开题报告

四、研究进度安排
2011.8-2011.12：确定课题，查阅、搜集、整理相关资 料文献，明确实验思路并制定实验方案，完成开题报告。
2012.1-2012.8: 进行指纹图谱的研究和含量测定，完成 课题。
2012.9-2012.10：整理试验数据，分析试验结果并进行 讨论。 2013.11-2013.3：撰写毕业论文，准备毕业答辩。
测定步骤：对照品溶液的制备： 精密称取在120摄氏度干燥至恒重的芦丁对 照品25mg，置50ml量瓶中，加乙醇适量，超声处理溶解，放冷，加乙醇至 刻度，摇匀。精密量取20ml，置50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。 标准曲线的制备：精密量取对照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml， 分别置25ml量瓶中，各加水至6ml，加5%亚硝酸钠溶液1ml，摇匀放置6分 钟，加10%硝酸铝溶液1ml，摇匀放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，在加水 至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应试剂为空白，立即照紫外-可见分光光度 法，在500nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制 标准曲线。 取山楂叶药材细粉约1g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加热回流 提取至提取液无色，弃去三氯甲烷液，药渣挥去三氯甲烷，加甲醇继续至无 色（约4小时），提取液蒸干，残渣加稀乙醇溶解，转移至50ml量瓶中，加 稀乙醇至刻度，摇匀，作为供试品储备液。取供试品储备液，滤过，精密量 取续滤液5ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。精密量取2ml，置 25ml量瓶中，加水至6ml，加5%亚硝酸钠溶液1ml，摇匀放置6分钟，加 10%硝酸铝溶液1ml，摇匀放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，在加水至刻度 ，摇匀，放置15分钟，以相应试剂为空白，立即照紫外-可见分光光度法，在 500nm波长处测定吸光度。从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量，计 算，即得。
②检测波长的选择：经二极管阵列检测器190-400nm扫描，综合考虑 山楂叶中各个成分的吸收光谱，以及光谱吸收背景的干扰，选择能充 分反映样品组分全貌的检测波长。
③流动相的选择：比较甲醇和乙腈对样品的分离，通过加甲酸、四氢 呋喃等试剂以及调整其不同的比例以优化流动相条件，选择使峰分离 度较好和基线更加平稳的流动相。 ⑶确认指纹图谱相似度：评估计算拟采用药典委员会推介试用的《中 药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》进行模式分析并分别计算不同 批次山楂叶的相似度从而确定不同批次药材间质量的稳定性。
2、采收 采集地点：承德市双桥区、承德县、丰宁县、围场县、兴隆 县、宽城县、滦平县、隆化县、平泉县。 采集时间：2011年5月至2011年11月，每月采集一次,山里红叶
和山楂叶分开采集。
3、炮制 炮制方法：暴晒干燥后粉碎成细粉 4、贮藏 至于干燥、避光处保存
（二）山楂叶高效液相色谱指纹图谱的建立 ⑴优化提取方法：
（五）山楂叶单体化合物的提取分离
山楂叶75%乙醇提取物
三氯甲烷萃取
水饱和正丁醇萃取 聚酰胺柱色谱分离 硅胶柱色谱分离
单体化合物
三、研究创新点与难点
1、创新点：现在市售的山楂叶药材，大部分都是在十一月山楂叶落叶 后采集的、自然晾干干燥的，而经过前一段时间的预实验发现，在采集 时间、采集地点、提取方法、色谱条件完全相同的前提下，暴晒干燥的 山楂叶药材的HPLC指纹图谱7个指标化合物的峰高峰面积等含量指标 明显高于市售的山楂叶药材。 2、难点：目前采用的紫外-可见分光光度法测量山楂叶提取物的总黄 酮的含量的方法是2010版药典中规定的测量山楂叶提取物总黄酮含 量的NaNO2-AlCl3-NaOH 显色比色法，这种方法操作复杂，显色后 供试品稳定性差，容易在测量中造成较大的误差，所以在测量方法 上有待进一步研究和改善。
①提取方法的选择：通过比较加热回流法、索氏提取法和超声法等 筛选省时高效的提取方法。
②提取溶剂的选择：比较不同提取溶剂（30%乙醇、50%乙醇、60% 乙醇、70%乙醇、75%乙醇、80%乙醇、90%乙醇和甲醇的此平行浓 度）的提取结果，选择最优提取溶剂及浓度。 ③料液比的选择：选择不同的药材量和溶剂量的比例（3倍量、5倍 量、10倍量、15倍量等）进行筛选，以合适的峰高和峰面积为依据 确定最优料液比。
山里红叶 山楂叶 山楂叶
山楂叶的化学成分
黄酮化合物：山楂叶总黄酮(HLF) 中含有黄酮及其苷类、黄酮醇及其苷类、 双氢黄酮苷类、异黄酮醇类、花色苷类、橙酮类和聚合黄酮类等从山楂叶中 分离出的黄酮类化合物有，牡荆素-4- 鼠李糖苷，乙酰牡荆素-4- 鼠李糖苷， 牡荆素-4′,7- 双葡萄糖苷，金丝桃苷，2″-O- 乙酰基牡荆素，6″-O- 乙酰基牡 荆素，素-2 ″-O- 鼠李糖苷，pinnatifidaA，pinnatifidaB，山萘酚，7-O-αL- 鼠李糖-3-O-β-D- 葡糖山萘酚，槲皮素，3-O-β-D- 吡喃葡糖槲皮素，3-Oβ-D- 吡喃半乳糖槲皮素，3-O-β-D- 吡喃葡糖(6 →1)-α-L- 鼠李糖槲皮素，3O-β-D- 吡喃半乳糖(6 →1)-α-L- 鼠李糖槲皮素，芦丁，4″-O- 鼠李糖芦丁， pinnatifidaC 和pinnatifidaD等。
比色法：供试品本身在紫外-可见光区没有强吸收，或在紫外光区虽 有吸收但为了避免干扰或提高灵敏度，可加入适当的显色剂，使反 应产物的最大吸收波长 移至可见光区。当吸光度和浓度关系不呈良 好线性时，应取数份梯度量的对照品溶液，用溶剂补充至同一体积 ，显色后测定各份溶液的吸光度，然后以吸光度与相应的浓度绘制 标准曲线，再根据供试品的吸光度在标准曲线上查得其相应的浓度 ，再依照对照品比较法求其含量。
（四）紫外-可见分光光度法测定山楂叶总黄酮含量
分光光度法：是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内 的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。
对照品比较法：分别配制供试品溶液和对照品溶液，对照品溶液中 所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分规定量的100%±10% ，所用溶剂也应完全一致，在规定的波长处测定供试品溶液和对照 品溶液的吸光度后，按下式计算供试品中被测溶液的浓度: cx=(Ax/AR)cR,式中cx为供试品溶液的浓度，Ax为供试品溶液的吸光度 ，cR为对照品溶液的浓度，AR为对照品溶液的吸光度。
（三）现行质量标准的局限
目前，山楂叶的质量控制仅停留在对山楂叶乙醇提取物 的紫外-可见分光光度法总黄酮含量测定和单一指标成分金丝 桃苷HPLC法的含量测定上，而含量测定作为中药质量标准 中的关键内容之一，对于中药材有效成分而言，可在很大程 度上控制药材质量，但对于含有复杂成分的中药材而言，显 然还不够完善。中药材，在选择含量测定指标时应综合考虑 各活性成分、特征成分、毒性成分及提取工艺等情况，选择 多个质控指标并建立含量测定方法，构建多指标含量测定体 系。因此，对山楂叶药材多种指标成分的含量测定以及指纹 图谱控制还有待更深入的研究，而制定山楂叶药材全方位的 质量控制标准也刻不容缓。
有机酸类化合物：山楂叶含有绿原酸、山楂酸、熊果酸、乌索酸、五加 皮酸、咖啡酸、对羟基肉桂酸、对羟基苯甲苹果酸、2α,3β，19α- 三羟 基熊果酸等。
其它类：山楂叶还含有皂苷、胆碱、嘌呤衍生物、多糖类、原花青素、 盐酸二乙胺、山梨醇、多种微量元素(K、Ca、P、Mg、Fe、A1 等)、氨 基酸、维生素B1、维生素B2、维生索C、尼克酸 等成分。
（四）中药指纹图谱技术
中药的综合的宏观的非线性特征使其无法用线性分析的思维和手 段模仿西药的质量控制模式解决 中药的质量控制问题。 中药指纹图谱全称为中药化学指纹图谱，是指中药经适当处理后 ，采用一定的分析手段和仪器检测得到的能够标识其中各种组分群 体特征的共有峰的图谱，是以系统的化学成分研究和药理学研究为 基础，经化学测定或基因鉴定得到的某种或某产地中药及其制剂所 共有的、具有特异性的组分群体（某类或数类成分）特征图谱或图 像，“整体性”和“模糊性”为其显著特点，是一种综合的、可量 化的鉴定手段。由于指纹图谱系统性、专属性、重现性三方面的特 征，使其一方面对药材或制剂整体质量的理化描述，对供试品的定 性起到特征说明、指纹描述的作用；另一方面，指纹图谱由于采用 了相对比值，并且通过与参照峰的比较进行数据处理，具有半定量 的功能，使得与功效之间的相关性在这里取得了一定的理化基础。 所以，利用色谱指纹图谱来控制中药的质量必定是建立中药质量标 准体系的主要手段之一。
山楂叶药材的质量控制研究
专 业：中药学
研究方向：中药质量控制 研究生姓名： 导师姓名：
1
研究背景及意义
2 3 4
研究内容及方法 研究创新点与难点 研究进度安排 研究可行性分析
5
一、研究背景及意义
山百度文库叶
临床应用价值
市场价值
现行质量标准 的局限
中药指纹图 谱技术
山楂叶为蔷薇科植物山里红或山楂等的叶，经本草 考证，山楂之名始载于《本草纲目》，在此之前，以“ 赤爪草”始载《新修本草》，历来为药食两用之佳品。 山楂属广泛分布于北半球，北美种类很多, 全世界有该 属植物280 余种，中国约产17种。我国山楂叶植物资源 非常丰富, 山西晋城、北京延庆、河北承德地区都有分 布。山楂叶主要含有黄酮类化合物( 槲皮素、金丝桃苷 、牡荆素、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷等)、有 机酸类化合物及一些微量元素。
（三）山楂叶高效液相色谱法7种指标化合物的含量测定
在高效液相色谱指纹图谱建立的基础上，测定绿原酸、牡荆素葡萄 糖苷、牡荆素鼠李糖苷、芦丁、牡荆素、金丝桃苷、槲皮素 七种山 楂叶所含有的已知结构的指标化合物的含量。 测定方法：外标法；外标法是以待测成分的对照品作为参照物质 ，相对比较以求得供试品的含量方法。 具体步骤：精密称取对照品和供试品，分别配制成对照品溶液和 供试品溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量 对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积（或峰高），按下 式计算含量 含量（CX）=CR×Ax/AR
④提取时间的选择：通过试验不同的时间（0.5h、1h、1.5h、2h、 2.5h、3h等），在不破坏有效成分和提出成分尽量多的前提下选择 最适宜的提取时间。
⑤在以上单因素实验的基础上确定各个环节提取的最佳工艺参数。
⑵优化色谱条件： ①色谱柱的选择：选择至少三个不同厂家生产的色谱柱测试样品，以 峰形、峰数、分离度等均较好的作为首选。
二、研究内容及方法
山楂叶药材的鉴别、采收、炮制、贮藏
建立山楂叶高效液相色谱指纹图谱
山楂叶高效液相色谱法7个指标化合物的含量测定
紫外-可见分光光度法测定山楂叶总黄酮含量
山楂叶单体化合物的提取分离
（一）山楂叶药材的鉴别、采收、炮制、贮藏 1、鉴别 山楂叶蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br. 或山楂Grataegus pinnatifida Bge.的干燥叶。 原形态 山里红： 落叶乔木，高达6m。枝刺长1-2cm，或无刺。单 叶互生；叶柄 长2-6cm；叶片阔卵形或三角卵形稀菱状卵形，长6-12cm，宽5-8cm，有 2-4对羽状裂片，先端渐尖，基部宽楔形，上面有光泽，下面沿叶脉被短柔 毛，边缘有不规则重锯齿。伞房花序，直径约4-6cm；萼筒钟状，5齿裂； 花冠白色，直径约1.5cm，花瓣5，倒卵形或近圆形；雄蕊约20，花药粉红 色；雌蕊1，子房下位，5室，花柱5。梨果近球形，直径可达2.5cm，深红 色，有黄白色小斑点，萼片脱落很迟，先端留下一圆形深洼；小核3-5，向 外的一面稍具棱，向内面侧面平滑。花期5-6月。果期8-10月。 山楂： 本种与山里红极为相似，仅果形较小，直径1.5cm；叶片亦较小， 且分裂较深。
（一）临床应用价值
1、功能与主治：活血化瘀，理气通脉，化浊降脂。用于气滞血瘀 ， 胸痹心痛，胸闷憋气，心悸健忘，眩晕耳鸣， 高血脂症。 对心脑血管的作用 降血压、降血脂、降血糖的作用 2、药理作用 抗氧化的作用
抗炎作用
（二）市场价值
分布范围广，产量高 1、资源丰富、成本低廉 种植成本低，易采收
多种中成药的原料药 2、市场需求量大 可作为保健品，泡茶饮用