效的衡量指标。
工作原理：复光通过流通池，再进入单色器，分 光后照射在二极管阵列装置上，同时获得各波长 的信号强度，即获得组分的吸收光谱。获得三维 光谱－色谱图。
用途：吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积用 于定量,判断峰纯度。
（三）荧光检测器(fluorescence detector；FD)
特点：
选择性好，专属型检测器； 灵敏度比紫外检测器高（检测限10-10 g/ml）。
专属型、浓度型检测器
紫外检测器举例：
1）固定波长检测器 ：254nm。 2）可变波长检测器：
光源：氘灯（和钨灯）， 200~400（800） nm，单色器，流通池（试样），光电管。
3）光电二极管阵列检测器 (PDAD)：
系列光电二极管，一个二极管对应接受光谱上
约1nm谱带宽的单色光。
光电二极管阵列 检测器：
检测原理：
朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号
（吸光度）与浓度成正比（A=εCl）
特点：
灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度，不破坏样品，应 用广（分析、制备）。
局限：
只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长 应小于检测波长。
tR t0(1KVSm) kK S Vm
死时间(dead time，t0)：不保留组分的保留时间。 即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。
保留时间(retention time，tR)：从进样开始到某 个组分在柱后出现浓度极大值的时间。
死体积(dead volume，V0)：由进样器进样口到检 测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部 分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒 间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、 检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过 程，其它3部分只起峰扩展作用。
液相色谱分析工作站
一、概述
高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)是20世纪60年代末迅速 发展的一种新型分离、分析技术。它是以经典液 相色谱为基础，以微粒型填料作固定相，采用高 压送液泵和各种高灵敏度检测器。
HPLC法具有分离效能高、分析速度快、检测灵 敏度高等特点。
制备色谱柱
(ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ) 检测器
检测器连在色谱柱的出门端，被色谱柱分 离后的样品各组分随流动相流入检测器， 样品中的各组分在流动相中的浓度或物理 量的变化，由检测器连续地转换成电信号， 在记录器上迅速的给出直观信息。
理想情况是对所有流出组分都有高的灵敏 度，而且呈线性响应，才可以作定量分析。
1. 紫外检测器
对于无荧光的物质可进行衍生化处理。
（四）电化学检测器（ECD） （五）蒸发光检测器（ELSD）
三、色谱分离原理
（一）液固吸附色谱法（LSC） （二）液液分配色谱法（LLC） （三）离子色谱法（IC） （四）空间排阻色谱法（SEC）
（ 一）液固吸附色谱法（LSC）
1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异。
自HPLC问世以来，在医学、药学、环境卫生等 领域的应用日益普遍，其中对药物动力学、生物 药剂学、临床药学研究的重要性越来越突出。
（一）输液泵
输液泵的作用是产生高压输送流动相。目前多数HPLC仪采 用柱塞往复泵，柱塞向前运动流动相溶剂输出，流向色谱 柱；柱塞向后运动，将输液瓶中的溶剂吸人缸体；如此前 后往复运动，将流动相溶剂源源不断的输送到色谱柱。
理论塔板数（theoretical plate number,N）用 于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。
N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径 分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类 和流速及测定柱效所用物质的性质。
如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表 示为： N=（tR/σ）2=16(tR)2/W =5.54(tR/W1/2)2。
紫外检测器(ultraviolet detector，UV)是在体 内药物分析中应用最广泛的检测器，是 HPLC仪上最常用的一种检测器，适用于被 测样品组分的分子结构中含有π-π共轭及n-π 共轭药物的检测。
这种检测器具有很高的灵敏度，对环境温 度及流速波动不太敏感，适用于梯度洗脱 操作。
紫外检测器(ultraviolet detector)
分配系数(distribution coefficient，K)：在一定温 度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定 相与流动相中的浓度之比。
2．固定相
（1）硅胶 表孔硅胶（薄壳硅胶）
全多孔硅胶 无定形 YWG 球形 YQG
堆积硅珠 YQG 3~4 μm
原理：吸附 特点：峰易拖尾 适用：分离极性化合物
保留时间（retention time,tR）：从进样开 始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时 间。
分离度（resolution,R）：相邻两峰的保留 时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率， 表示相邻两峰的分离程度。
拖尾因子（tailing factor,T）：T=B/A,用以 衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子 （symmetry factor）或不对称因子。
预柱与保护柱：
在体内药物分析中，为延长色谱柱的使用 寿命，不降低柱效，常在进样器前装一根 预柱，其作用是平衡流动相和吸附流动相 中的杂质，使其不污染分析柱。
为了防止分析柱被较脏的样品和流动相中 的杂质污染，常在进样器与分析柱之间， 装一根填料与分析柱完全相同的短柱作为 保护柱。
保护柱 （预柱）
(二) 进样器
进样阀（六通阀）、自动进样装置
六
通
进
样
进样针
阀
流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的 六通阀进样装置，其结构如图所示：
(三) 色谱柱
由柱管和固定相组成 分析柱、制备柱 性能评价
比如色谱柱的分离效率、对指定溶质的选择性、在不 同PH介质中的稳定性、重现性、色谱柱压力、柱子 的样品负载量、回收率等等。 通常，以指定的一组标准溶质为样品，测定他们在 柱子上的理论塔板数，作为柱效的衡量指标。
工作原理：复光通过流通池，再进入单色器，分 光后照射在二极管阵列装置上，同时获得各波长 的信号强度，即获得组分的吸收光谱。获得三维 光谱－色谱图。
用途：吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积用 于定量,判断峰纯度。
（三）荧光检测器(fluorescence detector；FD)
特点：
选择性好，专属型检测器； 灵敏度比紫外检测器高（检测限10-10 g/ml）。
专属型、浓度型检测器
紫外检测器举例：
1）固定波长检测器 ：254nm。 2）可变波长检测器：
光源：氘灯（和钨灯）， 200~400（800） nm，单色器，流通池（试样），光电管。
3）光电二极管阵列检测器 (PDAD)：
系列光电二极管，一个二极管对应接受光谱上
约1nm谱带宽的单色光。
光电二极管阵列 检测器：
检测原理：
朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号
（吸光度）与浓度成正比（A=εCl）
特点：
灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度，不破坏样品，应 用广（分析、制备）。
局限：
只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长 应小于检测波长。
tR t0(1KVSm) kK S Vm
死时间(dead time，t0)：不保留组分的保留时间。 即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。
保留时间(retention time，tR)：从进样开始到某 个组分在柱后出现浓度极大值的时间。
死体积(dead volume，V0)：由进样器进样口到检 测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部 分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒 间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、 检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过 程，其它3部分只起峰扩展作用。
液相色谱分析工作站
一、概述
高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)是20世纪60年代末迅速 发展的一种新型分离、分析技术。它是以经典液 相色谱为基础，以微粒型填料作固定相，采用高 压送液泵和各种高灵敏度检测器。
HPLC法具有分离效能高、分析速度快、检测灵 敏度高等特点。
制备色谱柱
(ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ) 检测器
检测器连在色谱柱的出门端，被色谱柱分 离后的样品各组分随流动相流入检测器， 样品中的各组分在流动相中的浓度或物理 量的变化，由检测器连续地转换成电信号， 在记录器上迅速的给出直观信息。
理想情况是对所有流出组分都有高的灵敏 度，而且呈线性响应，才可以作定量分析。
1. 紫外检测器
对于无荧光的物质可进行衍生化处理。
（四）电化学检测器（ECD） （五）蒸发光检测器（ELSD）
三、色谱分离原理
（一）液固吸附色谱法（LSC） （二）液液分配色谱法（LLC） （三）离子色谱法（IC） （四）空间排阻色谱法（SEC）
（ 一）液固吸附色谱法（LSC）
1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异。
自HPLC问世以来，在医学、药学、环境卫生等 领域的应用日益普遍，其中对药物动力学、生物 药剂学、临床药学研究的重要性越来越突出。
（一）输液泵
输液泵的作用是产生高压输送流动相。目前多数HPLC仪采 用柱塞往复泵，柱塞向前运动流动相溶剂输出，流向色谱 柱；柱塞向后运动，将输液瓶中的溶剂吸人缸体；如此前 后往复运动，将流动相溶剂源源不断的输送到色谱柱。
理论塔板数（theoretical plate number,N）用 于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。
N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径 分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类 和流速及测定柱效所用物质的性质。
如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表 示为： N=（tR/σ）2=16(tR)2/W =5.54(tR/W1/2)2。
紫外检测器(ultraviolet detector，UV)是在体 内药物分析中应用最广泛的检测器，是 HPLC仪上最常用的一种检测器，适用于被 测样品组分的分子结构中含有π-π共轭及n-π 共轭药物的检测。
这种检测器具有很高的灵敏度，对环境温 度及流速波动不太敏感，适用于梯度洗脱 操作。
紫外检测器(ultraviolet detector)
分配系数(distribution coefficient，K)：在一定温 度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定 相与流动相中的浓度之比。
2．固定相
（1）硅胶 表孔硅胶（薄壳硅胶）
全多孔硅胶 无定形 YWG 球形 YQG
堆积硅珠 YQG 3~4 μm
原理：吸附 特点：峰易拖尾 适用：分离极性化合物