肿瘤细胞与分化、凋亡

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3 透射电镜观察
图8A 未处理的HL-60细胞 透射电镜×6000
图8B DADS处理的HL-60细胞 透射电镜×6000
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4 DNA断片法或称琼脂糖凝胶电泳“梯形条带”图谱法
原理：凋亡细胞的基因组DNA常首先被剪切为200300kb和30-50kb的片断（“结构域式”剪切），再进一步 降解产生大小相当于核小体(160-200bp)的倍数的寡核小体 片断（“裂解”/“梯子式”剪切）。因此，在琼脂糖凝胶 电泳图谱上凋亡细胞表现为特征性“梯子”样外观。
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５.TUNEL法（末端DNA转移酶dUTP缺口末端标记法）
原理：DNA聚合酶能够填补双链DNA中的单链缺 失部 分，应用放射性同位素、生物素和荧光素等标记的三磷酸核 苷酸形成新的DNA。 TUNEL法是在含标记dUTP的反应体系 中，加以末端DNA转移酶。故又称为TdT(terminal deoxytransferase)法。该法是应用无需模板的DNA聚合酶，延伸 核苷酸的碱基序列与DNA底物无关。
Fra Baidu bibliotek
• 2 Bcl－2基因介导的肿瘤治疗
• 3 泛素－蛋白酶体降解途径介导的肿瘤治疗
• 4 三氧化二砷介导的血液系统恶性肿瘤治疗
• 5 DADS诱导肿瘤细胞凋亡
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细胞凋亡的检测方法
1 台肦蓝（trypan blue)染色法
原理：trypan blue 是一种细胞膜非通透性染料。坏死 细胞因细胞膜受损而被台肦蓝着色染色。因此，该法能区 分细胞的生存状态，简单、便捷、常规用于细胞死亡的初 步评价和细胞存活率评价。
和橙色荧光。其中，AO能透过完整的细胞膜，而EB则只能
染色胞膜受损的细胞。因此， AO/EB双染法能借助荧光显
微镜或流式细胞仪区分活细胞或早期凋亡细胞和坏死或继
发性坏死细胞。
注意事项：应用单一形态学计数凋亡细胞数（凋亡指
数，apoptosis index)常受到主观因素的干扰，其个体间甚
至同一主体的重复性较差。
1DADS+SB
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图7 PI/Annexin V双染色检测DADS作用HL-60细胞12h后凋亡率的变化
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3.3 流式细胞仪检测凋亡率
apoptotic cells(%)
35
30
25
20
15
10
5
0
untreated
PD
SB
DADS5
DADS10 DADS10+PD DADS10+SB
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荧光显微镜观察
图9A 未处理的HL-60细胞 吖啶橙 ×40
图9B DADS处理的HL-60细胞 吖啶橙 ×40
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3 电子显微镜观察法
电镜下超微结构观察虽可显示凋亡细胞的许多特 点，如膜发泡和某些结构如微纤毛的丢失、染色质固 缩和线粒体超浓缩等，但由于样本制备复杂、耗时， 该项技术主要用于获取细胞凋亡的定性检测。
亡率要在15%以上才能呈现典型“DNA ladder” 。故有
DNA ladder可以肯定凋亡存在，没有DNA ladder不能排
除凋亡的存在。
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图5 不同浓度DADS作用HL-60 细胞24h后DNA梯状条带的形成
图6 60 μmol·L-1 DADS作用HL60细胞不同时间后DNA梯状条带 的形成
注意事项：识别亚G1期细胞的同时，必须将它和细胞碎 片区分开来，因为细胞碎片的DNA含量也明显低于G1期细胞。
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2.3 流式细胞仪检测凋亡率
control 1DADS
5mg·L-1DADS
7.5mg·L-1DADS 10mg·L-
15mg·L-1DADS 20mg·L-1DADS 10mg·L-1DADS+PD 10mg·L-
注意事项：梯状DNA(DNA ladder)现象常被看作是细
胞凋亡的重要生物化学标志。但是，日益增多的资料显示
并不是所有表现凋亡形态学特征的细胞都是呈现这种梯子
样外观。因此，缺乏梯状DNA并不能排除细胞凋亡的存在。
据报道，某些细胞系如K562细胞凋亡常发生单链而不是双
链DNA降解，故不能形成“DNA ladder”。另外，一般凋
注意事项：该法不能区别继发性坏死和真正意义上的坏 死细胞；也容易低估细胞死亡程度。（因为早期凋亡细胞 具有完整的细胞膜而被误当作活细胞）
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2.丫啶橙染色（acridine orange, AO)和溴化乙啶(ethidium
bromide, EB)双染法
原理：AO和EB都是结合DNA的荧光染料，分别产生蓝色
细胞凋亡的生物学意义
1 胚胎发育和形态发生 2 细胞稳态和免疫机制 3 衰老 4 肿瘤发生及化学治疗
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细胞凋亡和恶性肿瘤
• 1 Bcl－2和恶性肿瘤 • 2 P53和恶性肿瘤 • 3Bcr-abl和恶性肿瘤 • 4 PML-RARα蛋白和恶性肿瘤
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2
细胞凋亡干预和肿瘤治疗
• 1 野生型P53基因介导的肿瘤治疗
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细胞凋亡死亡受体相关信号途径
注意事项：该法只能了解DNA是否断裂和发生DNA断裂 的细胞数量，虽然在理论上对这种方法的特异性尚有争议， 但操作简便，并且可大量应用于回顾性研究，从而成为目前 较为流行的细胞凋亡评价方法。
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TUNEL检测结果
图10A 未处理的HL-60细胞 TUNEL ×20
图10B DADS处理的HL-60细胞 TUNEL ×20
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6 PI染色流式细胞术测定凋亡率
原理：实验证明凋亡细胞在固定和清洗过程中降解的小分 子量DNA 外漏，导致细胞内DNA含量减少。因此，应用DNA 特异荧光染料（如碘化丙啶，propidium iodide, PI）染色后， 在FCM进行的细胞周期分析中，凋亡细胞常以亚二聚体形式出 现。亚二倍体细胞群被称为亚G1期（sub-G1)细胞。它的出现 被认为是凋亡细胞的重要标志。
Fig15 Effects of SB205980 and PD98059 on DADS -induced apoptosis in HL-60 cells
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图12 PI/Anexin-V双染色流式细胞仪检测DADS作用
K562细胞12h后凋亡率的改变
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图13 流式细胞仪检测DADS作用K562细胞24h、48h后的凋亡率改变