核酸印讲义迹与分子杂交 PPT课件
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核酸分子杂交技术 ppt课件
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一、常见的核酸探针
（一）基因组DNA探针
基因组DNA探针的制备是将染色体DNA通过超声击断或限制性内 切酶不完全水解，获得许多染色体 DNA的随机片段，选择长度约 15-20kb的DNA片段重组到λ 噬菌体中，经体外包装感染大肠杆菌， 在固体培养基上形成许多噬菌斑。筛选出含目的基因的重组体后， 将目的基因 DNA片段再次亚克隆到大肠杆菌质粒中保存，以便需 要时扩增。 基因组DNA制备还可以通过 PCR扩增基因组DNA的特定片段，然 后将其克隆到大肠杆菌质粒中保存。由于真核基因组含有不编码的 内含子序列，因此，真核基因组 DNA 探针用于检测基因表达时杂 交效率要明显低于cDNA探针。
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(3) 酶
常用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶对核酸探针进行标记。
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(4) 荧光素
异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），最大吸收波 长为490nm～495nm，最大发射波长为520nm～530nm，呈黄绿色 荧光， 四乙基罗达明：最大吸收波长为570nm，最大发射波长为595～ 600nm，呈橙红色荧光。
ppt课件 11
二、核酸分子杂交的基本原理
根据核酸变性和复性的原理，不同来 源的 DNA 变性后，若这些异源 DNA 之间存在某些相同序列的区域，在退 火条件下则可形成DNA-DNA异源双 链；或将变性的单链 DNA 与 RNA 经 复性处理可以形成DNA-RNA杂合双 链。这种不同来源的单链核酸分子在 合适的条件下，通过碱基互补形成双 链杂交体的过程称为核酸分子杂交 （molecular hybridization）。
核酸分子杂交ppt课件
核酸分子杂交
一、概念：
1、分子杂交（hybridizat子浓度等条件下，通过碱基 互补退火形成稳定的双链分子的过程 。
2、 印迹（bloting）：将DNA、RNA或蛋白质固定到固体 支持物上的过程。
3、探针（probe）：核酸探针是指用放射性核素、生物 素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特 异性互补的已知DNA或RNA片段。
(2) Northern杂交：RNA片段经电泳后，从凝胶中 转移到硝酸纤维素滤膜上或尼龙膜，然后用探针杂交。 被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。
二、Southern杂交
1、步骤：
Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后 的DNA片段中是否存在与探针同源的序列，它包括下 列步骤:
(1) 酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然后使 DNA原位变性。
进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到 一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一 张尼龙膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂 解。主平板应贮存于4℃直至得到筛选结果。
五、斑点杂交
（2）254nm波长的紫外线照射尼龙膜带RNA的一面。
后一种方法较为繁琐,但却优先使用,因为某些批号的带正 电荷的尼龙膜经此处理后,杂交信号可以增强。然而为获 得最佳效果,务必确保尼龙膜不被过度照射，适度照射可 促进DNA上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形 成交联结构,而过度照射却使DNA上一部分胸腺嘧啶共价 结合于尼龙膜表面,导致杂交信号减弱。
三、Northern杂交
Northern杂交与Southern杂交很相似。主要区别 是被检测对象为RNA,其电泳在变性条件下进行,以去 除RNA中的二级结构,保证RNA完全按分子大小分离。 变性电泳主要有2种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳。 电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern转移相同的方法将 RNA转移到硝酸纤维素滤膜上,然后与探针杂交。
一、概念：
1、分子杂交（hybridizat子浓度等条件下，通过碱基 互补退火形成稳定的双链分子的过程 。
2、 印迹（bloting）：将DNA、RNA或蛋白质固定到固体 支持物上的过程。
3、探针（probe）：核酸探针是指用放射性核素、生物 素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特 异性互补的已知DNA或RNA片段。
(2) Northern杂交：RNA片段经电泳后，从凝胶中 转移到硝酸纤维素滤膜上或尼龙膜，然后用探针杂交。 被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。
二、Southern杂交
1、步骤：
Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后 的DNA片段中是否存在与探针同源的序列，它包括下 列步骤:
(1) 酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然后使 DNA原位变性。
进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到 一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一 张尼龙膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂 解。主平板应贮存于4℃直至得到筛选结果。
五、斑点杂交
（2）254nm波长的紫外线照射尼龙膜带RNA的一面。
后一种方法较为繁琐,但却优先使用,因为某些批号的带正 电荷的尼龙膜经此处理后,杂交信号可以增强。然而为获 得最佳效果,务必确保尼龙膜不被过度照射，适度照射可 促进DNA上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形 成交联结构,而过度照射却使DNA上一部分胸腺嘧啶共价 结合于尼龙膜表面,导致杂交信号减弱。
三、Northern杂交
Northern杂交与Southern杂交很相似。主要区别 是被检测对象为RNA,其电泳在变性条件下进行,以去 除RNA中的二级结构,保证RNA完全按分子大小分离。 变性电泳主要有2种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳。 电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern转移相同的方法将 RNA转移到硝酸纤维素滤膜上,然后与探针杂交。
核酸的分子杂交1310PPT课件
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重物 支持平台
玻璃板
吸水纸
湿滤纸 膜 胶 湿滤纸 湿滤纸桥
20×SSC
毛细管虹吸法Southern转膜示意图
.
玻璃容器 24
5. 探针的制备：用缺口平移或随机引物标记的方法
制备探针、标记。
6. Southern杂交
（1） 预杂交 封闭膜上所有能与DNA结合的位点转印后 的膜在预杂交液（不含探针的杂交液）4～6小时
⑵ 液相杂交 有时也将待测核酸和已知核酸同时放
在液体中进行杂交反应。
两种杂交形式的基本原理都是一样的。
从发展历史来看,先有液相杂交,后有固—液相杂交.
.
13
四、核酸分子杂交的过程—DNA的变性与复性
1.变性：在物理或化学因素作用下，例如加热、酸
碱或紫外线照射，可以导致两条DNA链之间的氢键断
裂，而核酸分子中的所有共价键（如磷酸二酯键、
如尿素、甲醛等时，两条链之间的氢键可以断裂而形成单链核
酸分子。
除物理、化学因素外，DNA分子的组成也影响变性。最主
要的因素是DNA分子中的GC含量，GC含量高的DNA不易变性，而
AT含量高的DNA容易变性。另外,环状DNA比线性DNA难于变性.
.
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2.复性
DNA的变性是可逆的，即两条互补的单链DNA分
（2） 杂交 （过夜）
7. 杂交结果的检测
（1） 放射线标记——放射自显影，感光胶片，显出黑 色杂交带；
（2） 非放射线标记——直接显出杂交带，进行检测。
.
25
②
③ ①
分子杂交实验过程 .
目录
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பைடு நூலகம் 射 自 显 影 照 片
DNA印迹与杂交技术PPT课件
23
4.3 Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法
利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的 DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是：容器 中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠， 上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤 纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动 凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA 片段移出凝胶而滞留在膜上。
47
3、离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂
交率增加 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进
行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交 反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度
48
4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交
液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待 测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在 35~42 ℃杂交
的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分
子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts 溶液或脱脂奶粉。
51
五、 其它分子杂交方法
Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交
固相杂交
52
（一）Northern印迹杂交
30
5、Southern杂交
1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点 预杂交液为不含DNA探针的杂交液
2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交 双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交
3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA
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6. 杂交结果的检测
化学显色或放射自显影
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4.3 Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法
利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的 DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是：容器 中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠， 上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤 纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动 凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA 片段移出凝胶而滞留在膜上。
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3、离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂
交率增加 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进
行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交 反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度
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4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交
液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待 测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在 35~42 ℃杂交
的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分
子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts 溶液或脱脂奶粉。
51
五、 其它分子杂交方法
Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交
固相杂交
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（一）Northern印迹杂交
30
5、Southern杂交
1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点 预杂交液为不含DNA探针的杂交液
2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交 双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交
3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA
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6. 杂交结果的检测
化学显色或放射自显影
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[课件]核酸分子杂交与应用PPT
![[课件]核酸分子杂交与应用PPT](https://img.taocdn.com/s3/m/1956ac56f46527d3240ce0db.png)
2018/12/6 16
RNA酶保护分析法的应用： mRNA定量 mRNA未端定位
内含子在相应基因中的位置
2018/12/6 17
RNA酶保护分析法的主要步骤： 1、制备待测RNA 从细胞或组织中 提取总RNA或mRNA； 2、RNA探针标记 采用体外转录的 方法制备和标记探针； 3、分子杂交：将待测样品RNA和 RNA探针在液相中杂交，杂交前将 样品和探针变性，破坏二级结构； 4、RNA酶消化单链RNA； 5、电泳分析杂交分子。
2018/12/6
2
2018/12/6
3
核酸分子杂交的基本原理与分类 核酸分子杂交的基本原理：DNA分子 由两条互补的单链形成的双螺旋结构。 维持结构稳定的力有三：1、两条链 间互补碱基的氢键；2、碱基间的堆 积力(范德华力)；3、中和链内的负 电荷。 变性：在理化因素作用下，双螺旋结 构间的氢键断裂，两条链解开形成单 链的过程。
2018/12/6 4
2018/12/6
5
变性温度(Tm)：核酸分子热变性时， 从开始变性到变性结束，是在一个很 窄的温度范围内进行的，当变性进行 到核酸分子解链一半时的温度，称变 性温度，也称融解温度。
2018/12/6
6
2018/12/6பைடு நூலகம்
7
影响变性的因素： 1、碱基组成 DNA分子中G＋C含量 越高Tm越高。在1×SSC溶液中， 两者之间的关系可以用经验公式表 示： Tm＝(G+C)%×0.41+69.3
2018/12/6
11
3、温度 温度过高，有利于DNA变 性而不利于复性； 4、离子强度 5、DNA分子的复杂性 DNA总量一 定时，基因组越复杂，其中特定顺 序的拷贝数越少，互补顺序的浓度 越低，复性反应速度越慢。
RNA酶保护分析法的应用： mRNA定量 mRNA未端定位
内含子在相应基因中的位置
2018/12/6 17
RNA酶保护分析法的主要步骤： 1、制备待测RNA 从细胞或组织中 提取总RNA或mRNA； 2、RNA探针标记 采用体外转录的 方法制备和标记探针； 3、分子杂交：将待测样品RNA和 RNA探针在液相中杂交，杂交前将 样品和探针变性，破坏二级结构； 4、RNA酶消化单链RNA； 5、电泳分析杂交分子。
2018/12/6
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核酸分子杂交的基本原理与分类 核酸分子杂交的基本原理：DNA分子 由两条互补的单链形成的双螺旋结构。 维持结构稳定的力有三：1、两条链 间互补碱基的氢键；2、碱基间的堆 积力(范德华力)；3、中和链内的负 电荷。 变性：在理化因素作用下，双螺旋结 构间的氢键断裂，两条链解开形成单 链的过程。
2018/12/6 4
2018/12/6
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变性温度(Tm)：核酸分子热变性时， 从开始变性到变性结束，是在一个很 窄的温度范围内进行的，当变性进行 到核酸分子解链一半时的温度，称变 性温度，也称融解温度。
2018/12/6
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2018/12/6பைடு நூலகம்
7
影响变性的因素： 1、碱基组成 DNA分子中G＋C含量 越高Tm越高。在1×SSC溶液中， 两者之间的关系可以用经验公式表 示： Tm＝(G+C)%×0.41+69.3
2018/12/6
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3、温度 温度过高，有利于DNA变 性而不利于复性； 4、离子强度 5、DNA分子的复杂性 DNA总量一 定时，基因组越复杂，其中特定顺 序的拷贝数越少，互补顺序的浓度 越低，复性反应速度越慢。
核酸印迹与分子杂交
95℃DNA模板变性成为单链，引物自身和
引物间的局部双链消除
• 退火(Annealing)
引物与模板DNA杂交，Tm值减5℃ • 延伸(Extension) DNA聚合酶在72℃催化DNA的合成
PCR技术的工作原理
ing
PCR技术
• PCR分析已知基因；
• 反转录PCR（reverse transcription PCR， RT-PCR）是将RNA的反转录和PCR联合应用 的一种技术。 RT-PCR是从组织或细胞中获得目的基因 及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析 的有效方法。
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RT-PCR与PCR区别
• 模板为mRNA
•
•
需逆转录酶
产物为cDNA
反转录合成cDNA
mRNA mRNA
5 oligo(dT)12-18 5 反转录酶 AAAAAA(n) 3 AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5 AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5 3 RNase H TTTTTT(n) 5 DNA 聚合酶 AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5 S1 核酸酶 AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5
分子生物学技术
高 颖
gaoying822@
核酸印迹技术与分子杂交
Nucleic Acid Blotting and Molecular Hybridization
核酸分子杂交
（nucleotide molecular hybridization） –以DNA的变性、复性为理论基础； –指具有一定同源序列的两条核酸单链 （DNA或RNA），在一定条件下按碱基互 补配对原则经过复性处理后，形成异源 双链的过程。
Southern印迹（Southern blot）
《核酸的分子杂交》PPT课件
亲缘关系； 2）用来揭示核酸片段中某一特定基因
的存在与否、拷贝数及表达丰度。
精选课件ppt
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二、核酸探针的制备
探针（Probe): 一段带有检测标记的与目的基
因或目的DNA特异互补的已知核 苷酸序列。
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7
探针的制备方法
探针长度一般以50~300bp为宜。
制备方法：
1）利用DNA重组技术
凝胶 滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern 印精迹选杂课件交ppt的技术流程
21
（二）Northern印迹杂交
与Southern杂交类似。检测 目的RNA的存在与否及含量。
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22
（三）Western印迹杂交
将待检测蛋白质（或酶）经 PAGE电泳并染色后，转移到滤膜 上固定，再用“抗体-抗原”免疫 反应或“DNA-protein”结合反应 鉴别滤膜上的蛋白质。
两者比较：后者不及前者敏感，但后者保 存时间较长，无同位素污染。
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12
一个理想的标记物：
1）标记前后探针的基本结构、化学性 质相同;
2）特异性强、本底低、重复性好； 3）操作简单、节时； 4）安全、无环境污染。
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13
2、探针的标记方法
（1）缺口平移法
（2）随机引物标记法
（3）末端标记法
DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
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2
精选课件ppt
3
Content of Table
一、核酸分子杂交技术的原理 二、核酸探针的制备 三、核酸探针的标记 四、核酸分子杂交技术
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的存在与否、拷贝数及表达丰度。
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二、核酸探针的制备
探针（Probe): 一段带有检测标记的与目的基
因或目的DNA特异互补的已知核 苷酸序列。
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7
探针的制备方法
探针长度一般以50~300bp为宜。
制备方法：
1）利用DNA重组技术
凝胶 滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
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21
（二）Northern印迹杂交
与Southern杂交类似。检测 目的RNA的存在与否及含量。
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22
（三）Western印迹杂交
将待检测蛋白质（或酶）经 PAGE电泳并染色后，转移到滤膜 上固定，再用“抗体-抗原”免疫 反应或“DNA-protein”结合反应 鉴别滤膜上的蛋白质。
两者比较：后者不及前者敏感，但后者保 存时间较长，无同位素污染。
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12
一个理想的标记物：
1）标记前后探针的基本结构、化学性 质相同;
2）特异性强、本底低、重复性好； 3）操作简单、节时； 4）安全、无环境污染。
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2、探针的标记方法
（1）缺口平移法
（2）随机引物标记法
（3）末端标记法
DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
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一、核酸分子杂交技术的原理 二、核酸探针的制备 三、核酸探针的标记 四、核酸分子杂交技术
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《核酸分子杂交》课件
实验步骤
1
样品制备
获得需要研究的核酸样品并进行提取和
合成探针和标记物
2
纯化。
设计和合成与目标核酸互补的DNA或
RNA探针，并标记探针以便检测。
3
杂交反应
将待测核酸样品与探针和标记物进行杂
杂交产物的检测和分析
4
交反应，使它们结合形成杂交分子。
通过不同的检测方法对杂交产物进行分 析和表征，如凝胶电泳、放射性测量等。
核酸杂交的种类
DNA-DNA杂交
两段DNA互相结合形成双链 DNA。
RNA-DNA杂交
RNA和DNA互相结合形成 RNA-DNA杂交分子。
RNA-RNA杂交
两段RNA分子互相结合形成 双链RNA。
应用
检测病原微生物、基因 突变、肿瘤等
核酸分子杂交可用于诊断病 原微生物感染、检测基因突 变和肿瘤相关标记物。
《核酸分子杂交》PPT课 件
核酸分子杂交是指不同DNA或RNA进行结合形成杂交分子的过程。它在分析 核酸序列的同源性和差异性、检测特定序列的核酸以及研究DNA和RNA的结 构、功能和互动关系方面非常重要。
定义
核酸分子杂交是指来自不同DNA或RNA的单链或双链核酸互相结合形成杂交 分子的过程。
重要性
研究基因表达、基因调 控等
通过核酸分子杂交，我们可 以研究基因的表达模式和调 控机制。
设计新型药物和检测方 法
利用核酸分子杂交技术，可 以设计基于核酸的新型药物 和高灵DNA和RNA的结
性和差异性
核酸
构、功能和互动关系
核酸分子杂交可用于比较 DNA或RNA序列，帮助我 们了解核酸之间的相似性 和差异性。
通过配对互补的探针和标 记物，核酸分子杂交可用 于检测具有特定序列的核 酸分子。
《核酸分子杂交》课件
核酸分子杂交的历史背景
01
1952年，S.E.Luria和 M.Delbrück在研究噬菌体的变 异性时，首次提出了分子杂交 的概念。
02
1961年，R.W.Powell和 E.M.Maxam将分子杂交技术应 用于DNA的化学分析。
03
1973年，J.K.Hershey和 M.Chase用分子杂交技术成功 地检测到了噬菌体PSU-13的基 因组DNA。
利用纳米材料如金纳米颗粒、碳纳米 管等，可以实现核酸分子的高效富集 和信号放大，提高杂交信号的强度和 特异性。
在核酸分子杂交中，纳米技术可以用 于构建高灵敏度的传感器和检测器， 实现对基因组中特定序列的快速、准 确检测。
生物信息学在核酸分子杂交中的应用
生物信息学是利用计算机科学和统计学 的方法，对生物学数据进行分析和解读
洗脱
去除未结合的核酸分子，留下 与目标序列结合的核酸分子。
检测
对杂交产物进行检测，确定目 标序列的存在。
核酸分子杂交的原理
互补性
通过碱基互补配对原则，使单链核酸分子与目标 序列结合形成双链结构。
特异性
由于碱基互补配对原则，使得核酸分子杂交具有 高度的特异性。
温度依赖性
通过调节温度，可以控制核酸分子的变性和复性 ，从而控制杂交过程。
比较转录组
利用核酸分子杂交技术，可以对不同 条件下的转录组进行比较，揭示基因 表达的差异和变化规律。
基因突变检测
突变筛查
通过核酸分子杂交技术，可以对基因进行突变筛查，为遗传性疾病的诊断和治 疗提供依据。
突变定位
利用核酸分子杂交技术，可以快速、准确地定位突变位点，为突变机制和功能 研究提供帮助。
基因组测序与比较基因组学
分子杂交和印迹技术PPTPPT讲稿
当前你正在浏览到的事第三十五页PPTT，共六十五页。
（二）待测DNA样品的电泳分离
1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶
分离小片段用高浓度胶 2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子
DNA泳动慢,小分子DNA泳动快， 大小 相同的分子处于同一条带 3、分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂交
所用分子量标准可用核素标记
（2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在 68℃杂交
当前你正在浏览到的事第二十八页PPTT，共六十五页。
5、核酸分子的复杂性： （1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长
度
（2）复性速率与反应体系中核酸复杂性成反比 （3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交 率取决于DNA的相对复杂性
底低。缺点是DNA分子结合不牢固 ②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸
纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高
③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低
当前你正在浏览到的事第四十页PPTT，共六十五页。
2、Southern印迹的常用方法
用缓冲液转移DNA 至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上
凝胶
滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern 印迹杂交的技术流程 当前你正在浏览到的事第三十四页PPTT，共六十五页。
（一）待测核酸样品的制备
1、裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组DNA 3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段
分子杂交和印迹技术PPT课件
当前你正在浏览到的事第一页PPTT，共六十五页。
第一节 核酸分子杂交的基本原理
（二）待测DNA样品的电泳分离
1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶
分离小片段用高浓度胶 2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子
DNA泳动慢,小分子DNA泳动快， 大小 相同的分子处于同一条带 3、分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂交
所用分子量标准可用核素标记
（2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在 68℃杂交
当前你正在浏览到的事第二十八页PPTT，共六十五页。
5、核酸分子的复杂性： （1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长
度
（2）复性速率与反应体系中核酸复杂性成反比 （3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交 率取决于DNA的相对复杂性
底低。缺点是DNA分子结合不牢固 ②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸
纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高
③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低
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2、Southern印迹的常用方法
用缓冲液转移DNA 至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上
凝胶
滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern 印迹杂交的技术流程 当前你正在浏览到的事第三十四页PPTT，共六十五页。
（一）待测核酸样品的制备
1、裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组DNA 3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段
分子杂交和印迹技术PPT课件
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第一节 核酸分子杂交的基本原理
第七章 核酸分子杂交技术与核酸序列测定ppt课件
链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放 在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间 有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分 子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。
整理版课件
6
复性
RNA
DNA
整理版课件
7
1. 原理
DNA的变性与复性
2. 常见条件：加热
S形曲线
解链温度（Tm）
A260增高的原因
3. 分子杂交的目的
整理版课件
8
应 用： (1)检测特定生物有机体之间是否存在
亲缘关系； (2)用来揭示核酸片段中某一特定基因
的存在与否、拷贝数及表达丰度。
整理版课件
Home
9
DNA变性的本质是双链间氢键的断裂
整理版课件
10
例：变性引起紫外吸收值的改变
DNA的紫外吸收光谱
➢ 增色效应：DNA变性时其溶液A260增高的现象。
生物信息学(bioinformation) 是一门伴随着基因组研究 而产生的交叉学科。广义地说，它是从事与基因组研究有关 的生物信息的获取、加工、储存、分配、分析和解释的一门 学科。这个定义包含两层意思，即对海量数据的收集、整理 以及对这些数据的应用。
整理版课件
54
核酸序列分析的基本原理
化学裂解法 (Maxam-Gillbert法) DNA链的末端合成终止法 (sanger法)
将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染 色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原” 免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤 膜上的蛋白质。用于蛋白质定性定量及相互
作用研究。
常用Ab来检测蛋白质，也被称为免疫 印迹技术 。
靠电转移将蛋白质从凝胶转移到膜上。
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6
复性
RNA
DNA
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7
1. 原理
DNA的变性与复性
2. 常见条件：加热
S形曲线
解链温度（Tm）
A260增高的原因
3. 分子杂交的目的
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8
应 用： (1)检测特定生物有机体之间是否存在
亲缘关系； (2)用来揭示核酸片段中某一特定基因
的存在与否、拷贝数及表达丰度。
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9
DNA变性的本质是双链间氢键的断裂
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10
例：变性引起紫外吸收值的改变
DNA的紫外吸收光谱
➢ 增色效应：DNA变性时其溶液A260增高的现象。
生物信息学(bioinformation) 是一门伴随着基因组研究 而产生的交叉学科。广义地说，它是从事与基因组研究有关 的生物信息的获取、加工、储存、分配、分析和解释的一门 学科。这个定义包含两层意思，即对海量数据的收集、整理 以及对这些数据的应用。
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54
核酸序列分析的基本原理
化学裂解法 (Maxam-Gillbert法) DNA链的末端合成终止法 (sanger法)
将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染 色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原” 免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤 膜上的蛋白质。用于蛋白质定性定量及相互
作用研究。
常用Ab来检测蛋白质，也被称为免疫 印迹技术 。
靠电转移将蛋白质从凝胶转移到膜上。
分子杂交与印迹技术-PPT精品
变性后其它理化性质变化：
OD260增高 比旋度下降
粘度下降 浮力密度升高
酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失 目录
DNA变性的本质是双链间氢键的断裂
例：变性引起紫外吸收值的改变
DNA的紫外吸收光谱
➢ 增色效应：DNA变性，由于解链使更多的共轭双键暴露，
使其溶液OD260增高，并与解链程度有一定的比例关系的现
• 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 • 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 • 显色反应：酶促反应
Western印迹杂交
三 种 印 迹 技 术 的 比 较
放 射 自 显 影 照 片
目录
(四)原位杂交(in situ
hybridization)
• 将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸 进行杂交，称为原位杂交。
RNA变性电泳
电泳前应加变性剂，如甲醛、乙二醛等使RNA二级结构解体，才能使RNA 严格按相对分子质量大小分离。变性剂还可促进RNA与硝酸纤维素膜结合。
印迹转移
若待测的RNA片段较大，可预先将凝胶置于0.05mol/L NaOH中浸泡20 min， 以水解成较小的片段，再用20xSSC浸泡45 min，以加快RNA的印迹转移。
影响下一步酶促反应
放射性标记-----应用最多的一类
优点
• 可准确定量，灵敏度高可检测固相介质 上10fg(10-15g)的DNA
• 本底低，易除去旧探针重新杂交新探针
• 特异性高, 对杂交无影响
• 短半衰期的探针要求临时制备, 随用随标
缺点
• 放射性递减使探针降解 • 放射性对人体有害,需防护
• 费用贵
RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不
同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。
OD260增高 比旋度下降
粘度下降 浮力密度升高
酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失 目录
DNA变性的本质是双链间氢键的断裂
例：变性引起紫外吸收值的改变
DNA的紫外吸收光谱
➢ 增色效应：DNA变性，由于解链使更多的共轭双键暴露，
使其溶液OD260增高，并与解链程度有一定的比例关系的现
• 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 • 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 • 显色反应：酶促反应
Western印迹杂交
三 种 印 迹 技 术 的 比 较
放 射 自 显 影 照 片
目录
(四)原位杂交(in situ
hybridization)
• 将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸 进行杂交，称为原位杂交。
RNA变性电泳
电泳前应加变性剂，如甲醛、乙二醛等使RNA二级结构解体，才能使RNA 严格按相对分子质量大小分离。变性剂还可促进RNA与硝酸纤维素膜结合。
印迹转移
若待测的RNA片段较大，可预先将凝胶置于0.05mol/L NaOH中浸泡20 min， 以水解成较小的片段，再用20xSSC浸泡45 min，以加快RNA的印迹转移。
影响下一步酶促反应
放射性标记-----应用最多的一类
优点
• 可准确定量，灵敏度高可检测固相介质 上10fg(10-15g)的DNA
• 本底低，易除去旧探针重新杂交新探针
• 特异性高, 对杂交无影响
• 短半衰期的探针要求临时制备, 随用随标
缺点
• 放射性递减使探针降解 • 放射性对人体有害,需防护
• 费用贵
RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不
同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。
第一节 核酸分子杂交-PPT
第二十章常用分子生物学技术的原理及应用The Principle and Application of Common Used Techniquesin Molecular Biology掌握：1.分子杂交技术的概念及基本原理2.Southern、Northern、Western印迹法的适用范围。
3.聚合酶链式反应的概念及基本原理4.了解基本概念学习要求学习要求第二十章 常用分子生物学技术第一节 核酸分子杂交第二节 聚合酶链反应第三节 基因文库第四节 生物芯片技术第五节 生物大分子相互作用研究技术核酸的分子杂交：碱基序列互补的单链核酸，根据碱基互补原则，借助氢键相连而形成双链杂交分子的过程。
以DNA的变性和复性为理论基础复性RNA DNA•将探针与固定在NC膜上的DNA或RNA进行结合反应，探针的序列如与NC膜上的核酸序列相互补，就可结合到膜上的相应区带，经放射自显影或其他检测手段就可判断膜上是否有同源的核酸分子存在。
•硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC 膜)探针(probe)的概念用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的已知被标记的DNA片段或RNA片段探针的种类o寡核苷酸探针o基因组DNA探针o cDNA探针o RNA探针•常用探针标记方法：1.放射性核素标记(放射自显影）2.生物素标记（酶联反应-显色）3.地高辛标记（酶联反应-显色）4.分子信标（荧光）第一节 分子杂交技术 – 应用1.Southern印迹杂交法：检测特异DNA片段2.Nouthern印迹杂交法：检测特异的RNA片段3.Western印迹杂交法：检测蛋白质（一）Southern blottingl1975年，英国Edwen Southern创建l检测DNA杂交方法，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。
l原始文献出处：Southern EM. Detection ofspecific sequences among DNA fragmentsseparated by gel electrophoresis. J Mol Biol，1975, 98(3):503-517.（一）Southern blotting10×SSC转移缓冲液Whatman 滤纸凝胶Whatman 滤纸纸巾玻璃板重物支持物500g与探针同源杂交的基因组DNA DNA 酶切片段内切酶NC 膜或尼龙膜Southern转膜---如何转膜？•常用方法：毛细管虹吸印迹法电转印法真空转移法电转印法Southert blotting用途•1、酶切图谱分析•2、特定基因定性和定量•3、基因突变分析•4、限制性片段长度多态性的分析（二）RNA 印迹技术(Northern blotting)相同点：Alwine JC , et al . Method for detection of specific RNA s in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes.Proc Natl Acad Sci USA, 1977, 74(12):5350-5354原始文献出处名称相对于Southern blotting•转移的是RNA •转移前无需酶切•转移效率较高•变性方法不同点原理均为毛细作用。
《核酸分子杂交技术》课件
核酸分子杂交原理
互补配对
核酸分子通过互补配对原理相 结合，碱基之间形成稳定的氢 键。
熔解
通过改变温度，使两条核酸分 子解开，断裂氢键，分离出单 链。
探针结合
利用互补配对原理，核酸探针 与目标核酸结合，形成稳定的 双链结构。
核酸探针的制备
1
设计探针序列
根据目标核酸序列设计探针，考虑碱基
合成探针
2
互补性和特异性。
《核酸分子杂交技术》 PPT课件
核酸分子杂交技术是一种重要的实验技术，能够研究DNA和RNA的结构、功 能以及相互作用。让我们一起探索这门神奇的科学吧！
什么是核酸分子杂交技术
1 定义
核酸分子杂交技术是指通过核酸探针与目标 核酸的互补碱基配对作用实现的一种检测、 分离和研究方法。
2 原理
该技术利用核酸分子的碱基互补性特点，使 探针与目标核酸发生相互结合，从而实现目 标分子的检测和定位。
利用合成技术合成目标序列的核酸探针。
3
标记探针
通过化学反应或酶标记等方法，将探针 标记上荧光剂或放射性示踪剂。
应用领域
遗传研究
核酸分子杂交技术在遗传研究中 起到了至关重要的作用，帮助人 们了解遗传信息的传递和变异。
医学诊断
通过核酸分子杂交技术，可以检 测病原体和基因突变，用于疾病 的早期诊断和治疗。
法医分析
核酸分子杂交技术用于法医学领 域的DNA鉴定和犯罪现场的分析， 提供了重要的法律证据。
核酸分子杂交技术的优势
1 高度特异性
通过合理设计探针序列， 核酸分子杂交技术能够高 度特异地检测目标核酸。
2 灵敏度高
核酸分子杂交技的特点。
3 广泛应用
核酸分子杂交技术在基础 研究、生物医学、农业科 技等领域均有广泛应用。