蛋白质的提取方法

沉淀法分级蛋白质：

水溶性蛋白质分子表面带有亲水性基团，因此很容易进行水合作用，顺利进入水溶液中。如果溶液的pH偏离等电点，则所有分子会带相同电荷，这进一步增进了它们的分散能力。因此，凡是能破坏蛋白质分子水合作用或者减弱分子间同性相斥作用的因素，都可能降低蛋白质在水中的溶解度，使其沉淀。常用的方法有盐析法和有机溶剂法。

（一）盐析法向蛋白质水溶液中加入中性盐，可以产生两种影响：一是盐离子与蛋白质分子中的极性和离子基团作用，降低蛋白质分子的活度系数，使其溶解度增加。在盐浓度较低时以这种情形为主，蛋白质表现为易于溶解，称为盐溶现象；二是盐离子也与水这种偶极分子作用，使水分子的活度降低，导致蛋白质水合程度的降低，使蛋白质溶解度减少。在盐浓度较高时这种情形起决定性作用，蛋白质便会沉淀，称为盐析现象。采用加入中性盐的方法使各种蛋白质依次分别沉淀的方法称为盐析法。

各种离子盐析能力的强弱可用Hofmeister序列表示：

PO4>SO4>C2O4>(CHOHCOO)2>AC>Cl>NO3, K>Rb>Na>Cs>Li>NH4

实际工作中，常用的盐析剂是硫酸铵，因为它盐析能力强，在水中溶解度大，价格便宜，浓度高时也不会引起蛋白质生物活性的丧失。硫酸铵浓溶液的pH约为5.5，配置硫酸铵饱和溶液时，可在水中加过饱和量的硫酸铵，加温至50℃，至大部分盐溶解，室温放置过夜后，再用NaOH或硫酸调所需pH。

（二）有机溶剂沉淀法在等电点附近，蛋白质分子主要以偶极离子形式存在。这时如果添加有机溶剂，由于有机溶剂有较低的介电常数，会使溶液介电常数减小，根据库伦定律，这样会增强偶极离子之间的静电引力，从而使分子聚集沉淀。另一方面，有机溶剂本身的水合作用会破坏蛋白质表面的水合层，也促使蛋白分子脱水沉淀。选用有机溶剂的原则是：1.必须能与水完全混溶；2.不与蛋白质发生反应；3.要有较好的沉淀效应；4.溶剂蒸汽无毒，且不易燃。丙酮和乙醇是使用最为广泛的两种有机溶剂。在低介电常数环境中，蛋白质分子基团间的作用力会受到影响，超过限度时会使蛋白质变性。因此，有机溶剂沉淀法一般都要在低温下进行。蛋白质分子本身是多价离子，对溶液介电常数有相当贡献。当蛋白浓度太低时，如添加有机溶剂过度会产生变性现象，若这时加入介电常数大的物质（如甘氨酸），可避免蛋白变性。蛋白浓度高时，介电常数也相应提高，可以减少蛋白变性。

（三）有机聚合物沉淀法除了盐和有机溶剂能使蛋白质沉淀外，水溶性中性高聚物也能沉淀蛋白质。分子量高于4000的PEG可以非常有效地沉淀蛋白质。最常用的使分子量6000和20000的PEG。PEG可以看作是聚合的有机溶剂，其作用原理可能与有机溶剂类似。聚丙烯酸可以沉淀带正电蛋白质。聚丙烯酸分子上有相当多的羧基，碱性蛋白质含较多的碱性基团，羧基和碱性基团形成盐键，则把聚丙烯酸和碱性蛋白结成成很大颗粒沉淀下来。沉淀时碱性蛋白与溶液分开，加入钙离子后，聚丙烯酸成钙盐，蛋白质则游离出来。