PBMC细胞分类与不同细胞比例

合集下载

PBMC提取

PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ＼Ｂ），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。

其中淋巴细胞占很大一部分。

分离ＰＢＭＣ的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。

Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml 仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。

红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。

吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。

注意事项全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层，但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。

分离PBMC第一步离心的时候，一定不能设置或设置低水平的制动。

否则将分层混乱。

步骤：配制所需的溶液：a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；c.将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；d.取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。

然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液；2,000rpm，20min，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。

离心完毕将得到如图所示分层；PBMC所在细胞层为白色。

此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml 离心管中。

e.加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min离心后去掉上清，再加入培养基进行相同操作的清洗；f.加入5-10ml培养基重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板；g.细胞冻存：将细胞离心收集之后，用细胞冻存液重悬。

人外周血单核细胞(PBMC)分离及培养

PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ＼Ｂ），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。其中淋巴细胞占很大一部分。分离ＰＢＭＣ的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。
Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
③取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液；
④2,000rpm，20min，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。离心完毕将得到如图所示分层；
双抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)
二甲亚砜（DMSO）（SIGMA）
预先装好异丙醇的冻存盒
方法/步骤：
①配制所需的溶液：
a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；
b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；
②将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；
⑤PBMC所在细胞层为白色。此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml离心管中。

pbmc写作

pbmc写作
PBMC就是外周血单个核细胞的英文缩写，外周血单个核细胞主
要包括两大类细胞，分别是淋巴细胞和单核细胞，其中淋巴细胞又包括T淋巴细胞，B淋巴细胞和NK细胞。

其中T淋巴细胞是比例最多的淋巴细胞类型，在胸腺中发育成熟，主要功能就是执行人体的细胞免疫功能，在人体的免疫监视中发挥着重要的作用。

B淋巴细胞属于人体的执行体液免疫功能的细胞，B淋巴细胞受
抗原刺激以后，能够发育成熟为浆细胞，可以分泌各种抗体，发挥体液免疫功能NK细胞是人体非特异性免疫细胞，也在免疫监视中发挥
着重要作用。

单核细胞属于白细胞的一种，从血液中逸出到组织中就变成了吞噬细胞，也称为巨噬细胞，在人体的非特异性免疫功能中发挥着重要的作用。

PBMC细胞分类及不同细胞比例

20ml血液大概提取6PBMCPBMC（外周血单个核细胞）包含淋巴细胞（ T、B、NK）、单核细胞和树突状细胞。

在人体中这些细胞的比率因人而异。

在多半研究中，淋巴细胞约占PBMC的70～90％，单核细胞约为10～30％，树突状细胞特别少，约为1～2％。

对此中占多半的淋巴细胞进一步细分，可发现此中70～85％为CD3＋T细胞（折算成PBMC的比率约45～70％），5～20％为B细胞（折算成PBMC的比率约15％），5～20％为NK细胞（折算成PBMC的比率约15％）。

CD3＋T细胞由CD4＋T细胞（约占PBMC25～60％）和CD8＋T细胞（约占PBMC5～30％），比率约2：1。

CD4＋和CD8＋T细胞均可进一步分为初始T（naiveT）、接触过抗原的中心记忆性、效应记忆性和效应性T细胞。

关于这些亚群，因为不一样研究使用的标志不一样，故比率亦相差较大。

CD4＋T细胞又称为协助性T细胞，可依据细胞因子表达的不一样而持续分为不一样的功能亚群，包含调理性T细胞、Th1、Th2、Th17、Th9、滤泡协助性 T、TR1等亚群。

这些亚群的划分只会愈来愈复杂。

CD8＋细胞毒性T细胞此刻可大概分为200个功能表型。

循环B细胞包含过渡型、未致敏、记忆型以及浆母细胞，各个亚群比率不一。

循环树突状细胞包含浆细胞样树突状细胞和髓系来源树突状细胞。

循环单核细胞可分为经典型单核细胞和非经典型CD16＋促炎症反响单核细胞（约占单核的10％）。

人类免疫系统功能研究极其依靠PBMC的表型和功能评估，所以对外周血各种亚群表型和功能、PBMC与组织免疫细胞的不一样进行充足认识是特别必需的。

pbmc中的细胞分类

pbmc中的细胞分类PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cell）是从外周血中分离出的一类细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞。

这些细胞在免疫系统中起着重要的作用，参与免疫应答、抗感染和维持免疫平衡等过程。

本文将对PBMC中的细胞分类进行详细介绍。

一、淋巴细胞淋巴细胞是PBMC中最主要的细胞类型，占据了白细胞总数的70-90%。

淋巴细胞可进一步分为T细胞、B细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）。

1. T细胞：T细胞是淋巴细胞中最重要的一类细胞，它们在免疫应答中起着关键作用。

T细胞可以进一步分为CD4+和CD8+两个亚群。

CD4+ T细胞（辅助性T细胞）主要参与调节免疫应答，激活和增强其他免疫细胞的功能。

CD8+ T细胞（细胞毒性T细胞）则直接杀伤被感染的细胞。

2. B细胞：B细胞是淋巴细胞中的另一重要成员，主要负责产生抗体以应对感染。

当B细胞受到刺激后，会分化为浆细胞，产生大量的抗体来中和病原体。

3. NK细胞：NK细胞是一类重要的免疫细胞，可以直接杀伤肿瘤细胞和病原体感染的细胞。

NK细胞的活性受到多种调节因子的影响，可以通过释放细胞毒素和识别目标细胞表面的抗原来发挥作用。

二、单核细胞单核细胞是PBMC中的另一重要组成部分，占据了白细胞总数的5-10%。

单核细胞具有吞噬和抗原呈递的能力，在免疫应答中发挥重要作用。

单核细胞可以进一步分化为巨噬细胞和树突状细胞。

1. 巨噬细胞：巨噬细胞是一类具有吞噬功能的细胞，主要负责清除病原体和死亡细胞。

巨噬细胞通过吞噬病原体并分泌炎症介质来激活其他免疫细胞，参与免疫炎症反应。

2. 树突状细胞：树突状细胞是一类具有抗原呈递能力的细胞，主要负责激活T细胞和促进免疫应答。

树突状细胞通过摄取和处理抗原，并将其呈递给T细胞，从而引发免疫反应。

三、浆细胞浆细胞是PBMC中的一类细胞，占据了白细胞总数的1-3%。

浆细胞是B细胞分化的产物，主要负责分泌抗体来中和病原体。

人PBMC中的细胞类型

Types of immune cells present in human PBMCPosted on November 22, 2012by Andrea in PBMC Basics with 1 CommentWhen peripheral whole blood is drawn for human immune system studies, it is often processed to remove red blood cells by density gradient centrifugation. Most commonly this method uses Ficoll Paque, a solution of high molecular weight sucrose polymers, a product of GE HealthcareLtd. Ficoll separates whole blood into two fractions above and below the density of 1.077g/ml.Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) are the populations of immune cells that remain at the less dense, upper interface of the Ficoll layer, often referred to as the buffy coat and are the cells collected when the Ficoll fractionation method is used.Erythrocytes (red blood cells) and polymorphonuclear cells (PMNs) which include neutrophils and eosinophils are generally removed during this fractionation as they are denser then 1.077g/ml. Basophils, however can be greater or less dense then 1.077g/ml and thus may be present to a small degree in the less dense PBMC fraction.PBMCs include lymphocytes (T cells, B cells, and NK cells), monocytes, and dendritic cells. In humans, the frequencies of these populations vary across individuals. In my experience as well as that of others, lymphocytes are typically in the range of 70 – 90% of PBMCs, monocytes range from 10 –30% of PBMCs, while dendritic cells are rare, being only 1 – 2% ofPBMCs. The frequencies of cell types within the lymphocyte population include 70 – 85% CD3+ T cells (45 – 70% of PBMC), 5 – 20% B cells (up to 15% of PBMC), and 5 – 20% NK cells (up to 15% of PBMC).The CD3+ compartment is composed of CD4 (25 – 60% of PBMC)and CD8 T cells (5 – 30% of PBMC), in a roughly 2:1ratio. Both CD4 and CD8 T cells can be further subsetted into naïve, and the antigen-experienced central memory, effector memory, and effector subtypes that exist in resting or activated states. Multiple markers can be used to identify these compartments to varying similarities and thus the frequencies reported by people using different markers may vary.CD4 T cells are known as helper T cells and can be further classified into various functional subtypes based on the expression profiles of specific cytokines, surface markers, or transcription factors. These include regulatory T cells, T H1, T H2, and T H17 cells as well as other described subpopulations such as T H9, follicular helper, and T R1 types. These classifications howeverwill certainly become more complex in the future, as recently the cytotoxic CD8 T cell compartment has been to shown to be extremely heterogenous in marker expression and function and may be comprised of roughly 200 functional phenotypes.Circulating B cells include transitional, naïve, and memory subtypes as well as plasmablasts, all of which can be found at varying populations in peripheral blood. Circulating dendritic cells include plasmacytoid dendritic cells as well as myeloid derived dendritic cells. Circulating monocytes have been described as either being classical monocytes or nonclassical CD16+ proinflammatory monocytes, which comprise up to 10% of the monocytes in peripheral blood and have unique functions compared with classical monocytes.Human immune system studies rely heavily on the phenotypic and functional assessments of PBMCs. In order to take advantage of PBMCs for human immune studies, it is important to know what populations are represented in peripheral blood and how PBMC populations differ in distribution and function from tissue immune cells. Finally it is critical to become familiar with the identifying surface and intracellular markers and the types of assays best suited for human PBMC studies. The markers most suitable for identification of the major immune populations in human PBMC using flow cytometry will be the topic of the next blog.。

PBMC表面标志物

PBMC表面标志物Leukopak是一种通过单采机收集的富集血液分离产物，主要目的是从外周血中提取白细胞（WBC）。

白细胞含有高浓度的单核细胞（PBMC），主要由T细胞，B细胞，NK细胞和单核细胞组成。

Leukopak中的白细胞浓度明显（约4-7*108白细胞/毫升）比全血（平均值5-7*106白细胞/毫升）高很多。

此外，白细胞中的红细胞（RBC）浓度显着降低，比例约为每2个红细胞1个WBC，而在全血中，比例约为每1，000个红细胞约1个WBC。

而且白细胞纯度和质量与全血相比要优越得多，通常含有20倍以上的单核细胞含量。

PBMC因其在免疫治疗研究，细胞治疗工艺开发和临床中的应用而受到高度重视。

因此，白细胞已成为细胞治疗研究和药物开发的首选起始材料。

高品质的Leukopak是纯度和产量的完美平衡。

实现这种平衡不仅需要血液分离专业知识，还需要对捐赠者的良好管理。

通过对捐赠者的饮食和生活习惯指导，我们可以最大限度地提高捐赠者白细胞的潜在质量。

然而，即使是高质量的白细胞在产量方面也是可变的。

捐赠者与捐赠者之间的可变性是固有的，而且往往不可预测的。

然而，这种自然变异性肯定会出现在患者群体中，并且在工艺开发过程中必须被接受和考虑。

02什么是PBMC？外周血单个核细胞（Peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)，是外周血中具有单个核的细胞，来源于骨髓中的造血干细胞(HSC)。

HSC通过造血过程产生免疫系统的所有血细胞。

HSC可以分化成两个谱系：髓系(单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、巨核细胞、树突状细胞、红细胞)和淋巴系(T细胞、B细胞、NK细胞)。

而PBMC主要包括淋巴细胞和单核细胞，淋巴细胞又细分为T细胞，B细胞，NK细胞等。

你的血液里究竟有什么？

你的血液里究竟有什么？1、介绍外周血或全血携带各种血细胞，即红细胞(red blood cells)、白细胞(white blood cells)和血小板(thrombocytes)，它们悬浮在血浆中。

血浆主要由水组成，但也含有蛋白质、葡萄糖、离子、激素和凝血因子。

从血浆中去除凝血因子就会产生血清。

血液中最丰富的细胞是红细胞，其中包括血红蛋白，一种含铁蛋白质。

血红蛋白可逆地结合氧气，从而促进氧气在体内的运输。

血小板在伤口修复中起着重要作用，它们通过黏附于损伤处并促进凝血方式达到止血效果。

哺乳动物血小板没有细胞核，它们由部分细胞质组成，这些细胞质在进入血液循环之前来自骨髓中的巨核细胞。

约25%-40%的血小板储存在脾脏中，并在需要时释放出来，其余的血小板在血液中自由循环，周期约为10天。

白细胞的各种亚型在免疫应答中发挥重要作用。

血液的所有细胞成分都来自造血干细胞(HSCs)。

这些多能干细胞位于骨髓，分裂产生潜能较有限的祖细胞：普通淋巴祖细胞和普通髓系祖细胞。

常见的淋巴祖细胞可生成T、B淋巴细胞和自然杀伤细胞(NK)，而常见的骨髓祖细胞可生成单核细胞、树突状细胞和粒细胞(包括中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)。

最后，产生红细胞和血小板的巨核细胞产生于它们各自的共同祖细胞。

2、白细胞鉴于白细胞在免疫反应中的作用，白细胞对于了解健康和疾病的机制特别有意义，因此白细胞通常从血液和血液制品中分离出来。

白细胞的分类可根据其来源(髓系或淋巴系)或细胞核的形态(单核或多核)以及胞浆中颗粒的存在或不存在而定，可分为两组:i)外周血单个核细胞(pbmc，也称为无颗粒白细胞)和ii)多形核白细胞(pmn，也称为粒细胞)。

2.1、外周血单个核细胞(pbmc)pbmc包括淋巴细胞(T细胞、B细胞和NK细胞)、单核细胞和树突状细胞。

除其他特征外，T淋巴细胞和B淋巴细胞的成熟位置和抗原受体是不同的。

T细胞在胸腺中成熟并表达T细胞受体TCR，而B细胞在骨髓中成熟并携带B细胞受体BCR。

成人外周血免疫细胞存储pbmc存储条件_解释说明

成人外周血免疫细胞存储pbmc存储条件解释说明1. 引言1.1 概述成人外周血免疫细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，简称PBMC）是一类重要的免疫细胞种类，包括淋巴细胞、单核细胞和多能干细胞等。

存储PBMC样本并保持其完整性和功能对于后续的实验研究非常关键。

本文将详细探讨成人外周血免疫细胞存储条件，并介绍存储条件对实验结果的影响。

1.2 文章结构本文分为五个主要部分：引言、成人外周血免疫细胞存储条件、PBMC存储条件的关键因素、PBMC存储容器和保存方法的比较以及结论。

在成人外周血免疫细胞存储条件部分，将介绍什么是PBMC存储条件、其重要性以及它对实验结果产生的影响。

接着，在PBMC存储条件的关键因素部分，将讨论温度控制和冷冻速率、冷冻介质的选择和配方以及冷冻管和标签的使用注意事项。

随后，在PBMC存储容器和保存方法的比较中，我们将对使用液氮罐进行长期保存和使用液态氮注射式冷冻器保存PBMC样本的优缺点进行比较，并介绍相应的注意事项。

最后，通过结论部分，将总结回顾PBMC存储条件并提出存在的问题及改进建议。

1.3 目的本文旨在提供科学准确、可靠可行、易于操作的PBMC存储条件，帮助研究人员保存和利用成人外周血免疫细胞样本，以确保后续实验结果的准确性和可重复性。

通过详尽地探讨PBMC存储条件的重要因素和适用方法，希望能为科研工作者提供有关成人外周血免疫细胞存储方面的指导与建议。

同时，在最后一节中，我们还将针对现有存储条件存在的问题提出改进建议，希望能够引起更多学者对该领域的重视并共同推动该领域的进展。

2. 成人外周血免疫细胞存储条件2.1 什么是PBMC存储条件PBMC即成人外周血单个核细胞，是一种重要的免疫细胞类型，它在免疫反应中起着至关重要的作用。

为了确保PBMC的完整性和保存时间，需要遵循特定的存储条件。

PBMC存储条件指的是在收集和分离后将PBMC保存下来的环境设置和技术规范。

pbmc细胞

03
单核细胞亚群在免疫应答中的作用
• 巨噬细胞吞噬病原体，参与炎症反应
• 树突状细胞呈递抗原，激活免疫细胞
03
PBMC细胞在疾病研究中的应用
PBMC细胞在感染性疾病研究中的应用
病毒感染
• 分析PBMC细胞亚群在病毒感染过程中的变化
• 研究PBMC细胞亚群在病毒感染免疫应答中的作用
细菌感染
• 分析PBMC细胞亚群在细菌感染过程中的变化
• 可以获得高纯度的PBMC细胞亚群
PBMC细胞亚群在免疫应答中的作用
01
T细胞亚群在免疫应答中的作用
• CD4+ T细胞协助B细胞产生抗体，增强免疫应答
• CD8+ T细胞直接杀死病毒感染细胞，清除病原体
02
B细胞亚群在免疫应答中的作用
• B细胞产生抗体，中和病原体
• 浆细胞产生和分泌抗体，维持免疫应答
D O C S S M A RT C R E AT E
PBMC细胞的研究与应用
CREATE TOGETHER
DOCS
01
PBMC细胞的来源与特性
外周血单核细胞的来源及组成
外周血单核细胞（PBMC）来源于骨髓
• 骨髓中的多能造血干细胞分化为单核细胞
• 单核细胞进入血液，成为外周血单核细胞
PBMC细胞主要包括以下类型
T细胞，主要参与免疫应
答的调节
• CD8+ T细胞：细胞毒
性T细胞，主要参与病毒
单核细胞亚群
感染和肿瘤免疫

• 巨噬细胞：主要参与炎
B细胞亚群
症反应和免疫调节
• 树突状细胞：主要参与
抗原呈递和免疫调节

• B细胞：主要参与体液

基底细胞和非基底细胞数量之间的不同比率

基底细胞和非基底细胞数量之间的不同比率基底细胞和非基底细胞，听上去好像两种啥也不懂的细胞对吧？嘿，别急，咱慢慢来聊。

想象一下，咱们的皮肤就像一块超级复杂的拼图，拼图的每一块都各有各的功能。

有些拼图块负责保护，有些负责感知，有些则做着修复的工作。

基底细胞和非基底细胞就是其中两种“拼图块”，虽然它们在看起来没啥特别区别，但它们各自的“工作岗位”可大有不同。

咱们先来说说基底细胞。

哦，基底细胞啊，别看它名字里有个“基底”，它其实就是皮肤最底下的一层小“工人”。

它们就像是皮肤的“生产车间”，在皮肤底层默默无闻地拼命制造新细胞，代替那些死掉的老细胞。

是的，你的皮肤每天都在“更新换代”，新的细胞像是流水线上的产品，基底细胞负责把这些产品送到皮肤的表面。

而这些非基底细胞呢，嘿嘿，它们是跟皮肤表面最亲近的“朋友”，负责保护、感知和防止外界的侵扰。

它们一旦被用到，那就意味着它们的工作任务完成了，可能就会死去，留下一个个小小的“痕迹”在皮肤表面，咱们平常看到的皮肤就是由这些“痕迹”组成的。

你要仔细想想，基底细胞和非基底细胞的“战斗力”也挺有意思的。

你看啊，基底细胞每天都是低调做工，从不声张，就像那些辛勤耕耘的农民。

而非基底细胞嘛，那可就像是前线的战士，整天顶着阳光、风雨甚至化学物质，保护咱们免受外界的伤害。

两者一个负责“打下基础”，一个负责“守卫家园”，听起来是不是有点像两个互相配合的好搭档？嗯，确实如此。

不过，问题来了！基底细胞和非基底细胞之间的数量比例，竟然是一个相当微妙的问题。

因为这个比例，直接影响到咱们皮肤的健康。

想象一下，如果基底细胞太多，那就有点像工厂里多了很多生产线，但生产出来的产品没地方去，这样皮肤就可能变得不那么灵活，甚至出现一些皮肤问题。

可如果非基底细胞太多，那皮肤的保护能力就可能不足，咱的皮肤就像失去了防守的城墙，一旦遇到外界的“攻击”，就容易出现问题。

你是不是有点儿疑惑了？为什么有时候咱的皮肤就容易不平衡呢？咱的身体里，基底细胞和非基底细胞的比例，受很多因素的影响。

外周血单个核细胞(PBMC)制备方法及注意事项

Ficoll密度梯度离心法提取PBMC原理及注意事项外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），是指外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞（Lymphocyte）、单核细胞（Monocyte）、树突状细胞（DC）和其他少量细胞。

PBMC可通过健康人或动物供体的外周血，通过Ficoll密度梯度离心法（IPHASE/汇智和源），磁珠分选等步骤获得。

Ficoll是蔗糖的多聚体，中性，平均分子量400,000，当密度为1.2g/mL，未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。

吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。

人PBMC中不同细胞类型的比例PBMC中大部分都是淋巴细胞，包括B细胞和T细胞，其中CD3T细胞又占了淋巴细胞中绝大部分(45-70%)。

这些T细胞都处于初始（naive）状态，即已经成熟了但没有受到抗原刺激。

在正常人中，只有非常小的一部分初始T细胞会因抗原识别而被激活。

同样的B细胞也都处于初始状态。

相对于淋巴细胞，单核细胞的比例在10-30%，收到刺激之后会发育成树突状细胞(DC)或巨噬细胞。

干细胞的比例非常低，只有0.1-0.2%，因此很难从全血样本中分离到。

一、外周血单个核细胞（PBMC）制备方法1.设备与试剂全血（以10ml为例）无菌PBS溶液(pH7.4)或者生理盐水蔗糖溶液（Ficoll Pague PLUS)RPMI1640培养基胎牛血清（FBS）双抗P/S（Penicillin/Streptomycin)二甲亚砜（DMSO）预先装好异丙醇的冻存盒2.方法/步骤配制所需的溶液：a.细胞培养基：RPMI1640+10%FBS+1%P/S；b.细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；（1）将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；（2）取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。

pbmc单细胞测序分群指标

pbmc单细胞测序分群指标英文回答：Clustering metrics for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are used to assess the quality and reliability of the clustering results. These metrics help in evaluating the performance of different clustering algorithms and parameter settings.One commonly used metric is the silhouette coefficient, which measures the compactness and separation of clusters.It quantifies how well each cell is assigned to its own cluster compared to other clusters. A higher silhouette coefficient indicates better clustering. For example, if we have three clusters and the silhouette coefficients are 0.8, 0.6, and 0.4, it suggests that the first cluster has the best separation, followed by the second cluster, and the third cluster has the lowest separation.Another metric is the adjusted Rand index (ARI), which measures the similarity between the true labels and the clustering results. It takes into account both the true positives and true negatives, and adjusts for the expected similarity by chance. A higher ARI indicates better clustering. For instance, if the ARI is 0.9, it means that the clustering results are highly similar to the true labels.Furthermore, the purity metric is used to assess the homogeneity of the clusters. It measures the proportion of cells in a cluster that belong to the majority class. A higher purity indicates more homogeneous clusters. For example, if we have a cluster with 90% of cells belonging to the same class, it suggests high purity.Lastly, the F1 score is a commonly used metric that considers both precision and recall. Precision measures the proportion of true positives among the predicted positives, while recall measures the proportion of true positives among the actual positives. The F1 score combines these two measures into a single value, with higher values indicatingbetter clustering. For instance, if the F1 score is 0.8, it suggests a good balance between precision and recall.中文回答：PBMC单细胞测序的分群指标用于评估聚类结果的质量和可靠性。

4.PBMC分离

Ficoll密度梯度离心法外周血单个核细胞 (peripheral blood mononuclear cells,PBMC)
外周血单个核细胞(PBMC)

包括淋巴细胞和单核细胞。

是免疫学实验最常用的细胞，也是T、B细胞分
离纯化的第一步。

常用分离方法：聚蔗糖-泛影葡胺(FicollUrografin)密度梯度离心法
1
2
2
1
1
2000rpm 20min
1
1000rpm 3 3 3 10min
3
方法

稀释的抗凝静脉血1ml 取一只玻璃试管，加入1ml淋巴细胞分离液；转移血标本于淋巴细胞分离液上层（注意：保持液面完整) 离心，2000rpm，20min 吸取单个核细胞（中间白膜层），转移至一新试管中

加入5倍量D-Hank’s ，混匀，离心，1000rpm，10min
弃上清，留少许重悬沉淀滴一滴细胞悬液于载玻片上，盖盖玻片，镜下观察
结果
(一)
血浆 PBMC 分离液 PMN RBC
(二) 镜下观察结果
实验报告
外周血单个核细胞(PBMC)的分离
方法、原理、步骤、结果
原理

聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液比重为1.077±0.001

红细胞、粒细胞比重1.09；
淋巴细胞和单核细胞的比重1.075
稀释抗凝血
血浆单个核细胞
淋巴细胞分离液
凝兔子外周血淋巴细胞分离液 D-Hank’s液试管、吸管等

外周血PBMC的分离

3.18℃，1500r/min，离心30min

4. 轻轻吸取PBMC层移入另一试管中

5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min 离心5min ，弃上清。
注意事项

1.每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞 2.Ficoll应适量，外周血应充分稀释 2.温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果 3.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面 4. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染
一、外周血PBMC的分离
原理

外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
原理
红细胞
1.093 1.092
淋巴细胞单核细胞
外周血
粒细胞
单个核细胞 (PBMC) 血小板
1.075~1.090 1.030~1.035
Ficoll：1.077±0.001
稀释外周血
稀释的血浆、血小板
1500rpm, 20℃ , 30min
PHale Waihona Puke MCFicollFicoll
红细胞粒细胞
实验步骤

1.采血，稀释（外周血：稀释液=1：2） 2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血（Ficoll：稀释血=1：2）

间接免疫荧光检测PBMC

间接免疫荧光检测PBMC
[材料]
1、淋巴细胞分层液（葡蔗糖-泛影葡胺，比重为 1.077±0.001g/L） 2、 2％台盼蓝染液 3、 Hank’s液或者RPMI-1640培养基 4、试管、吸管、水平离心机等
间接免疫荧光检测PBMC
[方法]
1、无菌采集静脉血2ml注入盛有2ml Hank’s液（含100u/ml肝素）的试管中，混匀。
间接免疫荧光 -----检测人外周血单个核细胞
间接免疫荧光检测PBMC
原理
间接免疫荧光法是用荧光素标记Ab2以检测 Ag或Ab的一种实验技术。其原理是Ag首先与 Ab1结合，然后Ab1再与荧光素标记的Ab2结合，形成一个Ag- Ab1-荧光素标记Ab2的三分子复合物，在荧光显微镜下呈现荧光。
间接免疫荧光检测PBMC
2. 15 ul Ab1 加入玻片上37℃孵育30 min。 PBS洗3 次(3min/次)。
间接免疫荧光检测PBMC
3. 玻片上加15 ml 荧光二抗 (Ab2) 湿盒内37℃孵育 30 min。PBS洗3次(同上,避光操作)
4. 用吸水纸印干玻片，滴油，荧光镜显微镜下观察。
间接免疫荧光检测PBMC
5、室温下，1500rpm离心10min。
间接免疫荧光检测PBMC
6、弃上清，重复洗涤一次。用完全RPMI-1640 1ml定容，计数细胞，调整细胞浓度。一般每ml血可分离出1-2×106个单个核细胞。
7、细胞活力检查取1滴细胞悬液加1滴2%台盼蓝染液，作湿片高倍镜检，计算活细胞百分率。活细胞不着色，死细胞染成蓝色。一般活性应在95％以上。
2、吸取淋巴细胞分层液2ml加入离心管中，再将稀释抗凝血液小心沿管壁加至分层液上，应注意保持两者界面清晰。（关键）