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生物显微技术第三章细胞化学和组织化学

❖ 显示脂类的基本原理：用易溶于脂类的染料, 使之溶于所检的脂质(如脂滴)中,使组织内的脂类着色.
❖ 常用方法：苏丹黑B法、油红O法、硫酸尼罗蓝法、苏丹Ⅲ染色法等
❖ 基本要求 ⑴ 不用石蜡切片. ⑵ 固定剂一般用Formalin保存磷脂较好. ⑶ 方法: ① 物理法:脂溶性染料,不溶于水,属偶氮染料.常用苏丹Ⅲ,Ⅳ,苏丹黑 ,油红O等. ② 化学方法:硫酸尼罗蓝显示脂肪酸. ③ 选择性提取法(对照)
❖ 差不多与此同时(1900-1935年)，发现疾病组织中出现的物质变化，更促进了化学技术在病理学染色方法中的应用，也丰富了在显微镜下显示无机物、色素、脂类、糖类、蛋白质、核酸等物质的组织化学内容，此后又出现了酶的组织化学等。由此可见，“组织化学”一词的含意是随时代而变化的，由定位趋向于与定量相结合的研究。
❖ 3、灌注固定法：从心血管途径将固定剂灌注到全身或某一个器官，使细胞保持生活时的状态而不发生移位，固定后再迅速取材。
三、制片
❖ 涂片法、石蜡切片法、冰冻切片法 ❖ 最常使用的为恒冷箱冰冻切片法。
四、注意事项
❖ 1、实验所用的器械、器皿都必须清洁无污染。 ❖ 2、配制试剂时应使用双蒸馏水。 ❖ 3、固定、取材都应在冷的环境下进行。 ❖ 4、各种试剂的pH值都要调准，否则影响反应结果。 ❖ 5、所用试剂要纯，都必须达到分析纯(A·R级)。 ❖ 6、同时、同条件情况下做阴性和阳性对照。 ❖ 7、了解和掌握被检组织中所要测定的化学物质或
❖ 以下介绍McGee-Ruseell核固红法。 ❖ 1、操作步骤 ❖ (1) 石蜡切片常规脱蜡至水。 ❖ (2)核固红染液染色2一10分钟。 ❖ 核固红染液的配制：核固红2g，蒸馏水100ml洗涤2次，剩

生物显微技术ppt课件

G. 氯化汞性质：无色粉末，剧毒
优点：渗透力强，对蛋白质有强烈的沉淀作用
缺点：材料收缩
*常与甲醛、冰醋酸、丙酸等配合使用。用碘除汞
H. 碘性质：棕红色晶体
优点：渗透力强，野外使用方便
缺点：易挥发，标本不能长期保存
*溶于碘化钾溶液配置固定液；使用时可与福尔马林配合使用。是低等单细胞生物、浮游生物的良好固定液
有必要，必须采用与固定剂中的酒精浓度相同或相近的酒精。
2.凡是含有铬酸、重铬酸钾、锇酸的固定剂，必须用流水冲洗，冲洗时间应等于或多于固定时间。
3.如固定液中含有氯化汞，应根据溶液的性质用水或酒精冲洗，冲洗完毕必须在70%酒精中加碘液去汞。
4.含有苦味酸的固定剂，宜选用70%的酒精进行洗涤。苦味酸的黄色在70%酒精中能自行脱去,或加入碳酸钾饱和水溶液除去。
I. 锇酸性质：灰黄色结晶，强氧化剂，剧毒
优点：目前最好的固定剂之一，脂类物质唯一的固定剂
缺点：渗透力弱，组织固定不均匀，价格昂贵
*取材较小，固定后用过氧化氢漂洗
第二节洗涤和脱水
一、洗涤的目的和原则
洗涤的目的：将组织间隙中的固定剂清洗干净以免妨碍染色或使材料在后续处理中变质。
洗涤的原则: 1.固定剂为酒精，或酒精混合物，一般不要求冲洗，如
第二章光学透镜第二节凸透镜成像
➢ 显微镜的物镜、目镜和聚光镜都是由多个单透镜或复透镜组成的透镜组，但其实质上只相当于一个凸透镜。凹透镜所成的像总是缩小的虚像，在显微镜上不能单独使用。
第七节脱蜡与染色
四、染色过程中使用的其他辅助试剂
a. 媒染剂
有的染料不能直接使细胞或组织着色。媒染剂通常能在水中电离金属离子（金属盐类或金属氧化物）而与染料结合成有色复盐（不溶于水或酒精）

生物显微技术第一章显微镜

DNA分子拉成的DNA图象
原子力显微镜（Atomic Force Microscope， AFM）
原子力显微镜同样具有原子级的分辨率。由于原子力显微镜既可以观察导体，也可以观察非导体，从而弥补了STM的不足。
结语
STM 及随后发展起来的 SPM 技术是在纳米尺度上研究物质的特性和相互作用的有力手段，能够获得用其它实验方法很难得到的结果，为纳米科技的诞生与发展起了根本性的推动作用。
LSCM的生物学应用

细胞的三维重建：各类细胞骨架形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析细胞定量荧光测定细胞内钙离子pH值和其它离子的动态分析细胞胞间通讯和膜的流动性
第三节电子显微镜

1932年德国人发明电子显微镜分辨率：极限分辨率0.2-0.25nm，为光镜的1000 倍透射电镜（transmission electron microscope ）超高压电镜扫描电镜（scanning electron microscope ）
第二节激光扫描共聚焦显微镜
Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM
LSCM原理

用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。可以获得样品不同深度层次的图像，对较厚的样本进行无损伤的系列"光学切片"，得到其各层面的信息。这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的三维立体结构。
STM的应用
在纳米范围内， STM 已在表面科学、材料科学、生命科学等各个领域获得了广泛应用。真空、大气和溶液条件下的 DNA 研究，球蛋白、胶原蛋白及红血球的研究等。 STM 不仅能够对样品表面进行成像，而且还能在纳米尺度上对材料表面进行刻蚀与修饰。

《生物显微技术》课件

详细描述
荧光显微镜在观察细胞和组织时，利用荧光物质对样品进行标记。这些荧光物质在特定波长的光激发下发出荧光，通过显微镜的观察和记录，可以了解细胞内分子的分布和动态变化。
共聚焦显微镜观察法
总结词
共聚焦显微镜采用点扫描方式，逐层扫描样品，获得高分辨率的三维图像。
详细描述
共聚焦显微镜采用点扫描方式，逐层扫描样品，并对每个点进行聚焦成像。这种技术能够获得高分辨率的三维图像，适用于观察细胞和组织的结构和动态变化。
分子生物学研究
检测基因表达、蛋白质合成等分子水平的变化。
生态学研究
观察和研究动植物种群、群落和生态系统结构与功能。
环境监测中的应用
1 2
污染物检测
检测水体、土壤和空气中的有害物质，评估环境质量。
生态监测
观察和记录动植物种群变化、生态系统健康状况。
3
放射性监测
检测放射性物质，保障人类和环境安全。
达和定位。
荧光染色
利用荧光染料对细胞或组织进行染色，以便于在显微镜下观察和记录
。
特殊染色
针对某些组织或细胞类型，使用特殊的染色方
法以显示其特征。
观察与记录
显微镜操作
调整显微镜焦距、光线等参数，以便清晰观察组织结构和细胞形态。
记录方式
采用拍照、绘图或文字描述等方式记录观察结果。
观察目标
观察组织样本中的细胞形态、排列、结构以及抗原表达等情况。
目前，生物显微技术已经广泛应用于生物学、医学、农业等领域的基础研究和应用研究。
应用领域
生物学
研究细胞结构、细胞器功能、基因表达等。
医学
诊断疾病、研究药物作用机制、观察病理组织等。

生物显微技术-第二章-其他常用制片方法和特殊染色方法

❖ 姬姆萨染料：为天青色素、伊红、次甲蓝的混合物，本染色液最适于血液涂抹标本、血球、疟原虫、立克次体以及骨髓细胞、脊髓细胞等的染色
❖ 注意事项
❖ 玻片的清洗：新玻片常有游离碱质，因此应用清洗液或10%盐酸浸泡24h，然后再彻底清洗。用过的玻片可放入适量肥皂水或合成洗涤剂的清水中煮沸20min，再用热水将肥皂和血膜洗去，用自来水反复冲洗,必要时再置95%乙醇中浸泡1h，然后擦干或烤干备用。
❖ 缺点： ❖ 1、不容易做连续切片。 ❖ 2、切取的组织不能过大，组织过大不容易冻
结或者组织冻结不均，影响切片及染色效果。 ❖ 3、不容易制作较薄的切片。 ❖ 4、组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而
影响细胞的形态结构及抗原物质的定位，并且组织结构也不如石蜡切片清晰。
（四）主要应用
❖ 1、用于有些水解酶的定位的组织化学方法以及免疫组织化学方法等。
主要部件： ①恒冷箱 ②样品冷却系统 ③切片机 ④一次性不锈钢刀片

LEICA CM1900型恒冷箱切片机具有一个完全封闭式的恒冷箱，工作时可24小时制冷，使箱内温度常年保持在20℃的工作状态，并具有自动除霜的功能。此外，它还具有一个独立的样品冷却系统，使生物样品被迅速冷冻，达到一定硬度后，即可切片。样品的前进与后退，由恒冷箱外的电动按钮控制。
（一）冷冻切片的种类
半导体冰冻切片机
低温恒冷箱冰冻切片法
二氧化碳冰冻切片法
甲醇循环制冷冰冻切片法等
这些方法，随着时代的变迁，科技的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法，正在受到青睐。
❖ （二）冷冻切片的制作方法
低温恒冷箱冷冻切片制作法冷冻箱内左边的冷冻台，温度可达-60℃左右，冷冻箱的中间为一台切片机，工作间的温度在0-30℃间可任意调节，并在箱面上的荧屏显示出来。

显微操作技术(全面)PPT课件

1979年Willadsen和Meineck-Tillman等成功地进行了绵羊早期胚胎的分割。
20世纪80年代以后，哺乳动物胚胎分割技术发展迅速，Willadsen等在总结前人经验的基础上，建立了系统分割方法，并运用这种方法获得绵羊的四分之一和八分之一胚胎后代和牛的四分之一胚胎后代。
（二）胚胎切割技术
干细胞应用前景非常广阔，比如可用于细胞治疗、基因治疗、药物筛检和毒性的检测、生物体发育机制研究等。其中最吸引人的应用，是将干细胞分化成某一特定的细胞、组织，甚至器官，通过移植，使之再建起受损的组织，甚至器官。比如，将干细胞在体外分化为胰岛素细胞，注入病人胰脏中，通过增殖，构成病人新的胰岛组织，它就可以替代病人受损的胰岛组织，使依赖注射胰岛素维持生命的病人得到根治。人们预言，干细胞有可能用于治疗人类几乎所有的组织坏死性或退化性疾病，它将是人类医疗史上的一次革命。
近些年来，胚胎移植技术已在动物引种和改良方面广泛应用，已成为体外受精、嵌合体、转基因和克隆动物实现的应用技术，试管牛、转基因猪和克隆羊均是通过胚胎移植途径生出的。
(二)胚胎移植的基本原则
1.胚胎移植前后所处环境的同一性（１）供体和受体在分类学上的相同属性（２）动物生理上的一致性（３）动物解剖部位的一致性 2.胚胎发育的期限 3.胚胎的质量
• 早期胚胎一定时间内处于游离状态
• 供体和受体会不会发生排斥/
• 同种动物之间基本上不排斥
生理学
• 为什么移植的胚胎能保留供体双亲的特性?
基
• 胚胎虽然与受体有生理和组织上的联系,但遗传特性不受受体的影响
础
.
胚胎移植的技术程序
胚胎移植时，希望一次从供体母畜得到多数胚胎，所以要进行超数排卵处理，同时，胚胎移植成功的根本条件是供体和受体必须同时发情，故需人为控制供受体的发情时间，进行同期化处理。

生物显微技术进展ppt课件

Max Knoll(1897-1969)
Ernst Ruska(1906-1988)
一、显微技术发展简史
一、显微技术发展简史
1952年，英国工程师Charles Oatley制造出了第一台扫描电子显微镜(SEM)。
一、显微技术发展简史
1982年，诺贝尔化学奖授予卓越的电镜应用者——英国的分子生物学家克卢格（A Klug）。
➢有效放大：对于某一显微镜来说，在其分辨能力之内的图像放大。此时的图像放大不失图像表面的细节。
➢无效放大：在显微镜分辨能力以外的图像放大。只是放大了图像轮廓，不能放大和分辨图像的表面细节。可见光照明的显微镜分辨率的极限值约为200 nm ，一般人正常眼的分辨率为0.2mm，使用光学显微镜可以使我们分辨清楚细胞的微细结构细节提高了1000倍，这正是光学显微镜的极限放大倍数，如果再追求更大倍数也只能是空放大（无效放大），并不能使细节更为清晰。
一、显微技术发展简史
17 世纪中叶，英国的罗伯特· 胡克（用自己制造的显微镜观察软木切片， “细胞”）和荷兰的安东尼· 冯·列文胡克（制造了只有一片凸透镜的显微镜，放大了300倍）都对显微镜的发展作出了卓越的贡献。
一、显微技术发展简史
1695 年惠更斯设计成功二片式目镜，这就是至今仍采用的惠更斯目镜。
二、普通显微镜和特殊光学显微镜
利用免疫荧光标记和离子荧光标记探针，该技术不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可以对活细胞的结构、分子、离子及生命活动进行实时动态观察和检测，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。
切片法
徒手切片法石蜡切片法冰冻切片法组织化学制片

生物显微技术PPT课件

不经过切片而将整个微小的或者透明的生物体或者器官封藏起来制成整体装片的方法单细胞藻类菌类苔藓植物和花粉粒等低等植物植物无根茎叶的分化无维管束雌性生殖器为单细胞极少数例外合子不形成胚直接萌发为植物体藻类菌类地衣植物体有色素能进行光合作用生活方式为自养植物体无色素不能进行光合作用极少数例外生活方式为异养植物体为菌藻共生体植物有根茎叶的分化有维管束苔藓例外雌性生殖器由多个细胞构成有颈卵器合子形成胚然后再萌发为植物体植物体无维管束配子体占优势孢子体不能离开配子体独立生活苔藓植物厥类植物植物体有维管束孢子体占优势能独立生活
2.5亿年前二叠纪末期的第三次物种大灭绝，是地球史上最大最严重的一次，估计地球上有96％的物种灭绝，其中90％的海洋生物和70％的陆地脊椎动物灭绝。
第四次发生在1．85亿年前，80％的爬行动物灭绝了。
第五次发生在6500万年前的白垩纪，统治地球达1．6亿年的恐龙灭绝了
2021/3/7
CHENLI
裸子植物
产生种子，雌配子体不能离开孢子体独立生活。种子或胚珠裸露，不包被在果实或子房中。一般不具导管
被子植物种子或胚珠包被在果实或子房中，
不裸露。有导管
植物有根、茎、叶的分化，有维管束(苔藓例外)，
雌性生殖器由多个细胞构成，有颈卵器，
合子形成202胚1/3，/7 然后再萌发为植物体CHENLI
醋（酸加洋热红 2021/3/7 ）
醋酸清洗
CHENLI
12
孚尔根压碎法醋酸-铁-苏木精压碎法
2021/3/7
CHENLI
13
据统计，全世界每天有75个物种灭绝，每小时有3个物种灭绝。
地球第一次物种大灭绝发生在距今4．4亿年前的奥陶纪末期，大约有85％的物种灭绝。

生物显微技术

生物显微技术生物显微技术第一章1、生物显微技术：是应用各种光学显微镜或电子显微镜观察和辨认微小生物（动物、植物和微生物）的细胞形态及其显微、亚显微结构，也包括植物染色体技术与原位杂交等新的方法和技术。

2、列文虎克发明显微镜。

罗伯特胡克用自己设计与制造的显微镜（放大倍数为40-140倍)观察了软木（栎树皮)的薄片，第一次描述了植物细胞的构造，并首次用拉丁文cellar（小室)这个词来称呼他所看到的类似蜂巢的极小的封闭状小室（实际上只是观察到到纤维质的细胞壁)。

第二章1、材料采集注意事项：①选择新鲜的、健康的、有代表性的实验材料；②在保证材料完整的条件下，注意实验材料要“精而小”，而不是“大而多”；③注意实验材料的生长季节和发育时期；④选用刀刃锋利的刀片，切割时用力应均匀，避免组织破裂，影响制片效果；⑤实验材料选好后，应在极短的时间内杀死和固定。

2、切取纵切面时应注意使刀的切向与根茎的长轴方向平行。

这种切面分为两种①、径切面②、切向切面（弦切面）3、固定：应用某种方法以最快的速度，将生物细胞或组织杀死，投入某类化学药液中，借助化学药品的作用使细胞组织保持原来的形状与结构。

4、固定时的注意事项：①材料新鲜：组织采集与分割后须立即固定。

否则时间相隔过久，体积就要收缩变形或发生自溶现象。

一般以神经、造血组织自溶速度较快，胰腺、胃肠道的粘膜亦较易发生改变。

②防止变形：对一些柔嫩或薄的材料如神经、肠系膜等，应先平铺于吸水纸上再固定，可防止因蛋白质凝固而引起的扭转变形。

对含气而浮于液体表面的组织如肺等，可缚以重物使其下沉，或吸出肺内气体，使其下沉于固定剂内。

③固定剂用量：一般为组织体积的10~20倍。

避免组织内水分在固定时渗出，影响固定剂的浓度。

勿使组织贴于瓶底或瓶壁，以免影响固定剂的渗入。

在平时往往用棉花垫以瓶底，而使固定剂能均匀地渗入。

④固定时间：根据组织的不同种类、性质、大小，固定剂种类、性质、渗透力的强弱而定。

生物显微技术PPT

2、固定
用一定的化学溶液（固定剂）在尽可能保持细胞生活结构
的情况下迅速杀死组织的过程。
作用： ①防止组织溶解及腐败；
②使细胞内各种成分沉淀保存下来，保持它原有的生活结
构； ③使细胞内的成分产生不同的折射率，造成光学上的差异，便于观察； ④使细胞硬化不容易变形，利于固定以后的处理。
常用固定液：
准备好包埋用具，一般需要镊子、酒精灯、火柴、一盆冷水及包埋
用的纸盒，包埋时将融化的石蜡倒入纸盒中，迅速用烧热的镊子把
材料放入并按需要的切面和一定的间隔排列整齐，然后平放入冷水
中，使其快速凝固。包埋好的材料（石蜡块），可长期存放在4℃冰箱中，备切片用。
7、修块与固着
将包埋好的材料切割成小块，每个小块包含一个材料。然后按需要的切面将蜡块切成梯形，切面在梯形的上部（注意上部矩
刀片即可切片。切片时为了避免材料干枯，应使材料的切面和刀刃上
保持有水，呈湿润状态。每切2~3片后，移入盛有清水的培养皿中。如果切面倾斜，应立即纠正。
过于柔软的器官，例如幼嫩的叶片，需用胡萝卜根或马铃薯块茎
等作为支持物，将要切的材料夹于其中，然后进行切片。选择比较完整的切片进行染色和封片。
一、徒手切片法
变形虫
绦虫
姜片吸虫
鲨鱼的盾形鳞片
2. 涂片法
主要是液体或半流动性的材料，不能切成薄片则可涂在玻片上，再经固定与染色等程序制成标本。如：血液、精液、尿、痰、粪便等，还有细胞学的检查，微生物及原生动物等也可用涂片法制片。
载玻片2
再向前推载玻片2 血滴
先向后拉
载玻片1
血涂片制作示意图
玉米花粉母细胞减数分裂涂片
激光共聚焦扫描显微境
显微标本制作

生物显微技术课件

学院生命科学学院
系(实验室) 生物工程系
课程名称生物显微技术
授课班级生物30801、30802 主讲教师马立安
职称教授
使用教材植物显微技术
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长江大学生命科学学院备课用纸
、王灶安．植物显微技术．北京：农业出版社，1992
2006电子版
、李正理．植物组织制片学．北京：北京大学出版社，1996
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、每人制作一张永久片；
、将观察结果绘图，并表明各部位的名称。

长江大学生命科学学院备课用纸实验五脱水、透明与浸蜡步骤及过程表
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