微生物实验设计-病原性球菌的鉴定

医学微生物学实验设计

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学号：**********

班级：10级临床十一班

病原性球菌的鉴定

姚淑宝

（石河子大学医学院石河子832000）

摘要：球菌是细菌中的一大类，其中对人类有致病性的球菌包括分属葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属和奈瑟菌属的一些细菌。本次实验设计以掌握病原性球菌的形态和培养特性，熟悉病原性球菌的分离和鉴定程序为目的。对脓汁中的葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌进行鉴别。

一、鉴定思想

本次鉴定试验，先将脓汁标本直接镜检，再分离培养，观察镜下菌体的形态特征以及形成菌落的形态特征确定待测菌的菌属。然后，对可疑菌落纯培养，通过不同生化反应对同一菌属中的不同细菌进行区别。（具体见图1-1）

分离纯化

葡萄球菌属奈瑟菌属

血浆凝固酶试验胆汁溶菌试验麦芽糖发酵试验

二、鉴定方法

（一）直接镜检

将脓汁标本涂片进行革兰染色，然后在显微镜下观察细菌菌体的形态、排列、染色性并作出初步诊断。

葡萄球菌属：革兰染色阳性，球形，无芽胞、无鞭毛，呈葡萄串状排列。

链球菌属：革兰染色阳性，球形或椭圆形，无芽胞、无鞭毛，呈链状或成双排列。肺炎链球菌具有荚膜双球的典型形态。

奈瑟菌属：革兰染色阴性，无芽胞、无鞭毛，常成双排列。脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌大多于中性粒细胞内外分布。

通过直接镜检可以确定脓汁标本中细菌的菌属。在确定菌属的基础下再对脓汁标本中的细菌分离纯化，然后挑取可以菌落通过再次涂片染色镜检、致病物质检查、生化反应、血清学鉴定等方法进行菌属内的区别。

（二）分离纯化

用分区划线法将脓汁中的细菌接种在血琼脂平板培养基或巧克力色培养基上并在5%二氧化碳、37℃的条件下培养18~48小时。观察菌落的形态。

葡萄球菌属：在血平板上形成圆形凸起、表面光滑、润湿、边缘整齐、不透明的菌落。形成金黄色、白色和柠檬色脂溶性色素，多数金黄色葡萄球菌菌落周围有β溶血现象。

链球菌属：在血平板上形成灰白色、圆形凸起、半透明或不半透明的细小菌落。不同类群有不同的溶血现象，包括α、β、γ三种。肺炎链球菌在血平板上形成灰白色、略扁平、半透明的细小菌落，菌落周围有α溶血现象。培养时间超过48小时，菌落中央会出现脐状下陷。

奈瑟菌属：脑膜炎奈瑟菌在巧克力琼脂平板上，形成无色、圆形、凸起、光滑、透明似露滴状菌落，培养时间超过48小时常死亡。淋病奈瑟菌在巧克力琼脂平板上培养48小时，形成灰白色、圆形、凸起、表面湿润有光泽的细小菌落。

通过在血平板上形成的菌落的不同，可以做出进一步诊断。并可挑取可疑菌落再次镜检，无杂菌后进行纯培养再通过生化反应鉴别。

（三）生化反应

1、血浆凝固酶试验

血浆凝固酶是致病性葡萄球菌产生的，可使含有肝素或枸椽酸钠抗凝剂的人或兔血浆发生凝固的酶类物质，是判断葡萄球菌致病性的最重要指标。游离凝固酶用试管法检测，结合凝固酶用玻片法测试。通过血浆凝固酶试验可以对葡萄球菌属的纯培养物做出鉴别。

【材料】

被测菌培养物；加抗凝剂的1:2稀释的人或兔血浆；载玻片、接种环、小试管等。

【方法】

试管法：在盛有血浆0.5ml的试管中，接种被测菌培养物，置于温箱内1~4小时后，观

察血浆状态。流动性变差或出现凝固为阳性。

玻片法：去加抗凝的血浆滴于载玻片上，在血琼脂平板上取被测菌落与血浆混匀。观察，如果出现乳白色颗粒即为试验阳性。反之，均匀无颗粒者，为试验阴性。

【结果】

试验阳性说明可疑菌落为金黄色葡萄球菌菌落，试验阴性说明可疑菌落为白色葡萄球菌。

2、胆汁溶菌试验

胆汁或胆盐可溶解肺炎链球菌，可能是由于胆汁降低细胞膜表面的张力，使细胞膜破损或使菌体裂解；或者是由于胆汁加速了肺炎链球菌本身自溶过程，促使细菌发生自溶。利用这一现象可以对链球菌属的纯培养物做出鉴别。

【材料】

10%去氧胆酸钠或纯牛胆汁、被测菌培养物；小试管、接种环等。

【方法】

平板法：取10％去氧胆酸钠溶液一接种环，滴加于被测菌的菌落上，置35℃30min后观察结果。菌落消失为实验阳性，反之为阴性。

试管法：被测菌培养物2支，各0.9ml，分别加入l0％去氧胆酸钠溶液和生理盐水（对照管）0.1ml，摇匀后置35℃水浴10～30min，观察结果。加胆盐的培养物变透明，而对照管仍混浊判为阳性。

【结果】

试验阳性说明被测菌为肺炎链球菌。

3、麦芽糖发酵试验

该实验通过将细菌标本接种于内含倒置小管的单糖发酵管中，用溴甲酚紫作指示剂，培养后观察发酵管内指示剂的颜色变化及倒置小管的产气情况，判断细菌对不同单糖分解利用能力。大多数的脑膜炎奈瑟菌能分解利用麦芽糖产酸不产气而淋病奈瑟菌则不行，利用这一原理可以对奈瑟菌属的纯培养物进行鉴别。

【材料】

单糖发酵管（麦芽糖）、指示剂、被测菌培养物等。

【方法】

以无菌操作，用接种环移取被测菌培养物少许，接种于内含倒置小管的麦芽糖糖发酵管中，用溴甲酚紫作指示剂。接种后，置36±1.0°C培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡。

【结果】

若麦芽糖发酵管中仍为紫色，表明细菌不分解该糖，试验阴性，被测菌为淋病奈瑟菌；若液体发酵管中液体变为黄色，表明细菌分解该糖，试验阳性，被测菌为脑膜炎奈瑟菌。

[参考文献]

1.李凡刘晶星. 医学微生物学. 第7版. 北京：人民卫生出版社，2012

2.吴万贵邢建新. 病原微生物学与免疫学实验教程. 石河子：石河子大学医学院病原生物学与免疫学教研室，2012