大量制备单克隆抗体
单克隆抗体技术（文献综述）
文献综述—单克隆抗体技术的原理、发展与主要的实验步骤1. 单克隆抗体制备的基本原理经免疫的动物产生的致敏B淋巴细胞能分泌特异性的抗体，但这些细胞不能在体外长期存活；而骨髓瘤细胞则可以在体外大量地、无限地繁殖，但不能分泌特异性的抗体。
如果应用杂交瘤技术使骨髓瘤细胞与那些能分泌特异性抗体的细胞相融合，那么得到的杂交瘤细胞（hybridoma cell）将同时具有两种亲本细胞的特性：既能够象肿瘤细胞那样无限繁殖，又具有B淋巴细胞的不断分泌抗体的能力。
根据克隆选择学说，由于每个致敏的B淋巴细胞只能针对同一抗原决定簇产生同种的、完全一样的抗体，所以经过克隆化的杂交瘤细胞就能够分泌对某一抗原决定簇具有特异性的单克隆抗体。
这就是单克隆抗体制备的基本原理。
2. 单克隆抗体技术的诞生、发展和展望1975年，George Kohler 和 Cesar Milstein在Nature上发表了一篇文章，第一次描述了一种获得单克隆抗体的方法。
他们所创立单克隆抗体技术给免疫学乃至整个生物医学领域带来了一次巨大的革命。
Kohler 和Milstein 也因此而荣获1984年诺贝尔奖。
单克隆抗体技术诞生后，立即引起了许多研究者的注意，人们纷纷投入这一崭新领域的研究。
经过多年的发展，到二十世纪八十年代中期，单克隆抗体技术已日臻完善，单克隆抗体也开始广泛应用于生物医学研究和生物技术的各个领域，以及临床诊断和治疗的许多领域。
最初，单克隆抗体技术是以小鼠－小鼠杂交瘤为研究的中心而发展起来的。
由于小鼠源性的单克隆抗体在生产与应用中有其内在的缺点，八十年代后，小鼠－大鼠、大鼠－大鼠、小鼠－人以及人－人杂交瘤技术也被尝试并取得了不同程度的成功,有力地推动了单克隆抗体技术的发展和生物医学研究的深入。
尽管早有准备,单克隆抗体技术的影响之深远还是大大超出了人们的预想：在八十年代中到九十年代末的短短十多年中，为了满足临床诊断和治疗的需要，双特异性抗体技术及人－鼠嵌合抗体技术、人源化抗体技术、小分子抗体技术、植物基因工程抗体技术、抗体酶技术、抗体库(噬菌体显示）技术、外因鼠(XenoMouse)技术等基因工程抗体技术在经典单克隆抗体技术的基础上也被创立并得到了突飞猛进的发展。
单克隆抗体制备的主要技术
单克隆抗体制备的主要技术单克隆抗体制备的主要技术_______________________________单克隆抗体（Monoclonal Antibody，简称mAb）是一种特殊的抗体，它们可以特异性地识别抗原，并且具有极高的特异性和稳定性。
它们已经在临床治疗和诊断方面发挥了重要作用，因此单克隆抗体制备技术已成为生物医学研究的重要手段。
一、单克隆抗体制备的基本原理单克隆抗体制备的基本原理是将一种特定的抗原分子和一种抗原特异性的抗体分子连接起来，从而产生一种特定的单克隆抗体。
这种联合物可以由一种具有抗原特异性的单克隆抗体分子或多克隆抗体分子所表示。
单克隆抗体制备的基本过程可分为四个步骤：选择抗原；制备抗原；选择和培养单克隆抗体产生细胞；制备和纯化单克隆抗体。
1、选择抗原在进行单克隆抗体制备时，首先必须选择一种特定的抗原，以便于产生特异性的单克隆抗体。
常用的抗原来源有蛋白质、多肽、核酸、糖蛋白和合成化学物质。
2、制备抗原根据所选用的抗原，可采用不同的方法对其进行制备。
例如，蛋白质通常可以采用蛋白质表达或免疫原制备方法；多肽可以采用合成方法或者从天然蛋白质中分离出来；核酸可以采用合成方法或者从样品中分离出来；糖蛋白可以采用表达方法或者从天然蛋白质中分离出来；而合成化学物质可以直接合成。
3、选择和培养单克隆抗体产生细胞在单克隆抗体制备中，必须使用能够产生特异性单克隆抗体的产生细胞。
目前常用的单克隆抗体产生细胞包括B细胞、T细胞和流感株融合细胞。
在这些产生细胞中，B细胞是最常用的，因为它能够快速、有效地产生大量的特异性单克隆抗体。
4、制备和纯化单克隆抗体当B细胞产生了足够数量的单克隆抗体之后，就可以采用不同的方法将它们制备和纯化出来。
常用的方法包括浸出法、寡核苷酸酶切法、蛋白酶浸出法、杂交法和Ion-exchange chromatography。
这些方法可以帮助我们得到高度纯化的单克隆抗体。
二、单克隆抗体制备的优势单克隆抗体制备是一种高效、可靠的方法，它可以用来高通量地产生大量特异性的单克隆抗体。
通过小鼠腹水如何大量制备单克隆抗体
教学中产生的问题：单克隆抗体的制备过程中，大家都关注了筛选过程，往往没有关注制备的两条途径，其中之一，细胞培养的途径许多学生能理解，而腹水生产的途径就不熟悉，教材中也没有介绍，而这对内环境的知识也是有帮助的。
单克隆抗体（monoclonal
antibody，MAb），是针对专一的抗原决定簇产生的抗体。
单克隆技术又名杂交瘤技术起源于1975年，主要原理是利用产生抗体的B细胞与骨髓瘤细胞杂交融合成杂交瘤细胞，生产抗体。
两种方法生产单克隆抗体：
目前大量制备单抗的方法主要有两种方法，一种是动物体内生产法（腹水制备），在小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞，杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体，约1-2周，可见小鼠腹部膨大，用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体；另一种是细胞体外培养法，将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养，在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。
由于腹水中单克隆抗体的产生通常会导致内源性宿主蛋白的污染，因此细胞培养对于小规模和大规模单克隆抗体的生产至关重要。
重点问题解疑：如何通过腹水产生单克隆抗体？
杂交瘤细胞被注射到小鼠腹腔内，由于有组织液提供足够的营养，所以能够大量分裂。同时部分杂交瘤细胞分泌抗体，这些细胞和抗体导致腹腔组织液渗透压增高，血浆和淋巴就会渗出并潴留在腹腔内形成腹水。
腹水制备法的优点：
腹水制备法操作简单、制备成本低，是目前国内生产抗体的主要方式，但是，得到的腹水常混有小鼠的各种杂蛋白（包括免疫球蛋白Ig），而且还有污染动物病毒的危险。而体外培养法通过转代培养制备的细胞培养得到的抗体，不但不含小鼠杂蛋白和动物病毒，而且抗体易纯化，目前在国外抗体生产中非常流行。
多克隆抗体单克隆抗体的制备流程
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单克隆抗体制备流程
单抗制备流程1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫旳小鼠脾细胞进行融合，形成旳杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上旳突破不仅为医学与生物学基本研究开创了新纪元，也为临床疾病旳诊、防、治提供了新旳工具。
制备单克隆抗体涉及动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞旳克隆化、冻存以及单克隆抗体旳大量生产，要通过几种月旳一系列实验环节，下面按照制备单克隆抗体旳流程顺序，逐个简介其实验措施。
一、细胞融合前准备(一) 免疫方案选择合适旳免疫方案对于细胞融合杂交旳成功，获得高质量旳McAb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原旳特性不同而定。
1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得较好旳免疫效果。
下面以细胞性抗原为例旳免疫方案:初次免疫1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／0.5ml ip↓3周后加强免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射)↓取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。
规定抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水旳乳糜状，放一滴在水面上不易立即扩散呈小滴状表白已达到油包水旳状态。
商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀旳分枝杆菌充足混匀。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般0.8～1ml 0.2ml／点)↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不适宜超过0.5ml)↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是某些弱抗原)旳免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原旳免疫原性，另一方面可减少抗原旳使用量。
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理一、引言单克隆抗体（Monoclonal Antibody，mAb）是由单一B细胞克隆产生的抗体，具有高度特异性和亲和力。
其制备方法主要有杂交瘤技术、酶联免疫吸附试验法（ELISA）、荧光激发技术等。
其中，杂交瘤技术是制备单克隆抗体最重要的方法之一。
二、杂交瘤技术基本原理1. B细胞与肿瘤细胞的融合杂交瘤技术的基本原理是将体内产生的特异性抗体B细胞与无限增殖能力的肿瘤细胞进行融合，形成可分泌大量同种特异性抗体的杂交瘤细胞。
在此过程中，B细胞提供了高度特异性的抗体基因组，而肿瘤细胞提供了无限增殖能力。
2. 杂交瘤细胞筛选和分离将获得的杂交瘤细胞进行筛选和分离，以获取单一同种特异性抗体产生的杂交瘤细胞株。
这里需要注意的是，筛选和分离的条件需要严格控制，以确保所得到的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力。
3. 单克隆抗体的大规模制备通过对单克隆抗体杂交瘤细胞株进行培养和扩增，可以大规模制备单克隆抗体。
此过程中需要注意对培养条件、生长因子、营养物质等进行优化，以提高单克隆抗体的产量和质量。
三、杂交瘤技术的优点1. 高度特异性和亲和力通过杂交瘤技术制备的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力，可以用于检测、诊断、治疗等领域。
2. 无限复制能力杂交瘤细胞具有无限复制能力，可以大规模制备同种特异性抗体。
3. 可重复性好由于单一B细胞产生的同种特异性抗体都是完全相同的，因此通过杂交瘤技术制备出来的单克隆抗体具有良好的可重复性。
四、杂交瘤技术存在的问题及解决方法1. 杂交瘤细胞的稳定性杂交瘤细胞的稳定性对于单克隆抗体的制备至关重要。
为了提高杂交瘤细胞的稳定性，可以采用多种方法，如对培养条件进行优化、添加生长因子等。
2. 克隆选择在杂交瘤技术中，克隆选择是一个非常重要的环节。
为了确保所得到的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力，需要对杂交瘤细胞进行筛选和分离。
这里需要注意的是，筛选和分离的条件需要严格控制。
杂交瘤单抗的制备流程
杂交瘤单抗的制备流程杂交瘤单抗的制备呀，那可真是个超有趣又有点复杂的过程呢。
一、免疫动物。
咱们得先找个合适的小动物来进行免疫哦。
一般常用的就是小鼠啦。
为啥选小鼠呢？因为它好养呀，而且繁殖快。
我们要给小鼠注射我们想要制备单抗针对的那种抗原。
这个抗原就像是个小靶子，我们要让小鼠的免疫系统发现它，然后产生反应。
就好比是给小鼠的免疫系统出了一道题，让它想办法去解决这个外来的“小坏蛋”。
这一步可不能马虎呢，抗原的剂量、注射的途径还有注射的频率都很重要。
要是剂量不对呀，可能小鼠的免疫系统就不把这个抗原当回事儿；注射途径不对呢，可能抗原就不能很好地被免疫系统识别。
这就像我们平时学习，要是学习方法不对，就很难掌握知识一样呢。
二、细胞融合。
三、筛选杂交瘤细胞。
细胞融合之后，会出现各种各样的细胞组合，有没融合的骨髓瘤细胞，有没融合的脾细胞，当然也有我们想要的杂交瘤细胞。
这时候我们就得像个严格的裁判一样，把我们想要的杂交瘤细胞挑出来。
这里就用到一种叫HAT的培养基。
这个培养基可神奇啦，没融合的骨髓瘤细胞在这个培养基里是不能生长的，因为它缺少一种酶。
没融合的脾细胞呢，它虽然能产生抗体，但是在体外不能一直分裂繁殖，所以也会慢慢死掉。
只有杂交瘤细胞，它既有骨髓瘤细胞的长生不老的能力，又有脾细胞产生抗体的本事，所以它能在HAT培养基里茁壮成长。
这个过程就像是在一堆沙子里找金子一样，得小心翼翼又充满耐心呢。
四、克隆化培养。
把杂交瘤细胞筛选出来之后，还不能松口气呢。
因为这些杂交瘤细胞可能还不完全一样，我们得把它们一个个分开，让它们单独生长，这就是克隆化培养。
这个过程有点像把一群小朋友分开，让每个小朋友都有自己的小房间一样。
我们可以用有限稀释法或者软琼脂平板法来进行克隆化。
有限稀释法就是把杂交瘤细胞稀释到很低的浓度，然后让每个细胞都在一个小的培养孔里生长。
软琼脂平板法呢，就是把细胞放在软琼脂里，让单个细胞在琼脂里形成一个小的细胞团。
单抗制备步骤及注意事项
单抗制备步骤及注意事项脾细胞的准备：1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。
无菌操作取出脾脏，置于盛有5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。
2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。
3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。
再以同样的方法洗涤离心一次。
4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。
注意事项：•免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B 淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
骨髓瘤细胞的准备：1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。
2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。
3.制备细胞悬液，计活细胞数。
4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。
注意事项：•常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。
•骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。
•骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10～20%。
细胞的最大密度不得超过106个/mL。
•一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时。
•一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。
•保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。
细胞融合：1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。
2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。
单抗制备
杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要步骤包括：（1）抗原制备；（2）免疫动物；（3）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；（4）细胞融合；（5）杂交瘤细胞的选择培养；（6）杂交瘤细胞的筛选；（7）杂交瘤细胞的克隆化；（8）单克隆抗体的检定；（9）分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；（10）单克隆抗体的大量制备。
下面简要介绍单克隆抗体的制备过程：1、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。
一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。
抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。
2、细胞融合采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。
将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。
在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
3、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT 选择性培养基。
在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。
未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。
只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。
通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。
采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。
经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。
单克隆抗体制备流程图
单抗制备流程1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前准备(一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／0.5ml ip↓3周后加强免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射)↓取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。
要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。
商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般0.8～1ml 0.2ml／点)↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不宜超过0.5ml)↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
制备单克隆抗体
（1）细胞融合过程中依据的原理是_生__物___膜__具__有流动性 （2）设法将B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，常用的生物诱导因素是_灭__活___的__仙__台病毒 （3）为筛选得到杂交瘤细胞，需在培养基中添加 氨基蝶呤 才能完成杂交瘤细胞的筛选．
练习3下图是单克隆抗体制备流程阶段示意图。
（1）单克隆抗体技术是___动__物__细__胞__融__合___技术的重要应用；后者的优点是突破了有性 杂交方法的局限，使_远__缘__杂__交__成为可能。 （2）B淋巴细胞是由动物体骨髓中的_____造__血__干___细胞增殖、分化、发育而来。 （3）杂交瘤细胞的特点是_既__能__迅__速__大__量__增__殖__，__又__能__产__生__专。一抗体 （4）单克隆抗体技术经过两次筛选过程，第一次筛选出_____杂__交__瘤__细__胞____，第二次 筛选出_能__产__生__特__异__性__抗__体__的__杂_。交瘤细胞 （5）单克隆抗体与常规的血清抗体相比，最大的优越性体现在_特__异__性__强__、__灵__敏。度高、
此时的培养基为 选择培养基
Ｂ，Ｂ－Ｂ
Ｄ途径、Ｓ途径
能合成DNA，但不能大量增殖
瘤，瘤－瘤 Ｂ－瘤
Ｄ途径 Ｄ途径、Ｓ途径
不能合成DNA，不能大量增殖 能合成DNA，能大量增殖
问题4 数量较少的杂交瘤细胞增殖能力较群体细胞差，如何提高存活率？
在培养液中加入滋养细胞支持生长
HAT 培养基筛选后，试管中的杂交瘤细胞只有一种么？
可大量制备
• 练习4如图表示动物细胞克隆和制备单克隆抗体的相关过程，请回答下列问题:
单克隆抗体的制备及其应用
单克隆抗体的制备及其应用单克隆抗体是一种能够识别特定抗原并结合于它的单一克隆抗体分子。
相对于传统的混合抗体，单克隆抗体具有更加精准的特异性和较高的亲和力，因此在现代医学中应用广泛，尤其在疾病的诊断、治疗和预防方面发挥着重要的作用。
制备单克隆抗体的过程可以分为四个主要步骤：免疫原的制备、小鼠的免疫、脾细胞的融合和单克隆抗体的筛选和鉴定。
免疫原制备免疫原是指能够引起免疫反应并且激发机体产生抗体的物质。
制备免疫原主要有两种方法：一是纯化目标分子，二是化学合成人工抗原。
纯化目标分子是指从生物体内提取目标蛋白质，包括人类血清、细胞培养上清液或从组织中分离的蛋白质，通过高效液相层析或离子交换层析等技术达到纯度要求。
化学合成人工抗原需要建立三级结构，并且通过光谱分析等技术进行鉴定。
小鼠的免疫制作单克隆抗体时，一般使用小鼠进行免疫。
将免疫原注射到小鼠体内，通过免疫系统的识别和选择，产生能够与目标分子特异性结合的抗体，这些抗体被称为多克隆抗体。
免疫时间和免疫剂量都是需要精细控制的参数，以确保得到的多克隆抗体可以覆盖免疫原的所有表位。
脾细胞的融合脾细胞是一个重要的免疫细胞，当它遇到免疫原时，会产生抗体。
将免疫小鼠的脾脏取出，制成单细胞悬液，然后与能够维持无限增殖的癌细胞融合。
融合细胞将产生能够继承小鼠脾细胞产生的抗体特异性和癌细胞的无限增殖能力的“嵌合抗体细胞”。
单克隆抗体的筛选和鉴定通过将“嵌合抗体细胞”进行单细胞分离和分层培养，筛选出特异性结合目标分子的单抗，并经过多重鉴定，包括酶联免疫吸附实验、亲和力检测试验、特异性试验、同工酶分析、生物学鉴定和单克隆抗体的特性鉴定等多项检测，确保得到的单克隆抗体具有较高的特异性、亲和力和稳定性。
单克隆抗体的应用单克隆抗体可应用于医学、生物技术及科学研究等领域，例如基因工程药物、免疫诊断、癌症治疗、疫苗研发、食品安全检验、环境检测和生物学研究等方面。
在基因工程药物开发中，单克隆抗体能够定位特定的蛋白质，从而研制出精确治疗某种疾病的药物，例如格拉西米布是一种单克隆抗体，用于治疗类风湿性关节炎和肠炎。
单克隆抗体制备实验过程
单克隆抗体制备实验过程一、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。
一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。
抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B 淋巴细胞。
说明：FCA，弗氏完全佐剂；FIA，弗氏不完全佐剂；Quickantibody，北京康碧泉公司研制的佐剂。
上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM，存在亲和力弱等缺点，慎用。
PS：1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射6-8个点为宜。
2、腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。
3、冲击免疫完成后，应在96小时内完成细胞融合，否则相应的B细胞数量会下降到未冲击前的水平。
二、细胞融合（Cell fusion）【材料和试剂】（1）骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。
（2）免疫小鼠脾细胞悬液取3天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，•分离血清冻存备用。
拉颈处死小鼠，浸泡于75％酒精中3～5min。
无菌操作取出脾脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，剪去周围的结缔组织，将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上，先用剪刀剪成3～5个小块，然后用注射器内芯研磨。
将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中，加不完全培养液50ml，1000r/min 离心5min，弃上清，再以同法洗涤离心一次。
然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中，计活细胞数，一般一只小鼠可得0.5～2×108个脾细胞。
（3）饲养细胞将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。
用酒精棉球擦拭腹膜消毒。
用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。
单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体的制备流程（一）动物的选择与免疫1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。
一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。
常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。
③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。
（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。
初次免疫1×107/0.5ml ip↓2～3周后第二次免疫1×107/0.5ml ip↓3周后加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv↓取脾融合（二）细胞融合1．细胞融合前准备（1）骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。
（2）饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。
【原创】单克隆抗体研制最详细步骤!!!
【原创】单克隆抗体研制最详细步骤5、杂交瘤细胞的冻存与复苏（1）杂交瘤细胞的冻存在建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多“阳性”孔，来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分细胞冻存起来；另一方面，为了防止实验室可能发生的意外事故，如停电、污染、培养箱的温度或CO2控制器失灵等给正在建立中的杂交瘤带来灾难，通常尽可能早地冻存一部分细胞作为种子，以免遭到不测。
在杂交瘤细胞建立以后，更需要冻存一大批，以备今后随时取用。
细胞冻存的原理是细胞在加血清和二甲基亚砜的培养基中以一定的缓慢速度下降温度（0℃——-20℃，每分钟下降1℃；-20℃——-40℃每分钟下降2℃），可在-196℃液氮或液氮蒸气中长期保存。
下面介绍我们实验室的细胞冻存方法，经几年来对多种细胞的使用，细胞复苏存活率均在80%以上。
A、材料：a. 带盖吸管筒一只（铝质或洋铁皮制），内壁（包括筒底和盖）衬1-2层石棉纸或石棉布。
b. 含10-20%血清、5-10% DMSO的HT培养基，冰浴降温至0℃左右（用作冻存液）。
c. 灭菌安瓶或带盖小瓶。
d. -70℃冰箱。
e. 液氮及液氮罐。
f. 处于对数生长中期、健康而活力好的杂交瘤细胞。
B、方法：a. 将杂交瘤细胞（或其他细胞）离心，重新悬浮于预冷的冻存液中，浓度为106-107左右/ml，分装安瓶，每瓶1ml，置冰浴上；安瓶上标明细胞名称、冻存日期、批号等。
b. 安瓶封口后仍置冰浴上。
c. 将安瓶放入一带收口绳的小布袋内，布袋上标明冻存号、细胞名称等，立即将布袋放入吸管筒内，置-70℃冰箱。
d. 2-4小时后或过夜后从-70℃冰箱取出吸管筒，将盛有细胞的布袋移入液氮罐；在布袋的线绳上作好标记或代码；最后在液氮冻存簿上作详细记录。
e. 液氮罐应定期补充液氮（最好是专人管理）；补充液氮及存取细胞时应带保护眼镜和手套，以免因液氮冻伤等。
（2）杂交瘤细胞的复苏杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞或其他细胞在液氮中保存，若无意外情况时，可保存数年至数十年。
单克隆抗体制备的基本原理
单克隆抗体制备的基本原理单克隆抗体（monoclonal antibody）是指由同一抗体原型细胞（B细胞）分娩的具有相同抗原结合能力和单一特异性的抗体分子。
单克隆抗体制备的基本原理是通过融合抗体原型细胞和肿瘤细胞，形成无限增殖的杂交瘤细胞，利用这些细胞生产大量的单克隆抗体。
首先，制备免疫原。
免疫原可以是纯化的蛋白质，也可以是从细胞、病毒、细菌等生物体中提取的抗原。
免疫原的选择要根据具体需要，确保能够引发免疫应答。
接着，通过免疫程序激发抗体原型细胞。
将免疫原注射给小鼠等实验动物，促使其免疫应答产生特异性抗体。
这个过程一般包括预免疫、主免疫和增强免疫等步骤，以提高免疫应答的效果。
然后，收集免疫骨髓细胞或淋巴细胞，与肿瘤细胞进行细胞融合。
肿瘤细胞一般选择无限增殖能力的骨髓瘤或葡萄状囊肿瘤细胞，这些细胞能够提供长期稳定的单克隆抗体分泌。
融合过程中利用聚乙二醇等化学物质提高融合效率。
杂交瘤筛选是在含有融合细胞的培养基中筛选出能够分泌目标抗体的杂交瘤细胞株。
筛选的方法包括细胞排序、ELISA、免疫组化和免疫磁珠等。
通过这些方法，可以快速筛选出能够特异性地分泌目标抗体的细胞株。
最后，对单克隆细胞进行培养和扩增，得到大量的单克隆抗体。
单克隆细胞培养一般在无血清培养基中进行，可以使用悬浮培养方法或者固定化培养方法。
培养的细胞经过一定周期后可以分离单克隆抗体。
总的来说，单克隆抗体制备的基本原理是通过免疫应答激发产生抗体原型细胞，然后与肿瘤细胞融合形成无限增殖的杂交瘤细胞，再通过杂交瘤筛选和单克隆细胞培养等环节，最终获得大量单克隆抗体。
这一技术在生命科学和医学领域中具有广泛的应用前景。
单克隆抗体的制作流程
单克隆抗体的制作流程一、引言在生物医学研究和临床治疗中，单克隆抗体被广泛应用。
它可以通过与特定的抗原结合来识别和定位目标分子，为研究人员提供了重要的工具。
在本文中，我们将深入探讨单克隆抗体的制作流程，包括免疫原选择、免疫动物制备、细胞融合和单克隆抗体筛选等环节。
二、免疫原选择免疫原的选择对于制备具有高特异性和亲和力的单克隆抗体至关重要。
首先要确定所需的抗原特征，例如结构域、修饰形式等。
常见的免疫原包括蛋白质、多肽、糖类、小分子化合物等。
在选择免疫原时，需考虑其易得性、免疫原性、纯度、稳定性等因素。
2.1 蛋白质和多肽免疫原蛋白质和多肽通常是制备单克隆抗体最常用的免疫原。
选择合适的蛋白质或多肽，可以根据目标蛋白的功能域、线性表位或立体结构等特征。
对于复杂的蛋白质，可以选择亲和纯化后的特定结构域或表位作为免疫原。
2.2 糖类免疫原糖类通常具有较复杂的结构，选择适当的免疫原十分关键。
在制备糖类免疫原时，可以选择与糖链特异性结合的蛋白质作为载体，通过共价结合将糖类连接到蛋白质上，并保持其天然的空间构象。
2.3 小分子化合物免疫原小分子化合物通常具有较弱的免疫原性，需要通过与载体结合形成分子复合物来增强免疫性。
常用的方法包括与大分子带电载体或蛋白质偶联，或通过共价结合形成分子复合物。
三、免疫动物制备合适的免疫动物选择和制备是单克隆抗体制备的重要环节。
常用的免疫动物包括小鼠、兔子和大鼠等。
3.1 小鼠小鼠是最常用的免疫动物，且易于操作。
在选择小鼠品系时，需考虑其免疫反应能力、抗原耐受性和容易获得的特点。
通常使用BALB/c小鼠或nude小鼠。
3.2 兔子兔子具有较强的免疫反应能力和较大的体积，可以提供大量的抗体。
但兔子对某些抗原可能产生耐受性。
3.3 大鼠大鼠易于操作且免疫反应充分，但体积较小，提供的抗体量相对较少。
四、细胞融合细胞融合是制备单克隆抗体的关键步骤之一。
通过将免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，可以获得具有免疫动物和癌细胞特点的杂交瘤细胞。
单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体的制备流程制备单克隆抗体的流程包括动物的选择与免疫以及细胞融合两个步骤。
在动物的选择方面，纯种BALB/C小鼠是较为理想的选择。
这种小鼠温顺、离窝的活动范围小，体弱，食量及排泄物也较少，适合在洁净的实验室中饲养。
目前，许多实验室都选择纯种BALB/C小鼠来进行杂交瘤技术。
在免疫方案的选择方面，合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功以及获得高质量的单克隆抗体至关重要。
一般来说，根据抗原的特性不同，需要制定不同的免疫方案。
对于可溶性抗原，由于免疫原性较弱，需要加佐剂。
常用的佐剂包括XXX完全佐剂和XXX不完全佐剂。
初次免疫时，抗原的剂量一般为1-50μg，加福氏完全佐剂进行皮下多点注射或脾内注射（一般0.8-1ml，0.2ml/点）。
之后，每隔3周进行一次免疫，剂量同初次免疫，但XXX不完全佐剂进行皮下或腹腔内注射（ip剂量不宜超过0.5ml）。
第三次免疫时，剂量同前两次，不加佐剂，进行腹腔内注射，5-7天后采血测其效价。
如果需要加强免疫，剂量一般为50-500μg，可以进行腹腔内或静脉内注射。
对于可溶性抗原，还有一些更新的免疫方案，如将可溶性抗原颗粒化或固相化、改变抗原注入的途径以及使用细胞因子作为佐剂等。
对于颗粒抗原，免疫性较强，不需要加佐剂就可以获得很好的免疫效果。
以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1-2×107个细胞。
初次免疫时，抗原剂量为1×107/0.5ml，进行腹腔内注射，之后每隔2-3周进行一次免疫，剂量同初次免疫。
如果需要加强免疫，在融合前三天进行1×107/0.5ml的腹腔内或静脉内注射。
在细胞融合前的准备工作中，选择合适的骨髓瘤细胞系也是十分重要的。
骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样可以提高杂交融合率，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量的单克隆抗体。
在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖。
为了促进细胞的生长繁殖，需要加入其他活细胞，这些细胞被称为饲养细胞。
单克隆抗体制备技术的主要步骤
单克隆抗体制备技术的主要步骤单克隆抗体的制备，就像是一场科学的探险，充满了刺激和挑战，咱们从头说起。
得从小老鼠说起。
这小家伙可不是普通的宠物，而是咱们的英雄。
科学家会给它注射一些特定的抗原，这个抗原就像是个小小的“敌人”，让小老鼠的免疫系统开始工作，嘿，想想就有点好玩。
小老鼠体内开始产生各种抗体，搞得它好像身处战斗的第一线，真是个勇敢的小战士。
得等小老鼠慢慢“发威”，这些抗体就像是它的战斗力，越多越好。
经过一段时间后，咱们就能从小老鼠的体内提取到它的脾脏。
听起来是不是有点吓人？其实这就像是从老鼠身上“挖掘”出宝藏，没什么大不了的。
小老鼠的脾脏里含有大量的B细胞，这些B细胞可是产生抗体的主力军，简直就是抗体工厂。
一旦得到了脾脏，接下来就要把这些B细胞和一些肿瘤细胞融合在一起。
这个步骤可谓是“天生一对”，因为肿瘤细胞能在体外无限增殖，而B细胞则是抗体的“工匠”。
融合之后，咱们就得到了混合细胞，哎哟，真是个“好组合”。
这时候，有些细胞会自顾自地生活，有些则会变得非常专一，开始专门生产一种特定的抗体。
就像一个公司里的员工，有的人忙着做自己的事情，有的人却只关注某一项工作。
经过一番筛选，找到那些生产抗体的细胞，这个过程叫做“克隆”。
从一开始的“乱七八糟”到最后的“精英出战”，真是让人激动！每一批细胞都被放在特定的培养基里，细心照料，让它们茁壮成长。
这些小细胞们在培养基里就像小鱼在水里，游来游去，慢慢地，咱们就能从中筛选出那些最棒的抗体制造者。
咱们就得让这些优质细胞开始大量生产抗体。
把它们放进大大的培养罐里，给它们提供营养，让它们“好好干活”。
这时候，抗体就像流水线上的产品，源源不断地出来，真是让人看得眼花缭乱。
经过几天的忙碌，咱们就能得到一大桶一大桶的抗体，简直是喜从天降。
不过，光有抗体可不行，得把它们从培养液中提取出来。
这就需要一些“化学小把戏”了，用离心机把细胞和培养基分开，然后收集那些抗体。
提取出来的抗体就像是经过千辛万苦的矿工，终于挖到了宝藏。
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体内诱生法（IN ANIMALS） 体外诱生法（IN CELLS） 研究进展（RESEARCH PROGRESS）
体内诱生法
预处理：腹腔注射0.5ml液 态石蜡或降植烷 1~2周后
取Balb/c雌性 经产鼠若干只
接种10天左右 腹腔内接种1ml对数生长 期的杂交瘤细胞悬浮液
化代谢 OPTICELL 培养系统过程、控制抗体表达周期、
促进抗体表达和转运、翻译后加工等方面取得了较大进
展
谢谢大家
得到的单克隆抗体有限，不 能超过特定的细胞浓度
每天要换培养液，且细胞对 剪切力和环境非常敏感
会积累有毒的代谢产物
血清培养干扰抗体活性，影 响抗体分离，增加成本
牛初乳免疫球蛋白IgG单克隆抗体的制备
利用标准 IgG蛋白作为免疫原，免疫 6周龄 Balb/c 雌性小鼠，运用
淋巴细胞杂交瘤技术，通过间接 ELISA法筛选，采用有限稀释法，经 过 3次克隆筛选，获得2株稳定分泌抗 IgG蛋白的杂交瘤细胞株，单抗 细胞注射小鼠腹腔收集腹水；亚类鉴定试剂盒确定单抗细胞亚类；测 定收集小鼠腹水的抗体效价。
体内诱生法
1 随着分子生物学的飞跃发展，人—鼠嵌合抗体、人源化 抗体、完全人源性单克隆抗体应运而生 2 嵌合单克隆抗体和由转基因小鼠、噬菌体展示技术、核 糖体展示技术及共价展示技术所制备的单克隆抗体取得 了激荡人心的丰硕成果
体外诱生法
1 细胞培养用生物反应器有很大的发展：空纤维固定术、
徽胶囊术、空气升液器、生物反应大量培养术、恒化器 培养、OPTICELL培养系统 2 细胞表达抗体的研究在抗细胞凋亡、促细胞增殖、优
注射器抽取腹水， 得到大量单克隆抗体
腹水的杂交瘤细胞
Advantages
Disadvantages
可得到大量的腹水单抗
获的抗体浓度高 操作简便、经济
腹水中常混有小鼠的各种杂 蛋白（包括Ig），提纯困难 有污染动物病毒的危险 鼠源性单抗有抗原性，在人 体内产生人抗鼠抗体，降低 治疗效果又诱发变态反应
抗CPV-2a单克隆抗体的制备
纯化鼠,运用淋巴细
胞杂交瘤技术，间接 ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,采用有限稀释
法对阳性杂交瘤细胞进行3次亚克隆，得到4株稳定分泌单克隆抗体 的杂交瘤细胞，单抗细胞注射小鼠腹腔收集腹水；亚类鉴定试剂盒
确定单抗细胞亚类；测定收集小鼠腹水的抗体效价。
腹腔有自然吞噬作用，避免 组织污染造成的杂交瘤细胞 生长不良 腹腔本身为杂交瘤细胞良好 培养坏境，使其始终处于对 数生长期
体外诱生法 将杂交瘤细胞置于 培养瓶进行培养
一段时间
收集培养上清液
得到单克隆抗体
离心去除细胞及其碎片
Advantages
Disadvantages
减少鼠类动物疾病给产物带 来的污染 ; 避免鼠的其它抗体 的存在 过程可以工程化和自动控制 , 提高了重演性 可以采用单元操作法培养 , 随 着规模增大, 降低生产成本