临床免疫学检验的质量保证

三、标本的采集、传送与保存
• 标本的采集：可用作ELISA的标本十分广泛，
体液（如血清，血浆，各种积液），分泌物（如
唾液）和排泻物（如粪便，尿液）均可作为标本
以测定其中的抗原或抗体成分，一般使用血清。
◎标本采集时应尽量避免溶血，因红细胞破裂可释
放过氧化物酶活性物质干扰结果，可造成假阳性；
◎长菌的标本同样的道理易产生假阳性。
显色和比色
◎HRP催化底物的一步呈色反应，同样需要
一定的时间和温度。
◎ 一定要按照说明书规定的时间温度（一般
为37°C，10-15分钟）恒定反应后终止。 ◎显色反应终止后应立刻比色（30分钟内）。
报告方式
•定性试验 国内外为便于统一计算，一律按S/C.O方
式报告，S为标本A值，C.O即Cut Off值（阳性判 定值) ◎夹心法和间接法以S/C.O≥1为阳性；
报告结果的过程
• 包括标本前处理、标本检测
• 还应包括检测体系的建立、人员培训、检测系统的选
择和性能确认、室内质量控制和室间质量控制、实验
室间比对等内容
• 分析中阶段是决定检验结果正确、可靠的关键
工作人员培训
• 特点：项目广泛，技术众多，既有手工操
作，又有自动化仪器操作
• 根据实际工作需要，建立定期培训计划，
质控（阳性对照）下限超限，此时，应考虑HOOK效应的发生
HOOK效应处理对策
当监控到HOOK效应的发生时，应在LIS系
统上回顾病人结果，对可疑结果、阳性低值
结果、在cut-off值附近的结果采用同步稀释
法进行重复试验
室间质量控制
• 室间质量评价： • 为客观比较一实验室的测定结果与靶值的差异， 由外单位机构采取一定的方法，连续、客观地评 价实验室的结果，发现误差并校正结果，使各实 验室之间的结果具有可比性 • 这是对实验室操作和实验方法的回顾性评价，而 不是用来决定实时的测定结果的可接受性
（二）检验项目的申请原则
应结合患者的病情选择适合的检验项目
1.针对性: 检测指标要符合临床医师的检测目的 2.有效性: 对诊断疾病的敏感性和特异性 3.时效性: 结果回报的及时性 4.经济性: 避免增加患者经济负担
二、患者准备
• 医护人员、样本采集人员、检验技术人员应了解
采集前患者的状态要求和影响结果的非疾病因素 • 将相关的要求和注意事项通过合适的途径告知患 者，以获得患者的配合 • 保证所采集标本能客观真实反映当前的疾病状态
3. 熟悉常用免疫学检验的质量控制、室间质量评价
4. 了解质量保证、室内质控和室间质量评价之间的
关系，免疫学质量控制的意义
免疫学检验质量控制的有关概念
1．质量保证（quality assurance，QA）
2．室内质量控制(internal quality control，
IQC)
3．室间质量评价(external quality assessment， EQA)
• 测定不精密度的主要来源是随机误差，以标准差（SD） 和/或变异系数（CV）具体表示 • SD或CV越大，表示重复测定的离散度越大，精密度越 差，反之则越好
• 标准品(物)：
• 指性质纯正的己知含量或成分的物质，通常用以
比较检测未知的物质或成分
• 标准品有WHO国际标准品和国家标准品
• 质控物(品)：
标本的采集
◎抗凝不完全的标本因纤维蛋白原的干扰而造成假阳性，建议尽 量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝剂。 ◎标本在冰箱中保存时间过长易导致血清IgG聚合，使间接法的
试剂本底加深，一般血清置4℃冰箱5天内完成测试。如需保存
一周以上则要-20℃冰冻保存，融解时应上下颠倒充分混匀，同 时避免气泡。 ◎ELISA的灵敏度>1ng/ml水平上,标本间的污染要尽量避免，尤 其不应与生化试验用同一管标本.最起码应先做免疫后做生化。
• 参考期间验证
定性检测系统
• 符合率（灵敏度 特异度）验证
• 精密度（批内精密度 批间精密度，即中间
Байду номын сангаас精密度）验证
• 检出限验证 • 临界值（cut-off值）验证
方法学性能验证
实验方案
实验计划
实验实施 实验报告
标准操作规程的建立
• 在免疫测定中，试剂准备、加样、温育、洗板、
显色和测定等每一步骤均可能对测定结果产生较 大影响 • 因此，需要将每个操作步骤标准化并形成“标准 操作程序”（SOP），所有操作人员必须按照 SOP进行试验操作
保证工作人员的技术能满足临床免疫检验 的需求
工作人员培训
◎ 熟悉检测仪器的原理及性能；掌握数据处
理的能力和质量控制知识。
◎某些特殊项目的检测如抗HIV等需经有关部 门组织的专门培训班，考试合格后持证上岗。
检验系统性能确认
• 定量检测系统：
• 精密度（批内、批间） • 准确度 • 分析测量范围 • 临床可报告范围
临床免疫学检验
（ Clinical Immunoassay）
昆明医科大学附属甘美医院检验 医学教研室 田 敏
(Min Tian)
第十九章 临床免疫学检验的质量保证
第一节 分析前质量控制
第二节 分析中质量控制
第三节 分析后质量控制
目的要求
1. 掌握免疫学检验质量控制的有关概念及质量控制
原则
2. 掌握标本的正确收集及处理
建议采用弱阳性质控物作Levey-Jennings质控图， 横坐标（X轴）表明的是检测日期，纵坐标（Y轴）用
吸光度值表示。
旨在监测和控制本室常规工作的精密度、灵敏度，提高 批内批间样本检验的一致性
检出假阳性反应和假阴性反应
建议采用Westgard质控规则改良法对第
三方阴性、弱阳性质控进行分析

◎如用滴瓶滴加试剂应先将滴瓶摇匀并挤去第一滴 有气泡的试剂后加样。
• ELISA竞争法的本质：酶标抗体与样本抗体
在同样体系中，与固相抗原竞争结合是等比 例关系。 • 正确的加样：应该先将样本与酶标抗体混合 均匀，然后加入孔中反应。 • 实际工作中
分开加
• 分开加会造成先加入的先结合，与后加入者并不
③ HOOK效应的监控。
质控物的选择： 质控物来源：均采用自制质控物质。 浓度梯度的设置： （1）阴性质控：0.5倍Cut Off值附近的阴性OD值 （2）阳性质控： 弱阳性质控：2-4倍Cut Off值附近的弱阳性OD值 阳性质控：试剂盒所带阳性对照OD值
控制提供反应的仪器/系统的稳定性
• 实验室间比对是按照预先规定的条件，由两个或
多个实验室对相同或类似检测物品（通常是患者 新鲜标本）进行检测（主要针对一些不能参加室 间质量控制的项目） • 人员比对是指实验室为发现及纠正不同工作人员 从事相同检测项目而导致检测结果存在可接受的 偏倚而采取的措施
实验室环境、设施及设备的控制
• 环境：
• 温育常采用的温度有43 ℃、37 ℃、室温和
4 ℃（冰箱温度）等。37 ℃是实验室中常 用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的 合适温度。
洗涤
• 洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却
也决定着实验的成败。 • ELISA是靠洗涤来达到分离结合与未结合抗原抗 体复合物及酶标记物的目的。 • 同时洗涤也可将非特异吸附的蛋白质的干扰以及 血球、细菌中的酶干扰清除掉。
加样
◎在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加
底物。
◎加样应用微量移液器（加样枪)按规定的量加入微孔板的1/3 处避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。
◎每次加样应更换吸嘴，做到一人一吸头，以免发生交叉污染; 干吸头预先在血清中抽吸三次。
加样
◎样本稀释，目的是为了减少非特异性反应，所以 一定要先加稀释液后加样本，特别注意加样后要在 微量振荡器上振荡30秒钟，同时注意防止液体溢出。 如后面操作步骤中加二种以上试剂时均需振荡混匀。
◎竟争法与中和法以S/C.O﹤1为阳性
室内质量控制
• 定量室内质量控制：L-J质量控制图
• 定性室内质量控制
定性室内质量控制
定性试验的临床意义在于是否检出病原体，与检出量无关， 因此QC要保证： ① 控制提供反应的仪器/系统的稳定性（灵敏度和特异性）。 ② 检出假阳性反应和假阴性反应（即符合率和一致性）。 （保证检测结果阳性就是阳性、阴性就是阴性）
是公平竞争关系，也不符合等比例原则。特别是
在放置时间过长，温度过高的情况下，对结果的
影响很大。
• 有研究表明，2min后加入酶标抗体，由于标本比
酶标抗体先结合了2min，因此可出现7.4%的假
阳性。30min后再加，假阳性率高达57.4%。
温育
• 在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加
标本和加酶结合物后的显色反应。
• 是用以校准物相同的介质制备的，具有较好的稳 定性和重复性 • 其作用主要是控制仪器的稳定性，以保证仪器、 试剂、工作环境具高度的稳定性
第一节 分析前质量控制
一、检验项目的申请
二、患者准备
三、标本的采集、传送与保存
四、影响分析前质量的因素
概述
• 分析前程序，也称为检验前程序，按时间顺序，
检验前程序始于临床医师提出申请，止于启动分 析检验程序。 • 其步骤包括检验申请、患者准备、原始样品采集、 样本转运到实验室、在实验室内部传递及检验前 标本的预处理的全部过程。
• 室内质量控制：
• 由实验室工作人员采取一定的方法和步骤，连续 评价本实验室工作的可靠程度 • 目的是监测和控制本室常规工作的精密度，提高 本室常规工作中批内、批间样本检验的一致性， 以确定测定结果是否可靠、可否发出报告的一项 工作
• 室间质量评价：
• 为客观比较一实验室的测定结果与靶值的差异，由 外单位机构采取一定的方法，连续、客观地评价实 验室的结果，发现误差并校正结果，使各实验室之 间的结果具有可比性 • 这是对实验室操作和实验方法的回顾性评价，而不 是用来决定实时的测定结果的可接受性
绘制中心线和上下失控限三条线，中心
线为质控物测量均值，利用临界值（cut off 值）验证值确定上下失控限。
监控HOOK效应
建议采用试剂盒中试剂盒所带质控（阳性对照）的OD值作 Levey-Jennings质控图来监控，横坐标（X轴）表明的是检测日 期，纵坐标（Y轴）用吸光度值表示。
判断：当第三方质控（阴性、弱阳性）均在控时，试剂盒所带
• 准确度：
• 即待测物的测定值与其真值的一致性程度 • 准确度不能直接以数值表示，通常以不准确度来 间接衡量 • 对一分析物重复多次测定，所得均值与其真值或 参考靶值之间的差异亦即偏差，即为测定的不准 确度
• 精密度：
• 在一定条件下所获得的独立的测定结果之间的一致性程
度
• 与准确度一样，精密度同样也是以不精密度来间接表示
室温： 18℃----25 ℃
湿度：30%---60%
• 设施及设备:
辅助设备及仪器
包括移液器（加样枪），
水浴箱（温箱），洗板机和酶标仪。
辅助设备及仪器
◎移液器：ELISA加样量小（5-100ｕl），其准确性直 接影响实验结果，利用称重法检查：吸取刻度指示量的 水，万分之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在 ±10%以内； ◎水浴箱 经常检查水浴箱温度计所示的温度和水中（或 温箱内）实测温度是否一致，允许有±1℃的误差；
室间质量控制
• 室间质量控制实施途径：
• 室间质量控制可通过能力验证实验（简称PT）来实现 • PT是指多家实验室分析同一标本并由外部独立机构收集、 反馈实验室上报结果并评价实验室检测能力的活动 • 国家级PT计划，由卫生部临检中心组织实施
• 省级PT计划，有省临检中心组织实施
实验室间比对和人员比对
标本的采集
采样时间：晨起空腹
激素和治疗药物测定
三、标本的采集、传送与保存
• 传送与保存：
标本的传送过程中应保证标本的密闭、 防震、防漏、防污染。
四、影响分析前质量的因素
• 检验前影响因素具有：
• 复杂性
• 隐蔽性
• 不可控性 • 责任不确定性
第二节 分析中质量控制
• 分析中阶段是指从标本前处理到标本检测完成，形成
一、检验项目的申请
要求：信息的规范性和完整性
形式：电子、纸质、二者兼有或者口头（必须在规
定时间内补充电子或纸质的才能执行）
（一）申请单格式和填写
（二）检验项目的申请原则
（一）申请单格式和填写
• 患者信息：患者姓名、患者性别及年龄、临床诊断、
患者唯一性标示（住院号、门诊号、病案号等） • 申请医师信息：医师姓名、科室、申请时间 • 原始样本信息：血液、尿液、脑脊液、胸腹水等
免疫学检验质量控制的有关概念
4．准确度（accuracy） 5．精密度(precision) 6．标准品（standard character） 7．质控物(质控品，quality testing materials)
• 质量保证：
• 为一产品或服务项目、为满足特定的质量要求而 提供的具有充分可信性所进行的、有计划和系统 的措施