细菌形态学检查法二
微生物检验基础知识汇总!
你需要的微生物检验基础知识汇总！一、分类细菌属于原核细胞型微生物。
最精确的方法为遗传学分类方法。
最常用的是经典传统分类法：根据细菌的亲缘关系，界门纲目科属种型株分类。
科：由共同关系的属组成，如肠杆菌科；属：是种的高一级分类单位，通常包含有共同特征或关系亲密的种，用以描述微生物的主要特征，如埃希氏菌属；种：是分类等级的基本单位，同一种微生物形态、生理学特征和组成成分基本相同，用以描述微生物的次要特征，如大肠埃希氏菌；菌株或品系：同一种微生物中不同来源的纯培育物，如大肠埃希氏菌CGMCC 1.3373。
二、细菌形态学及形态学检查法细菌形态结构主要指细菌的大小、外形、排列及超微结构。
细菌结构与其生理功能、致病性、免疫性有关。
2.1形态结构2.1.1基本形态3类：球菌、杆菌、螺旋菌，杆菌是最常见的形态。
2.1.2大小测量细菌大小的单位为微米m。
球菌以直径表示大小，杆菌以长与宽表示大小，同一种细菌在不怜悯况下大小形态也有差别：涂片干燥、固定、染色时细菌收缩；快速生长的球菌往往呈短杆状。
菌龄与细菌大小的关系受很多因素影响，主要与代谢废物的积累及培育基中渗透压上升等因素有关。
2.1.3结构基本结构：细胞壁、细胞膜、细胞质、核质；特别结构：鞭毛、菌毛、荚膜、芽孢等。
菌毛是什么？菌毛（Pilus）很多革兰氏阴性菌菌体表面遍布的比鞭毛更为细、短、直、硬、多的丝状蛋白附属器，也叫做纤毛（Fimbriae)。
其化学组成是菌毛蛋白（Pilin），菌毛与运动无关。
菌毛可分为一般菌毛(Commonpilus)和性菌毛(Sexpilus)两种。
一般菌毛长0.3～1.0um,直径7nm。
具有粘着细胞（红细胞、上皮细胞）和定居各种细胞表面的力量，它与某些细菌的致病性有关。
无菌毛的细菌则易被粘膜细胞的纤毛运动、肠蠕动或尿液冲洗而被排解，失去菌毛，致病力亦随之丢失。
性菌毛有的细菌还有1～4根较长的性菌毛，比一般菌毛而粗，中空呈管状。
性菌毛由质粒携带的一种致育因子（Ferility factor）的基因编码，故性菌毛又称F菌毛。
微生物试验-细菌的人工培养及形态学检查
实验一 细菌的人工培养
一、细菌在自然界的分布
1.空气中细菌的检查：每班两个血平板，标记 方法：在室内选择一处放一个平皿，揭开皿盖，
暴露放置10min，即盖上皿盖，放入37℃温箱 培养24小时，观察结果。
2.人体表面细菌的检查---手 指（每组1个平皿）
方法：取一普通平皿培养 基，一部分标记“前”， 另一部分标记“后”，然 后将手指在标记“前”的 部分沾一下，洗手后在标 记“后”的部分沾一下。 放入37℃温箱培养24h后 观察细菌的生长情况。
呼吸道咽部常驻菌群种类较多，正常人咽部需氧菌 中，甲型链球菌检出率最高，其次是奈瑟球菌属和表 皮葡萄球菌。
二、 理化因素对细菌的影响
1.物理因素对细菌的影响---紫外线
原理：紫外线主要作用于 DNA，使一条DNA链上相邻 的两个胸腺嘧啶以共价键结合成二聚体，从而干扰 DNA 的复制与转录导致细菌变异或死亡。
3.人体内部细菌的检查--咽喉部
方法：用“咳碟法”进行检查，取一个血琼脂平 皿培养基，打开平皿盖，置于口腔前约 10cm， 对着平皿咳嗽几次，标记时间，姓名，然后放 入37℃温箱培养24h后观察菌落特征。
二、外界因素对细菌的影响：
1.物理因素对细菌的影响 ：
紫外线：全班两份普通平板：一组大肠杆菌， 一组葡萄球菌，比较紫外线对G+，G-的抑制作 用。
满足a充足的营无菌
（三）分类：1、按物理性状
分类：
+0.3~0.5%琼脂
+1.5~2.5%琼脂
半固体培养基 液体培养基
固体培养基
观察细菌动力 大量繁殖细菌 细菌的分离和纯化
短期保存菌种
固体平板培养基
液体培养基
固体斜面培养基 半固体培养基
微生物免疫学实验报告
1实验内容：2显微镜油镜的使用与保护。
3细菌的形态与结构的观察。
4实验目的：5学会显微镜的使用，重点掌握油镜的使用与保护。
6进一步认识细菌的形态，明确细菌的大小与测量单位。
7熟悉细菌的特殊结构。
8实验材料：显微镜、擦镜纸、液体石蜡、消毒液、细菌的基本形态标本、细菌的特殊结构标本。
4实验方法：(1)显微镜油镜的使用与保护显微镜是一种贵重的光学仪器，而油镜又是显微镜的最精密部分，是观察细菌最重要的工具。
因此，要求大家必须熟练地掌握显微镜的使用和保护，尤其是油镜，避免损坏。
1识别油镜：95╳、100╳、HI、OeL。
2对光：自然光用平面反光镜，人工光用凹面反光镜；先用低倍镜对光，次用高倍镜。
对好光源后，染色标本将聚光器升高，光圈放开。
3、调节焦距：选一张细菌染色标本置于载物台上，用推进器固定，用低倍镜先找准物象，再用高倍镜看清物体，于标本上加镜油一滴。
⑴用眼从侧面观察，转动粗螺旋调节器，将油镜头徐徐下降浸入其中，切不可用力过猛，以免损坏油镜。
⑵用左眼从接目镜观察，徐徐向上转动粗螺旋调节器，见模糊物象后，再用细螺旋调节器，直到物象完全清晰为止。
4、显微镜的保护：⑴所有的光学部分结构都不能用手指、普通布擦拭，用过的油镜头应立即先用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭，再用干擦镜纸擦去二甲苯，以防二甲苯镜头上的固定胶，致使镜片脱落。
⑵显微镜的光学部分应避免日光直射。
避免接触强酸、强硷、氯仿、酒精。
⑶显微镜用毕，将物镜转成品字形并下降集光器和镜筒，用软布擦拭各部件后覆盖于接目镜上，双手端平送入镜箱内。
置于干燥处，以防受潮。
(二)细菌形态观察1、细菌的基本形态；球菌：肺炎球菌、脑膜炎球菌、葡萄球菌、链球菌杆菌：大肠杆菌、炭疽杆菌、结核杆菌、白喉杆菌弧菌：霍乱弧菌2、细菌的特殊结构：荚膜：肺炎球菌、产气荚膜杆菌鞭毛：水弧菌（周毛菌）一、实验内容：3细菌标本片的制备（操作）4革兰染色法（操作）二、实验目的：1进一步了解细菌特殊结构在鉴别细菌过程中的实用意义。
细菌的形态学检查常用的方法
细菌的形态学检查常用的方法
细菌的形态学检查是指通过观察细菌的形态、结构和大小来进
行分类和鉴定的方法。
常用的方法包括：
1. 显微镜观察，使用光学显微镜或电子显微镜观察细菌的形态
和结构。
通过放大细菌的形态特征，如形状、大小、细胞壁结构等
来进行分类和鉴定。
2. 染色法，常用的染色方法包括革兰氏染色、折射率染色、吉
姆萨染色等，这些染色方法可以使细菌在显微镜下更清晰地显示出
形态特征，有助于鉴定。
3. 形态培养特性，利用不同的培养基和培养条件，观察细菌在
不同环境下的生长特性和形态变化，如菌落形态、生长速度等。
4. 生化反应，通过观察细菌对不同生化试剂的反应，如碘试验、氧化酶试验等，来鉴定细菌的形态学特征。
5. 分子生物学方法，包括PCR、序列分析等技术，通过对细菌
的基因组进行分析，可以更准确地鉴定细菌的形态学特征。
综上所述，细菌的形态学检查常用的方法包括显微镜观察、染色法、形态培养特性、生化反应和分子生物学方法，这些方法可以从不同角度全面地观察和鉴定细菌的形态学特征。
细菌形态学检查法(一)
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------细菌形态学检查法(一)细菌形态学检查法(一) 细菌形态学检查法（一）细菌形态学检查是细菌检验的重要方法之一，不仅可以为后续的进一步检验提供参考依据，更重要的是可以通过细菌形态学检查迅速了解标本中有无细菌及菌量的大致情况；对少数具有典型形态特征的细菌可以作出初步诊断，为临床选用抗菌药物治疗起到重要的提示作用。
临床标本的细菌形态学检查方法主要包括染色标本和不染色标本的检查。
一、显微镜细菌体积微小，必须借助显微镜放大后才能观察。
细菌的一般形态结构可用光学显微镜观察，而细菌内部的超微结构则需用电子显微镜观察。
1．普通光学显微镜普通光学显微镜以可见光作为光源，波长 0.4～0.7m，最大分辨率 0．2m，约为波长的一半。
人肉眼能分辨的最小距离是 0．2mm，因此用油镜放大 1000 倍，0．2m 的微粒即被放大到肉眼可见的 0．2mm。
一般细菌都大于 0．m，故可用普通光学显微镜进行观察。
2．暗视野显微镜暗视野显微镜是在普通光学显微镜上装暗视野聚光器，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，背景视野变暗，菌体发亮。
观察时黑暗的背景中可见到发亮的菌体，明暗反差提高了观察效1 / 3果，常用于不染色标本的动力及运动状况检查。
3．荧光显微镜荧光显微镜以高压汞灯作为光源，能发出280～600nm波长的光线，主要在 365～435nm 之间。
根据使用荧光素的不同选择不同波长的光线作为激发光。
因其波长比可见光短，故分辨率高于普通光学显微镜。
细菌预先经相应的荧光素处理，然后置荧光显微镜下激发荧光，在暗色背景中可见到发荧光的菌体。
用于观察细菌的结构及鉴别细菌。
实验一细菌形态学检查
蒸气约5 min，冷后水洗，并用脱色液脱色2 min，水 洗 碱性美蓝复染30 s，水洗，干后用油镜镜检 结果：芽胞呈红色，菌体呈蓝色
实验操作
每组一套菌种： 葡萄球菌：革兰阳性球菌 大肠埃希菌：革兰阴性杆菌 真菌：孢子 变形杆菌：鞭毛染色（示教） 枯草杆菌：芽胞染色（示教）
革兰染色
结语
谢谢大家！
革兰染色-基本步骤
a)初染：结晶紫 1 min； b)媒染：碘液 1 min； c)脱色：95%乙醇
至无紫色脱落为止； d)复染：石碳酸复红 30
s，自然干燥后镜检
革兰染色-结果与注意事项
结果判断：紫色为革兰阳性菌、红色为革兰阴性菌 注意事项： 涂片不宜过厚 固定不宜过热 脱色是关键：脱色不够：革兰阴性菌 革兰阳性菌
实验一细菌形态学检查
【实验目的】
1． 掌握临床微生物实验室规则，生物安全及其它注 意事项。
2． 掌握显微镜油镜的使用和保护。 3． 熟悉显微镜的结构和各部分的功能。 4． 不染色和各种染色标本的显微镜观察。 5． 细菌特殊结构的染色与观察。
【实验内容】
光学显微镜的使用 不染色标本的检查 革兰氏染色和细菌基本形态观察 细菌特殊结构染色和观察
形态学检查的意义
细菌鉴定的重要手段，有助于细菌的初步分群 是决定采用何种生化反应的重要提示 初步诊断
✓ 结核涂片 ✓ 淋球菌涂片
显微镜的使用
先用低倍镜找出标本位置，再转用油镜 粗调 + 微调 香柏油的作用：玻片和空气密度不同，使部分光线经
空气折射后不能进入透镜，而香柏油的折光率与玻璃 相近，可使进入油镜的光线增多，视野光度增强，物 像清晰 镜头要保持清洁（可用二甲苯擦拭镜头）10~15 min 将玻片微倾斜，用蒸馏水一滴滴冲洗干净 将玻片直立使水分流尽，自然晾干，镜检 结果：菌体及鞭毛均为红色
细菌形态学检查法
•未脱色细菌呈红色为抗酸性细菌 •脱色经复染呈蓝色为非抗酸性细菌
3.其他染色方法（1）源自毛染色 （2）荚膜染色细菌形态学检查法
重点提示
• 不染色标本的形态学检查 • 染色标本的形态学检查
– 革兰染色 – 抗酸染色
一、显微镜
1.普通光学显微镜（light microscope）
– 光源：可见光
2. 暗视野显微镜（ dark field microscope ）
– 暗背景，菌体发光 –用于检查不染色的活细菌和螺旋体的形态及运
1.革兰染色（Gram staining） （1）原理
– 细胞壁学说：两种细菌细胞壁结构不同-G+菌肽 聚糖层厚、致密，脂质含量少；G-菌薄而疏松， 脂质含量多。
– 等电点学说： G+菌pI 2～3； G-菌pI 4～5 – 化学学说： G+菌含有核糖核酸镁盐多， G-菌
含量少。
三、细菌染色标本的检查-革兰染色
（2）结果
– 细菌分为革兰阳性（G+）菌和革兰阴性（G-）菌
紫色为革兰阳性菌，红色为革兰阴性菌
革 兰 染 色 方 法
三、细菌染色标本的检查
2.抗酸染色
（1）原理：分枝杆菌细胞壁含脂质较多，其中主要 成分为分枝菌酸，此物具有抗酸性，染色时与石 炭酸复红结合牢固，能抵抗酸性乙醇的脱色作用， 因此抗酸菌能保持复红的颜色，达到初步鉴别细 菌的目的。
复红、刚果红等。
3.中性染料：碱性染料与酸性染料的复合物，如瑞
氏染料、姬姆萨染料等。
三、细菌染色标本的检查
(二)常用染色方法 • 单染色法
– 只用一种染料，如吕氏美蓝。用于观察细菌的 形态、大小、排列。
细菌的形态学检查
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革兰染色法
结晶紫、碳酸钠初染，30秒 碘液媒染30秒
丙酮酒精数滴，脱色约5秒
碱性复红液2~3滴，5秒钟
待干，镜检。
注：每一步均需 细流水冲洗。
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• 油镜观察结果1000倍
放大倍数：10×100
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• 白色念珠菌革兰染色1000倍
放大倍数：10×100
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革兰氏染色意义：
注明 菌名：大肠杆菌 染色法： 放大倍数：10×100
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细菌形态示意图绘图要求
绘细菌的
形态 排列 染色性 特殊结构
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1.涂片
① 接种环置于酒精灯的外焰中烧灼灭菌。
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（二）细菌涂片标本的制备
1.涂片
② 取1~2环生理盐水（NS)置于载玻片上，接种 环用火焰烧灼灭菌。
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（二）细菌涂片标本的制备
1.涂片
③ 小指和手掌小鱼肌侧拔掉棉塞，并烧灼试管口灭菌。 用已灭菌冷却的接种环伸入试管中取适量菌，注意勿使沾 有菌液的接种环触及试管壁及试管口。
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（二）细菌涂片标本的制备
3.固定
目的：使细菌蛋白变性，菌 体牢固黏附于玻片上，还可杀 死细菌。
玻片有菌膜一面向上，在火焰的外焰钟摆 样速度通过三次，时间约3秒钟。
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革兰染色法操作步骤：
• 初染 媒染 脱色 复染
初染（结晶紫.碳酸钠） 媒染（碘液）
脱色（95%乙醇） 复染（复红）
• 玻璃折射率： n=1.52
• 香柏油折射率： n=1.515
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二、细菌标本染色检查法
技能点13病料中细菌的形态学检查.
国家高等职业教育畜牧兽医专业教学资源库《动物微生物与免疫技术》技能点13 病料中细菌的形态学检查
实训目标
1．病料中细菌的形态学检查实验目标：
通过观察病料中是否有菌，从而初步判断病料是否取自细菌感染病例。
若病料中有菌，根据细菌形态初步鉴定其种类
2．病料中细菌的分离培养实验目标：
用鉴别培养基分离培养后，看是否得到菌落。
若有菌落生长，则根据菌落特征进一步鉴定细菌种类。
仪器及材料疑似大肠杆菌病料、镊子、剪刀、玻片、酒精灯、染色缸及染色架、美兰染液、吸水纸、擦镜纸、香柏油、乙醇乙醚、洗瓶、烙刀、接种环、麦康凯平板、记号笔、温箱、酒精灯等
方法与步骤
1．触片以无菌剪刀、镊子剪取被检组织一小块，以其新鲜切面在玻片上做数个压印或涂抹成适当大小的一薄层。
2．干燥涂片应在室温下自然干燥，必要时将涂面向上，置火焰高处微烤加热干燥。
3．固定火焰固定是最常用的方法，将干燥好的抹片涂面向上，在火焰上来回通过数次（一般4～6次），以手背触及玻片微烫手为宜。
4．美蓝染色在已固定好的抹片上，滴加适量美蓝染色液覆盖涂面，染色2～3min，水洗，晾干或吸水纸轻压吸干和镜检，结果菌体呈蓝色。
细菌的形态检查主要有哪几种方法 _
细菌的形态检查主要有哪几种方法 ?说起细菌，大家都不陌生，随着科技的高速发展，细菌逐渐走进了人们的生活，无论是男女老少，对于细菌都或多或少知道一些常识。
例如面团需要发酵，则需要酵母；酸奶需要乳酸菌才能变得可口；酒在醋酸菌的作用下才能成为调味品——醋；而腹泻是因为大肠杆菌作祟等等。
更有文章指出人类身体表面细菌覆盖率高达90%！可见，细菌与人们的生活关系十分密切，那么细菌究竟是何方神圣呢？细菌最早是被科学家列文虎克在一位从未刷过牙的老人牙垢上所发现的，只不过那时人们认为细菌是自然界已有的生物。
直到后来，在巴斯德实验之后，人们才知道，细菌是由空气中已有细菌产生的，而不是自行产生，人们才慢慢终于揭开了这位神秘人物的面纱。
1 细菌的构造及其繁殖细菌的结构包括基本结构和特殊结构。
细菌都具有的普遍结构即基本结构，如细胞壁、细胞膜、细胞质以及核质。
而某些细菌特有的结构称为特殊结构，包括细菌的荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢等。
每一种结构都各司其职，有其独特的作用，例如鞭毛是某些细菌的“双腿”。
可以让细菌来去自如；荚膜可以保护细菌不被白细胞吞噬，抵御外部的不利环境等。
按照不同的分类依据，细菌可以被分成许多类型。
按细菌的生活方式来分类，细菌可以分成自养菌和异养菌，其中异养菌包括腐生菌和寄生菌；根据形状可以分为球菌、杆菌和螺旋菌（包括弧菌、螺菌、螺杆菌）；按细菌生存温度分类，可分为喜冷、常温和喜高温三类。
另外，细菌的繁殖速度极快，这是由它们独特的繁殖方式所决定的，即无性二分裂(裂殖)：细菌生长到一定时期，在细胞中间逐渐形成横隔，由一个母细胞分裂为两个大小相等的子细胞。
一般细菌约20到30分钟便分裂一次，即为一代。
不难想象，若是环境适宜，且时间充分的条件下，细菌的繁殖会有多么迅速！用不了多久，世界都是细菌的“殖民地”了。
2 细菌的形态检查方法什么是细菌形态检查？细菌形态检查就是对细菌的菌体形态和菌群的形态进行观察，进而对所检查的细菌的类型进行归属和划分菌属的检查方法。
微生物学实验报告
微生物学实验报告实验一普通光学显微镜的使用及细菌染色与形态观察第一部分：显微镜的使用一、目的要求1．熟悉普通光学显微镜的构造、油镜的使用原理和显微镜的维护方法。
2．学会正确使用油镜观察细菌的基本形态和特殊构造。
3．了解各种显微镜的主要特征。
二、实验原理（一）光学显微镜的构造微生物实验室中最常用的是普通光学显微镜，它的构造可分为机械部分和光学部分。
1、机械部分普通复式光学显微镜的机械部分通常包括以下几个部分：目镜、镜筒、基座回转器、物镜、载物台、光圈、聚光器、光源、镜臂、细调节器、粗调节器等。
2、光学部分：目镜、物镜、聚光器、光圈、光源。
（二）放大倍数标本首先经物镜放大，在目镜的焦距平面上形成一个实像，再经过目镜放大成最终的虚像。
总的放大倍数是物镜放大倍数与目镜放大倍数的乘积。
物镜的放大倍数愈大，其工作距离（物镜镜头到标本片之间的距离）愈短，这时光圈就要打开得愈大。
显微镜的性能受物镜的分辨距离或分辨力所限制。
分辨距离即透镜所能分辨的两个物点之间的最小距离，分辨距离愈小，透镜的分辨力愈高，物像也就愈清晰。
因此常以分辨距离来衡量显微镜的分辨力。
R=0.61λ/N.A式中：R-----分辨距离；λ------作用光的波长；N.A------数值口径。
一些介质的折射率介质折射率空气水玻璃香柏油1 13 55 1.56三、实验内容（一）材料：显微镜，香柏油，擦镜纸。
（二）方法：细菌很小，须使用油镜方可观察到。
油镜是显微镜上最重要的部件之一，观察时与玻片非常接近，稍不小心即可压碎玻片，更严重的是损坏镜头，故必须极其仔细地学习油镜的使用方法：1、为使低倍镜取得最适之光源，可将低倍镜头调节到离载物台约1cm的高度，将聚光器提高，光圈完全打开，然后调节电压旋钮至视野最合适。
2、滴一滴香柏油，固定于载物台上，用推动器调节到载物台正中。
在双目侧视下，下旋粗调节器，使油镜头浸入油中几乎与标本片相接触。
然后眼睛从目镜观察（如光线不足，可适当增大电源电压），徐徐上旋粗调节器至看到模糊物像之后，再用细调节器调节以使物像清晰。
细菌鉴定及检测方法
细菌鉴定及检测方法细菌是一类微生物，其病原性和耐药性等特性对人类健康和环境安全有着重要影响。
因此，准确的细菌鉴定和检测方法对于疾病诊断、食品安全、环境监测以及抗生素治疗等领域至关重要。
本文将详细介绍常用的细菌鉴定和检测方法。
一、细菌鉴定方法1.形态学鉴定：通过观察细菌的形态特征，如细胞形状、大小、颜色等，可以初步判断其属于哪一类菌。
这种方法主要适用于形态特征非常典型的细菌。
2.染色法鉴定：常用的细菌染色方法有革兰氏染色、抗酸染色等。
革兰氏染色可以根据细菌的细胞壁特性将其分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类。
抗酸染色适用于检测酸忍受性细菌，如结核分枝杆菌等。
3.生理生化特性鉴定：这是一种常用的鉴定细菌的方法，通过观察细菌对特定物质的代谢反应，例如对糖、气体等的发酵、氧要求等，可以初步确定细菌的鉴定组。
4.分子生物学鉴定：分子生物学方法可以通过提取细菌基因组DNA或RNA，利用PCR扩增、序列分析、16SrRNA测序等技术，从而精确确定细菌的鉴定种属。
分子生物学方法具有高度的特异性和敏感性，广泛应用于细菌鉴定中。
二、细菌检测方法1.培养法：这是一种常用的细菌检测方法，通过在富含营养物的培养基上培养细菌，并根据菌落形态、色素、气体产生等进行初步鉴定。
培养法可以用于检测食品、水源、空气中的细菌等。
然而，一些特殊的细菌可能无法在常规培养条件下生长，所以培养法在一些情况下可能会有限制。
2.免疫学方法：包括免疫荧光、酶联免疫吸附试验（ELISA）等技术。
这些方法利用细菌表面特异的抗原与特定抗体的结合反应来检测细菌，并通过检测结果的颜色或荧光信号来判断细菌是否存在。
免疫学方法具有高度的特异性和灵敏性，适用于检测特定细菌的存在或细菌相关的抗体等。
3.分子生物学方法：分子生物学方法在细菌检测中也起着重要作用。
PCR和实时荧光PCR是常用的检测细菌DNA的方法，可以通过特定引物和探针分别扩增和检测目标细菌的DNA。
此外，基于DNA测序技术的全基因组测序也可用于快速鉴定和检测细菌。
细菌标本形态学检验
细菌标本形态学检验形态学检查方法是细菌检验中极为重要的鉴定手段之一，它不仅有助于细菌的初步识别，同时也是决定进行生化反应鉴定的重要步骤。
如痰中的抗酸杆菌、脑脊液中脑膜炎球菌、泌尿生殖道分泌物中的淋球菌等。
通过形态学检查得到初步的诊断。
由于细菌体积小，无色透明，因此利用光学显微镜直接检查只能观察到细菌的动力，对形态、大小、排列方式、染色特性及特殊结构的判定，还须借助于染色标本的观察。
要研究其细菌的超微结构，还需用电子显微镜。
一、不染色标本检查法不染色标本的检查用于观察活菌状态，常用以检查细菌的动力或运动状况。
1．湿片法：用接种环取细菌培养液两环，置于载玻片中央，轻轻覆以盖玻片。
菌液要适量，不可外溢，不可有气泡。
高倍镜下观察。
2．悬滴法：加一小滴菌液在盖玻片中央，在另一凹玻片凹窝的周围涂少量凡士林，将凹面向下，对准盖玻片中央，盖在凹玻片上，迅速翻转玻片，用小镊子轻压，使盖玻片与凹玻片粘紧，密封凹窝边缘。
高倍镜下观察。
3．毛细管法：本法适用于观察厌氧菌动力。
先将待检菌接种在适宜的液体培养基中，经厌氧过夜培养后，以毛细管（长60～70nm ，管径0．5 ～1．0nm ）接触培养物，使菌液进入毛细管中，用火焰封闭毛细管两端，将毛细管固定在载玻片上，镜检。
二、染色标本检查法（一）基本方法细菌胞浆无色透明，不易识别。
常用适宜的染料使细菌着色后，以观察其形态和特殊构造，且可按染色反应进行分类。
1．原理（1）物理吸附作用：由于毛细管现象和渗透作用，使染料进入细胞内被溶解吸收。
此外，细菌等电点较低，pH值2 ～5，在一般情况下细菌带负电荷，易和带正电荷的碱性染料相结合。
（2）化学反应：菌体内某些化合物和染料相结合，发生化学反应使细菌着色，而且不易被脱色剂所脱色。
（3）其他因素：细胞膜的通透性、膜孔的大小、细胞结构完整与否以及培养基成分，染色液中电解质含量、pH值、菌龄等都是影响细菌着色的因素。
2．方法（1）涂片：临床标本大多可直接涂抹在洁净的载玻片上。
实验二++细菌的形态学检查(1)
实验二细菌的形态学检查【目的和要求】1．熟悉细菌染色的常用染料和一般程序。
2．掌握革兰染色的方法、原理、结果观察及意义。
3．熟悉不染色标本检查法（压滴法和悬滴法）的方法与结果观察。
4．熟悉细菌的特殊染色法。
【试剂与器材】1．菌种：葡萄球菌、大肠埃希菌。
2．试剂：革兰染色液、细胞壁染色液、芽胞染色液、鞭毛染色液、生理盐水等。
3．其他：载玻片、接种环、酒精灯、显微镜、香柏油、蜡笔、擦镜纸、脱油剂等。
【实验内容】一、细菌染色的一般程序细菌染色法分单染法和复染法。
单染法是用一种染料去染，所有细菌都染成一种颜色；复染法是用多种染料对细菌进行染色，不同细菌可染成不同的颜色。
大部分细菌染色的基本程序相同，即：涂片→干燥→固定→染色，根据实验目的选择不同的染色方法，在实际工作中，应用最广泛的是革兰染色法。
二、革兰染色1．染色原理（1）等电点学说：革兰阳性菌的等电点（pI2～3）比革兰阴性菌（pI4～5）低，在同一pH条件下革兰阳性菌带负电荷比革兰阴性菌要多，与带正电荷的碱性染料（结晶紫）结合性牢固，不易脱色。
（2）化学学说：革兰阳性菌含有大量的核糖核酸镁盐，与进入胞浆内的结晶紫和碘牢固结合成大分子复合物，不易被95%酒精脱色；而革兰阴性菌含此种物质少，故易被乙醇脱色。
（3）通透性学说：革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层较厚，含脂质少，脱色时，乙醇不易进入，而且95％乙醇可使细胞壁脱水，细胞壁间隙缩小，通透性降低，阻碍结晶紫和碘复合物渗出。
而革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层较薄，含脂质多，易被乙醇溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫与碘复合物易被溶出而脱色。
2．方法（1）涂片：取清洁无油迹的载玻片1张，用蜡笔划线将其分成左右两格。
用接种环先挑取生理盐水1~2环于载玻片每格中央，再分别挑取大肠杆菌和葡萄球菌少许菌落与生理盐水研匀，涂成直径约1.5cm的菌膜。
（2）干燥：让涂片自然干燥，也可在酒精灯火焰较远处微微加热烘干，但切勿靠近火焰。
细菌学检验ppt课件
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二、染色标本
（一）常用染料 1．碱性染料：碱性复红、结晶紫、美蓝等 2．酸性染料：有伊红、刚果红等 3．复合染料（中性染料）及荧光染料：复合染料有
瑞氏染料（伊红美蓝）、姬姆萨染料（伊红天青） 等；荧光染料有荧光标记的抗体
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革兰染色（gram stain） 方法：
（二）常用的染色方法
1、结晶紫初染
1 min
2、卢戈氏碘液媒染 1 min
革兰阳性球菌
3、95％酒精脱色 30sec～1 min
4、稀释石炭酸复红复染 1 min
原理：
G+等电点低，带正电荷的碱性燃 料作色牢固
G+细胞壁肽聚糖层多，G-细胞壁 脂质含量高
G+含有多量核糖核酸镁盐与结晶 紫、碘结合成大分子复合物
革兰阴性杆菌
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(一)培养基的组成成分
1．营养物质 蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖类、醇类、血液、 无机盐类、鸡蛋和动物血清生长因子
2．凝固物质 琼脂、明胶、卵白
3．抑制剂和指示剂 胆盐、蔷薇酸等，酚红、中性红、溴甲酚紫等
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（二）培养基种类
1．基础培养基（based medium） 2．营养培养基（nutrient medium） 3．鉴别培养基（differential medium） 4．选择培养基（selective medium） 5．特殊培养基（special medium）
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1．基础培养基（based medium）
含有大所属细菌生长所需 的基本营养成分，最常用的是 肉浸液，俗称肉汤（broth）， 主要成分含牛肉浸液和蛋白胨。 用于培养一般细菌
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细菌形态学检查法（二）
三、染色标本的检查细菌标本经染色后，不仅能清晰地看到细菌的形态、大小及排列方式，还可根据染色结果将细菌进行分类。
染色标本与周围环境在颜色上形成鲜明对比，可在普通光学显微镜下进行观察。
一般形态学检查均需染色。
（一）常用染料用于细菌染色的染料，大部分是人工合成的含苯环的有机化合物，在其苯环上带有色基和助色基。
色基赋予化合物颜色，助色基可增加色基与被染物的亲和力。
助色基有的为碱性（如一NH2），有的为酸性（如一0H），因此助色基的性质决定染料的酸碱性。
常用染料一般均难溶于水，易溶于有机溶剂，实验室配制时通常制成盐类水溶液。
1•碱性染料常用的碱性染料有碱性亚甲蓝、结晶紫及碱性复红等，这些染料电离后色基带正电荷，易与带负电荷的被染物结合。
多数细菌等电点（pl）在2〜5
之间，在中性、碱性以及弱酸性环境中都带负电荷，易被碱性染料着色，故细菌学检查中常用此类染料。
2.酸性染料常用的有伊红、酸性复红及刚果红等，这些染料电离后色基带负电荷，不易与细菌结合，不常用于细菌染色。
必要时可降低菌液的pH，使细菌带正电荷，方可着色。
3.中性染料是碱性染料与酸性染料的复合物，如瑞氏染液中的伊红亚甲蓝、吉姆萨染液中的伊红天青等，可用于较特殊染色技术。
（二）常用的细菌染色法根据所用染料是一种还是多种，细菌染色法分为单染色法和复染色法。
单染色法是用一种染料染色，细菌涂片染成同一颜色，可观察到形态、大小及排列等特点，但不能显示细菌染色特性。
复染色法是用两种或两种以上染料进行染色，将不同细菌或同一细菌的不同结构染成不同颜色。
复染色法不仅可以观察细菌的形态结构，还可根据染色反应鉴别细菌，故又称鉴别染色法。
临床常用的主要有革兰染色和抗酸染色。
革兰染色本法是细菌学检验中最经典、最常用的染色方法，沿用至今已有百余年历史，是一种包括初染、媒染、脱色和复染的鉴别染色技术。
通过此染色法，可将细菌分为革兰阳性（G +）菌和革兰阴性（G —）菌两大类，并可初步识别细菌，缩小范围，有助于进一步鉴定。
有时结台细菌特殊形态结构及排列方式，对病原茵可做出初步鉴定。
革兰染色的原理至今尚未完全清楚，有以下几种学说：① 细胞壁学说：G+菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入，G—菌细胞壁结构较疏松，肽聚糖层少，脂质含量多，乙醇易渗入；②等电
点学说：G+菌的等电点低（pl 2〜3）, G—菌等电点较高（pl4〜5），在相同pH 条件下，G+菌所带负电荷比G —菌多，与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固且不易脱色；⑧化学学说：G+菌细胞内含有大量核糖核酸镁盐，可与结晶紫和碘牢固地结合成大分子复合物，不易被乙醇脱色，G —菌细胞内含极少量的核糖核酸镁盐，吸附染料量少，形成的复合物分子也较小，故易被乙醇脱色。
目前认为，细胞壁结构与化学组成上的差异是染色反应不同的丰要原因。
革兰染色可用于菌落涂片和标本涂片。
菌落涂片不仅可观察细菌的形态染色特点，更重要的是可以为后续选择合适的鉴定程序提供参考依据。
另外，由于G+
菌和G—菌细胞壁结构存在很大差异，对一些抗生素表现出不同的敏感性，且二者产生的致病物质及作用机制不同，因此革兰染色尚可为临床选择用药提供参考，帮助临床制定有针对性的治疗方案。
在临床上除少数标本（如粪便、血液）外，绝大多数标本在分离培养前都要进行革兰染色。
2.抗酸染色抗酸染色是细菌着色后不被盐酸乙醇脱色的染色方法，其中最具代表性的是萋-尼染色法。
经此法染色可将细菌分为抗酸性细菌和非抗酸性细菌两大类。
由于临床上绝大多数细菌为非抗酸性细菌，所以抗酸染色不作为临床上常规的细菌检查项目，只针对性用于结核病、麻风病等疾病的细菌检查。
疑似结核分枝杆菌感染的标本，经抗酸染色后在油镜下观察，根据所见结果报告找到（或未找到）抗酸菌”可作出初步鉴定。
另外，若改变脱色剂，诺卡菌属亦可呈弱抗酸性。
目前认为，抗酸染色性的差异可能与菌体中所含的分枝菌酸、脂类等成分有关。
3.荧光染色荧光染色是用能够发荧光的物质对标本进行染色，在荧光显微镜下观察发荧光的细菌。
此法具有敏感性强、效率高、结果易于观察等特点，故在临床细菌鉴定中有很大的应用价值。
目前主要用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等病原菌的检测。
如痰标本涂片、固定后用荧光染料金胺0法（也称金胺0-罗丹明B 法）染色，在荧光显微镜下可观察到是金黄色荧光的菌体。
4.负染色是一种使标本的背景着色而细菌不着色的染色方法。
常用染液有墨汁，也可用酸性染料如刚果红、水溶性苯胺黑等，因酸性染料带负电荷，故菌体不着色，只能使背景着色。
实际工作中还可用墨汁负染色法配合单染色法（如吕氏亚甲蓝）检查细菌的荚膜，镜下可见黑色背景中蓝色菌体周围包绕一层无色透明的荚膜。
5 .特殊染色细菌的特殊结构如芽胞、鞭毛及荚膜等和其他结构如细胞壁、核质及胞质颗粒等，用普通染色法均小易着色，必须用相应的特殊染色才能染卜颜色。
常用的特殊染色法有细胞壁染色、荚膜染色、芽胞染色、鞭毛染色及异染颗粒染色等。
鞭毛染色后在显微镜下不仅可以观察到有无鞭毛，还可进一步观察到鞭毛
的位置以及数量，在细菌鉴定，尤其是非发酵菌的鉴定中具有重要价值。
荚膜染色用于有荚膜细菌的鉴定，如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、炭疽芽胞杆菌及产气荚膜梭菌等的鉴定。
异染颗粒主要用于白喉棒状杆菌的鉴定，如疑为白喉棒状杆菌感染，进行涂片检查，除证实为革兰阳性典型棒状杆菌外，尚需用异染颗粒染色检查有无异染颗粒，若有方可初步报告检出形似白喉棒状杆菌”，为临床早期诊断提供依据。