木质纤维素生物质的酶法糖化
酶法水解木质纤维素预处理工艺进展
２００８年第２期石油作为不可再生能源，必定逐渐走向枯竭。
燃料乙醇以代用燃料作为解决能源危机的重要手段之一，通过改善能源结构来减少对石油的依赖，保证能源的可持续发展。
目前燃料乙醇已经在我国初步实现了规模化生产，但其生产主要以糖类或粮食为原料，其产量受到粮食资源的限制，难以长期满足能源需求。
从发展的观点看，必须扩大乙醇燃料的原料来源。
利用含木质纤维素的生物质原料，如农作物秸秆、林业加工废料、锯末、废纸、城市垃圾等可再生资源，酶解发酵制取乙醇是进一步开拓乙醇生产原料的有效途径。
我国的生物质资源相当丰富，每年仅产生的农作物秸秆就有７．２×１０８ｔ。
将农林废弃物等木质生物质原料转化为燃料乙醇，形成产业化利用，不仅可缓解石油资源的枯竭，还可解决废弃木质生物质资源的再利用问题，消除其造成的环境污染和生态危害。
１纤维素类物质的组成结构常用的植物纤维原料有３类：针叶材、阔叶材、禾本科材，其中针叶材又称软木，如，杉和松；阔叶材又称硬木，如柳、杨和桦等；禾本科材如竹、芦苇、蔗渣、稻草、麦草和高粱秆等；其他韧皮纤维原料，如构皮、桑皮麻类，以及叶部纤维原料，如甘蔗叶、龙须草等。
木质生物质主要成分为纤维素、半纤维素和木质素等。
纤维素是由β、Ｄ－葡萄糖基通过１，４－糖苷键联结而成的线状高分子化合物，其基本组成单位是纤维二糖。
纤维素分子中的β、Ｄ－葡萄糖基含量即为纤维素分子的聚合度。
草本纤维的聚合度较低。
半纤维素是戊糖（木糖、阿拉伯糖）、己糖（甘露糖、葡萄糖、半乳糖）和糖酸所组成的不均一聚糖，为异质多糖，结构与纤维素不同。
硬木半纤维素中含有较多的木聚糖，但软木半纤维素中则含有较多的葡甘露聚糖。
木质素是由苯基丙烷结构单元通过醚键、碳—碳键连接而成的芳香族高分子化合物。
纤维素在生长状态下都被半纤维素和木质素包裹着，因此，原料中半纤维素和木质素的含量差异，会影响纤维素的降解程度。
木质纤维原料中的纤维素一般含量为４０％￣６０％（干基计），半纤维素含量为２０％￣４０％，木质素含量为１０％￣２５％，还有少量其他化学成分。
木质纤维素糖化关键技术
木质纤维素糖化关键技术木质纤维素是一种重要的可再生资源,目前主要应用于高蛋白饲料的原料、为生物燃料及化学原料三个领域。
但是由于天然木质纤维素的化学成分及结构都十分复杂，使其转化为工业发酵可利用的小分子糖类,需通过有效的预处理工艺及利用大量的多种糖苷水解酶共同作用，才能对其进行有效地生物降解。
.因此，一直以来木质纤维素生物转化利用中，所遇到的主要瓶颈是水解过程中糖苷水解酶的种类和用量的高需求及降解方式的低效率,这也是造成纤维素生物转化利用高成本的主要原因。
基于上述原因，本实验室主要开展一下关键技术研究并取得一定进展：一、纤维素酶高产菌种开发：①β—葡萄糖苷酶菌种：通过筛选及一次DNS 诱变获得H16 桧状青霉菌种，β-葡萄糖苷酶酶活达100IU/ml(纤维二糖底物）以上，远远高于里氏木霉和黑曲霉的β—葡萄糖苷酶酶活力，且其Km 是已经报道的真菌胞外β-葡萄糖苷酶最低的，表示具有高纤维二糖结合能力.②全酶系高产纤维素酶菌种:基于组合诱变及基因工程技术具有独立知识产权、兼具木霉青霉特性全酶系纤维素酶高产菌株，目前完成了两种菌种的原生质体融合,最终创制纤维素水解平衡酶系高产菌种.二、底物特异性高效水解酶系制备:①酶系制备：基于里氏木霉诱变菌种DES-15（自RUT-C30 诱变获得，表现菌丝分支多且短的优异发酵性状）及多尺度数学模型控制下的发酵工艺(建立养分消耗、菌丝生长及纤维素水解等模型进而优化发酵工艺），目前在200L 罐发酵原液滤纸酶活达到25FPU 以上；②酶系复配：利用上述酶系，基于木质纤维素组成成分以及结构的差异，调整不同酶及非酶组分组成及用量，制备底物专一性高效复配酶系.目前通过酶系平衡配比以及部分添加剂的使用,滤纸酶活达到35FPU/ml 以上。
三、新型预处理技术：基于桧状青霉小分子蛋白木质纤维素改性机理解析基础上，建立了藻类类生物预处理技术以及气爆玉米秸秆生物与物理化学预处理相结合的新型工艺。
促进木质纤维素类生物质酶解的预处理技术综述
蒸汽爆破后超细粉碎再 酶解得 到了最大 的酶解效率和非常高
的还 原 糖 浓 度 ｎ 。机 械 粉 碎 预 处 理 的 弊 端 是 能 耗 较 高 和 无
法去除木质素 ， 但是随着机械粉碎程度增 大 ， 酶解反应中酶负 荷将会减小 ， 从这一方面又减少 了昂贵的酶的使用 ， 所以机械
预处理在很多研究 中都 和其他预处理联合应用 。
作者简介 ： 岳建芝（ ９ ４ ） 女 ， １７ 一 ， 河南偃师人 ， 博士研究生 ， 讲师 ， 主要
从事 农 业 生 物 环 境 与 能 源 工 程 领 域 的 研 究 。Ｔｌ ０７ ｅ：（ ３ １）
６ ５８ ６ Ｅ—ｍａ ：ａｚｉ ｅ １６ ＣＩ。 ３５ ２ ７； ｉ ｊ ｎｈｙ ＠ ２ ．Ｏｌ ｌｉ ｕ Ｉ
汽爆 破 后 进 行 超 细 粉碎 处理 ， 后 再 进 行 酶解 试验 ， 果 表 明 然 结
加 入半纤维素酶 ， 这将减少酶的使用成本 ， 但反应料液必须脱 毒， 如果反应 液不进行脱毒处理 ， 很多微生物将不能发酵木 聚 糖 。 目前 ， 于稀 酸预处理 或者稀 酸糖化 的多种 反应 器 ， 用 如批式 、 渗透式、 逆流 、 顺流等反应器已经得 到了应用 。 ３ ３２ 碱预处理 ．． 碱预处理指利用 Ｎ Ｏ 石灰或 者氨水去 ａ Ｈ、 除木质素和部分半纤维素 ， 从而提高酶对纤 维素 的可及度 ， 碱 处理可 以有效地提高糖化效果 。碱处理 机理在于 Ｏ 能 Ｈ一
通信作者 ： 张全 国， 教授 ， 博士生导师 ， 主要从事可再生能源转 换技术
方 面 的研 究 。Ｅ—ｍａ ： ｕ ￣ ｏ １３ ｃｍ。 ｉ ｚ ｍｇ ＠ ６．ｏ ｌｑ ｕ
４５～ １ ｍ的 １５ … 。Ｓ ｉｓ ２ ７０ ． 倍 ｉｒ 等认 为球磨可 以降低木质 ｄａ
基于酶水解的高效生物质乙醇生产过程的预处理技术
基于酶水解的高效生物质乙醇生产过程的预处理技术陈军伟;吉福增【摘要】介绍了利用木质纤维原料生产乙醇的主要技术,并指出技术先进、低成本的预处理工艺所需达到的关键指标.与用淀粉或糖类生产生物质乙醇相比,用木质纤维原料生产生物质燃料(即第二代生物质乙醇)具有经济和环境方面的优势,但由于木质纤维原料主要组分较为紧密,阻碍了纤维素和半纤维素水解为可发酵糖的进程.预处理的主要目的是提高酶的可及性,从而提高纤维素降解率.每种预处理方法对纤维素、半纤维素和木素都有特定的影响,应根据后续水解和发酵工艺来确定预处理方法和条件.【期刊名称】《国际造纸》【年(卷),期】2014(033)003【总页数】10页(P62-71)【作者】陈军伟;吉福增【作者单位】【正文语种】中文目前，日益严重的二氧化碳排放问题引起了人们对使用非石油能源的关注。
短期内，对于具有可选择性的可输送燃料（如生物质乙醇或生物质柴油），生物质原料是唯一适合且可再生的基础能源资源。
生物质乙醇连续生产的原料主要为淀粉和糖类，但对其可持续性的争议很大，因此，用木质纤维原料生产生物质乙醇具有现实意义。
木质纤维原料不会与粮食作物形成竞争，而且，比传统农业原料更廉价。
木质纤维原料是最丰富的可再生生物质。
木质纤维原料的生物质转化以及用作乙醇原料具有较多优点，但其发展依然被经济和技术因素制约。
因此，降低乙醇生产成本需要有效利用原料，提高乙醇产量，提高生产效率，提高蒸馏原料中乙醇浓度以及进行生产工艺的整合，从而降低能源需求。
用木质纤维原料生产乙醇包含以下几个关键步骤：纤维素和半纤维素水解，糖类发酵，残余木素分离，按燃料等级要求进行乙醇回收和提纯。
将纤维素水解成可发酵的单糖仍然是技术难点，因为纤维素降解率受许多物理化学因素及结构和组成因素影响，因此水解过程的预处理对于纤维素降解为可发酵糖类是一个必不可少的步骤。
预处理的目的是破坏木素结构和纤维素晶体结构，从而在水解段提高纤维素酶进入的可及性。
木质素纤维素糖化发酵生物工程
毕业设计(论文)课题任务书（2010—— 2011 学年） 学院名称：科技学院任务书下达时间1、课题概述： 木质纤维素原料由纤维素、半纤维素和木质素三大部分组成，釆用热水自催化 水解、有机溶剂预处理麦秸木质纤维素，可以去除木质素。
本实验拟釆用去木质素纤维素原料进行酶水解，乙醇发酵实验，并与汽爆纤维 素原料的糖化发酵效果进行对比，力求提高纤维素原料对乙醇的转化率，为工业化 生产奠定基础。
要求阅读或检索的参考资料及文献：[1] 中国农业部/美国能源部项目专家组.中国生物质资源可获得性评价[M].北京：中国环境科学出版 社」998, 11-22, 78-79, 101-106.[2] 陈洪章，李佐虎.影响纤维素酚解的因素和纤维素酗被吸附性能的研究[J].化学反应工程与工 艺,2000,6(1),30-34.[3] Ma Teresa Garcfa-Cubero, Gerardo Gonzalez-Benito, Silvia Bolado. Effect of ozonolysis pretreatment on enzymatic digestibility of wheat and rye straw[J|. Bioresource Technology, 2009. 100: 1608-1613.[4] 郭廷杰.美日利用纤维素生物质原料制燃料乙醇的技术开发叮].能源技术,2004, (2)61-63.[5] 柴文淼.纤维素酶水解的进展[J].浙江林业科技,1981, (1)63-65.[6] 易守连.农作物秸秆木质纤维素组分分离及高效循化匸艺研究[D].合肥匸业人学硕士学位论文， 2010,(2) 1-56.[7] 常秀莲•木质纤维素发酵乙醇的探讨[J].酿酒科技,2001, (2)39-42.[8] 汤晖，于淼,汤树德.纤维素酚解条件和连续酶解匸艺的研究[J].黑龙江八•农星人学学 报，2010, (4)72-75・[9] 孙万里.木质素与半纤维素对稻草秸秆酶解的影响[J].食品与生物技术学报，2010, 29(1)18-22.[10] 李稳宏，吴大雄，李宝璋.麦秸纤维素酚解法制糖研究[J].化学工程,2009, (3)125-128.[11] 萤玲玲.半纤维素和木质素去除对纤维素糖化过程的影响[J].农产品加工,2009, (4)31-35[12] 孔雷，赵鸣锚，吴永红•滤纸糖-D\S 比色法测定纤维素酶活力[D]•湖南农业人课题名称木质素纤维素糖化发酵学生姓名 指导教师专业 学号摘要 (1)前言 (2)1」木质纤维素原料的结构 (3)1.2纤维素原料的预处理 (3)1.3纤维素糖化及效果评价 (4)正文 (5)2选题背景 (5)2」课题来源 (5)2.2课题目的及意义 (5)2.3国内关于木质素去除及其对糖化影响的研究进展 (6)3方案论证 (7)3」本课题研究方法 (8)3.2实验过程论证 (8)321纤维素、半纤维素、木质素和灰分的测定 (8)322还原糖测定 (8)4实验过程 (8)4」实验原材料及设备 (8)4.1.1实验仪器及设备 (9)4.1.2药品 (10)4.2实验用溶液及试剂配制 (10)4.2.13,5-二硝基水杨酸(DNS)的配制 (11)4.2.20.1mol/LpH4.8醋酸一醋酸钠缓冲溶液的配制 (11)423各汽爆麦草成分测定相关试剂的配制 (11)4.3汽爆麦草及再处理后汽爆麦草成分测定 (11)4.3.1测定流程图 (11)4.3.2实验操作步骤 (12)4.3.3数据处理 (12)4.4葡萄糖标准曲线测定(测含糖量) (13)4.5葡萄糖标准曲线的绘制 (13)4.5.1葡萄糖标准曲线的绘制(测酶活) (13)4.5.2基本原理 (14)4.5.3滤纸酶活测定方法 (14)4.6糖化效果对比 (14)4.6.1糖化率的计算 (14)4.6.2操作过程 (15)⑴不同预处理过程对糖化效果的影响 (15)⑵不同加料方式对糖化效果的影响 (15)4.6.2糖化液葡萄糖的测定 (15)4.7发酵试验酒精产率的对比 (15)4.7.1酵母活化 (16)4.7.2发酵操作过程 (16)4.7.3生物传感仪法原理 (16)5实验结果及结论 (17)5」葡萄糖标准曲线测定数据及结果 (17)5.2滤纸酶活的计算 (18)5.3汽爆麦草及再处理后性状成分对比 (18)5.4不同预处理对糖化效果的影响 (18)5.5不同加料方式对糖化效果的影响 (19)5.6发酵效果的评价 (19)小结 (19)致谢 (19)参考文献 (20)20木质素纤维素糖化发酵摘要：汽爆处理后的麦草中纤维素占38. 4%o本课题用碱催化有机溶剂去除木质素，使纤维素含量提高到65.00%。
木质纤维素类生物质高效制糖及综合利用关键技术_概述及解释说明
木质纤维素类生物质高效制糖及综合利用关键技术概述及解释说明1. 引言1.1 概述本文旨在概述和解释木质纤维素类生物质高效制糖及综合利用关键技术。
随着全球能源需求的日益增长和环境污染问题的加剧，寻找新型可再生能源和可持续发展路径已成为当前国际社会的共同关注点。
作为最为广泛分布且主要来源的生物质资源之一，木质纤维素类生物质以其丰富的碳水化合物组分倍受研究者们的关注。
近年来，众多科学家和工程师致力于利用先进的技术手段将木质纤维素类生物质转化为有价值的糖类产物，并开发出相关综合利用方法，以实现生物质资源高效利用，从而满足能源、化工品和材料等多领域的需求。
1.2 文章结构本文将按照以下结构来进行叙述：首先，在第2部分中，我们将重点介绍木质纤维素类生物质高效制糖关键技术。
这包括分离和预处理、酶法降解和水解以及纤维素糖化工艺优化等方面的内容。
然后，在第3部分中，我们将探讨木质纤维素类生物质综合利用关键技术，包括生物质能源转化、生物质制备化学品与材料以及生物质废弃物资源化利用等领域的技术进展。
最后，在第4部分，我们将总结本文中介绍的主要观点和发现，并对未来的研究方向提出建议。
1.3 目的通过本文的详细介绍与说明,我们旨在提供一个全面而清晰的概述木质纤维素类生物质高效制糖及综合利用关键技术。
希望这些信息能够为科学家、工程师和相关领域的研究人员提供有价值的参考，并推动木质纤维素类生物质转化成果在实际应用中更好地推广和落地。
只有通过不断创新和完善相关技术，才能实现可持续发展并促进全球环境保护与经济建设的协调发展。
2. 木质纤维素类生物质高效制糖关键技术2.1 分离和预处理木质纤维素类生物质是一种复杂的多聚糖结构，其中包含纤维素、半纤维素和木质素等组分。
在高效制糖过程中，首先需要对原料进行分离和预处理。
分离主要是将木质纤维素类生物质与其他杂质分离开来，以提高后续酶解过程的效率。
预处理则是通过物理、化学或生物方法对木质纤维素类生物质进行改性，以增加其可降解性和易于转化为糖类的特性。
木质纤维素
木质纤维素糖化发酵工艺研究进展前言目前，世界乙醇生产主要以淀粉类(粮食作物为主，如玉米、木薯等)和糖类（如甘蔗、甜菜等）[1-2]作为发酵原料．采用微生物法发酵生产乙醇技术成熟，但是高昂的原料成本使粮食发酵生产乙醇的工业应用受到限制，同时存在与人争粮或与粮争地等弊端，并且导致粮食价格持续走高，因此寻找新的原料势在必行．所以现在科学家把目光投向成本更为低廉、来源更广泛的木质纤维素原料[3]．它不仅包括秸秆等农业废弃物，城市固体废弃物、办公废纸、杂草、锯末等以及市政废水中的固体部分[4].地球上每年植物光合作用的生物量可达2 000亿 t，其中大部分为木质纤维素类．它的主要成分是纤维素、木质素、半纤维素．在植物组织中木质素与半纤维素以共价键形式结合，并将纤维素分子包埋其中，形成一种坚固的天然屏障，使一般微生物很难进入使其降解。
木质纤维素原料生产燃料乙醇的过程主要包括预处理、糖化、发酵等，其预处理是生物转化的关键步骤，影响整个纤维素酒精生产过程．因此高效、便捷的预处理技术是木质纤维素原料生产燃料乙醇的关键所在．一、分步糖化和发酵（SHF）前处理后的木质纤维素经水解糖化生成葡萄糖，然后在另一反应器中进行发酵转化为乙醇，这种糖化发酵工艺被称为分步糖化和发酵。
其主要优点是糖化和发酵都能在各自最优条件下进行——纤维素酶水解糖化所需的最适温度在 45～5℃，而大多数发酵产乙醇的微生物最适温度在 28～37 ℃[5]。
缺点是糖化产物葡萄糖和纤维二糖的积累会抑制纤维素酶的活力，最终导致产率的降低。
研究发现，纤维二糖的浓度达到 6 g/L 时，纤维素酶的活力就将降低 60%，葡萄糖对纤维素酶的抑制作用则没有那么明显，但是，它会对β-葡糖苷酶（一种关键的纤维素水解酶）产生强烈的抑制，葡萄糖浓度达到3 g/L时，β-葡糖苷酶的活力就将降低75%。
此外，水解用的纤维素酶（主要来自于真菌）不仅组分相对单一而且价格昂贵，当其活力受到抑制时，就得增加用量，最终导致使用成本的提高。
木质纤维素类生物质制取燃料及化学品的研究进展
表 1 典型生物质主要成分质量分数（%，干基）
原料
纤维素
半纤维素
木质素
灰分
农业类生物质
玉米秸秆
37.1
24.2
18.2
5.2
稻秆
36.0
19.6
24.0
6.3
小麦秆
44.5
24.3
21.3
3.1
硬木类生物质
白杨
49.0
25.6
23.1
0.2
桦木
42.6
13.3
30.9
0.8
桉木
48.0
14.0
29.0
1 木质纤维素类生物质结构特征
1.1 纤维素 木质纤维素类生物质具有复杂的纤维素-半纤
维素-木质素结构，其中纤维素是 整 个 生 物 质 的 骨 架部分，约占 40%（见表 1），由脱水葡萄糖基通 过 β-1,4 糖苷键连接成直链状结构，其聚合度从几 百到 10000 以上。纤维素大分子的每个基环均具有 3 个醇羟基，其中 C2 和 C3 上为仲醇羟基，而 C6 上 为伯醇羟基，它们的反应能力不同，可以发生氧化、 酯化和醚化等反应，分子间可以形成氢键彼此结合 折叠成紧密的高度结晶化合物。一般来说，木材类 生物质相对农业秸秆类生物质纤维素聚合度和微晶 体较大。纤维素大分子的两个末端基性质不同，左 端的 C4 上有一个仲醇羟基，右端 C1 上有一个苷羟 基，苷羟基上的氢原子易发生转位与基环上氧桥
YU Qiang，ZHUANG Xinshu，YUAN Zhenhong，QI Wei，WANG Qiong，TAN Xuesong， XU Jingliang，ZHANG Yu，XU Huijuan，MA Longlong
（Key Laboratory of Renewable Energy and Gas Hydrate，Guangzhou Institute of Energy Conversion， Chinese Academy of Sciences Guangzhou 510640，Guangdong，China）
水解酶技术进展及其在木质纤维素生物质增值中的应用
水解酶技术进展及其在木质纤维素生物质增值中的应用强调•水解酶是生物质转化不可或缺的工具。
•用于鉴定新型水解酶的宏基因组学方法。
•细胞表面工程，一种潜在的生物质转化技术。
•产生转基因植物的水解酶。
摘要水解酶是生产各种食品，药品和消耗品不可或缺的工具，因为它们几乎在当今的每个工业过程中都有应用。
涉及使用水解酶的最重要的关注领域之一是将木质纤维素生物质转化为增值产品。
然而，由于酶活性不足和pH值和温度范围窄的稳定性导致的过程限制常常限制了它们的有效使用。
涉及通过诱变，基因工程和宏基因组学操纵酶活性和稳定性的创新技术导致使用水解酶在所有领域中的重大飞跃。
本文提供了用于木质纤维素生物质利用的微生物的分离和使用，产生水解酶的微生物，用于操纵和增强水解酶活性的现代技术以及这些酶在木质纤维素生物质的增值产品开发中的应用的最新进展。
关键词1.简介2.产生水解酶的微生物3.水解酶及其应用4.水解酶的未来前景5.使用水解酶进行生物量降解的最新进展和未来研究方向6.转化木质纤维素生物质的新策略7.结论致谢参考1.简介历史学家在中国，埃及，希腊和印度的古代文化中描述了酶的使用。
这些培养物使用果汁，胃衬里作为制作奶酪的酶的来源，肉类招标等。
工业规模的分离酶的使用始于1914年，其蛋白质性质于1926年得到证实。
由于它们从微生物来源大规模生产从20世纪60年代开始，使用酶进行各种过程的做法有所增加（Leisola等，2001）。
用于产生水解酶的最常用的微生物是假单胞菌属，梭菌属，芽孢杆菌属，曲霉属，木霉属和青霉属。
但是在极端条件下工作的酶是有利的，因为工业过程需要酶在较高温度和极端pH条件下工作。
在这里，极端微生物发挥着重要作用。
具有大多数嗜热细菌的属是Clostridium，Bacillus，Thermogota，Thermus，Methanopyrus，Thermococcus和Pyrococcus（de Carvalho，2011）。
木质纤维素的酶降解工艺
木质纤维素的酶降解工艺姓名：黄国昌学院：生命科学院学号：4056046045151.文献综述1.1 研究的意义能源问题是关系国民经济发展的大事，目前大多数国家仍以石油为主。
但从世界石油储量和消费量来看，今后全世界能开采的石油约2万亿桶，估计可再用50年左右，石油的最终枯竭是在所难免的，开发其替代品是人们关心的问题。
燃料乙醇属可再生资源，用它取代部分汽油，意义重大，有关人士称之为“一次能源的革命”。
将乙醇与汽油按一定的比例混配成的乙醇汽油，不仅能减少汽油消耗，而且能有效降低汽油尾气污染，推广和使用对于解决能源危机和环境污染具有重要的意义。
乙醇不仅是助燃剂，而且是抗爆剂，添加到汽油中可提高汽油的辛烷值，并能够降低环境污染。
美国加利福尼亚的科学家经研究认为，为了提高汽油辛烷值而加入汽油中的MTBE(甲基叔丁基醚)有致癌作用，虽有争议，但加利福尼亚州还是决定2002年起禁止使用MTBE，美国环保署现也同意逐步禁止使用。
乙醇可代替MTBE加入汽油，而且乙醇的燃烧在自然界形成自身的循环，减少了能够形成臭氧的污染物的排放，没有任何污染，且缓解地球的温室效应。
目前我国乙醇生产原料主要为国库备荒陈粮。
我国人口众多，粮食并不宽裕.陈粮毕竟有限，拓宽燃料乙醇生产原料，降低生产成本是势在必行，必须尽快加快研究。
就世界范围来说，尽管有报道称美国用于乙醇生产的玉米量至少可以扩大五倍而不会破坏其市场。
但人口的增长，可耕地的减少，粮食作为原料终究不能长久。
现在各国正致力于开发天然纤维素生产燃料乙醇，这主要是基于废物利用的考虑。
天然的木质纤维素资源是地球上最丰富和廉价的可再生资源，主要成分包括纤维素、半纤维素和木质素(木素)，纤维素可水解为葡萄糖，能很容易地用酵母发酵成乙醇，半纤维素可水解为戊糖和已糖，也可用来发酵生产乙醇。
我国是农业大国，植物纤维资源也十分丰富，仅农业秸杆、皮壳就达4亿多吨，林业生产所提供的采伐和加工剩余物也有1000万吨之多，然而，在这庞大的数量中，人类仅能在建筑、造纸、纺织、燃料、饲料等方面利用其中极少的一部分。
提高木质纤维素糖化效率的全菌糖化方法[发明专利]
![提高木质纤维素糖化效率的全菌糖化方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/635720ebd05abe23482fb4daa58da0116d171f5a.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810939479.3(22)申请日 2018.08.17(71)申请人 中国科学院青岛生物能源与过程研究所地址 266000 山东省青岛市崂山区松岭路189号(72)发明人 崔球 刘亚君 刘世岳 冯银刚 (74)专利代理机构 青岛合创知识产权代理事务所(普通合伙) 37264代理人 傅培(51)Int.Cl.C12P 19/02(2006.01)(54)发明名称提高木质纤维素糖化效率的全菌糖化方法(57)摘要本发明提供了通过糖化过程中的pH控制提高木质纤维素全菌糖化效率的方法。
所述方法包括以下步骤：(1)在厌氧条件下，将产纤维小体菌株接种于种子培养基中，培养至对数生长中期，得到种子液；(2)在厌氧条件下，将种子液接入具有糖化培养基和预处理后木质纤维素原料的厌氧发酵装置中，混合均匀，并在特定的pH条件下进行全菌糖化，得到糖液；(3)当步骤(3)得到的糖液中葡萄糖浓度达到15-120g/L后，将糖液分离出去，保留固体残渣；再次添加糖化培养基和预处理后的木质纤维素原料，重复步骤(2)。
该方法在保证高的糖得率的前提下，大大缩短了全菌糖化的周期，为工业化的进程奠定了基础。
权利要求书2页 说明书9页CN 109097417 A 2018.12.28C N 109097417A1.提高木质纤维素糖化效率的全菌糖化方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)种子液制备：在厌氧条件下，将产纤维小体菌株接种于种子培养基中，培养至对数生长中期，得到种子液；(2)全菌糖化：在厌氧条件下，将步骤(1)得到的种子液接入具有糖化培养基和预处理后木质纤维素原料的厌氧发酵装置中，混合均匀，并在特定的pH条件下进行全菌糖化，得到糖液；其中，全菌糖化初期，所述糖化培养基的pH为6.8-7.4；全菌糖化中期，所述糖化培养基的pH为5.8-6.2；全菌糖化后期，所述糖化培养基的pH为6.5-7.5；(3)新一轮全菌糖化：当步骤(3)得到的糖液中葡萄糖浓度达到15-120g/L后，通过发酵罐出口装配的过滤组件将糖液分离出去，保留固体残渣；并向所述的厌氧发酵装置再次添加糖化培养基和预处理后的木质纤维素原料，重复步骤(2)所述的全菌糖化。
木质纤维素生物质的酶法糖化课件
6 准备一个反应的空白底物。空白底物包含缓冲，水，和相同数量的基质在 10.00 mL的体积。
7 准备纤维素酶，β-葡萄糖苷酶的空白底物，木聚糖酶并用缓冲液，水和 相同数量的酶。
8 小瓶紧紧绑住并将其放置在闪烁瓶机架上摇动保温箱相配的的摇床或，以 已设定的速度旋转。设定温度50℃，温育并摇动或旋转足以次数保持固体悬浮 不变，72至168小时为一周期，或直到用YSI测量样本中可溶性糖（s）固体变得 可以忽略，如所描述的培养下一个步骤。
2 空气干燥的生物质相对于糖化的样品，可能对转换的影响达到 最大。
木质纤维素生物质的酶法糖化
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五、仪器和材料 :
1 一个可适当摇动或静止的且可定为50 ° ± 1℃的恒温箱； 2 可以以任何固定的旋转速度旋转，可容纳闪烁瓶而且可在一个静态的恒温箱 中操纵的旋转器； 3 闪烁瓶架/盘； 4 pH计； 5 精确到1毫克或0.1毫克的分析天平； 6 带有适当膜的YSI分析仪或同等的葡萄糖定量方法，如高效液相色谱法； 7 200μL和1000带尖的Eppendorf Pipetman的微升吸管； 8 配有内衬塑料的盖子的20 mL玻璃闪烁瓶
10 标准配制：无。 11 一个批次的定义：任何数目的样品进行了分析和记录在一起。一个批次 最大规模将是有限的，设备的限制。 12 控制图：200百分比Solka絮凝因子水解将指明，对纤维素酶水解不同时 间和总准备使用会注意到。
木质纤维素生物质的酶法糖化
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十三、附录 ：
无
十四、参考文献:
1 国家再生能源实验室乙醇项目CAT的实验室分析工作程序＃009，“酶
9 如果对反应进度进行测量时，一个0.3~0.5ml小份分装在每个预定的时间
间隔后取出小瓶,小瓶内已震动混合。当小瓶的成分持续悬浮的时候使用1ml的
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1 此分析过程不适合的试验样品，包括还没有被酸和碱预处理洗 过的生物样本。没洗过的生物质预处理样本含有游离酸或碱，可能 会改变溶液的pH值，超出酶活性适用范围，以及在生物质中未洗的 葡萄糖可能会影响到最终的结果；
2 空气干燥的生物质相对于糖化的样品，可能对转换的影响达到 最大。
五、仪器和材料 :
1 一个可适当摇动或静止的且可定为50 ° ± 1℃的恒温箱； 2 可以以任何固定的旋转速度旋转，可容纳闪烁瓶而且可在一个静态的恒温箱 中操纵的旋转器； 3 闪烁瓶架/盘； 4 pH计； 5 精确到1毫克或0.1毫克的分析天平； 6 带有适当膜的YSI分析仪或同等的葡萄糖定量方法，如高效液相色谱法； 7 200μ L和1000带尖的Eppendorf Pipetman的微升吸管； 8 配有内衬塑料的盖子的20 mL玻璃闪烁瓶
本实验描述，天然纤维素酶糖化或预处理木质纤维素生 物质为葡萄糖，以确定可能的最大消化率,一个在商业内部 最高水平制备及水解纤维素酶所使用时间最长不超过一周。
一、范围 ：
本过程适用于木质纤维生物质。如果生物质中可能含一些淀粉，以干重量百 分比去计算纤维素总葡聚糖时必须纠正为以淀粉含量减去总干重量葡萄糖的百分 比；
4 计算需要蒸馏水的量，添加下面的步骤中指定的酶后每一瓶的总体积为 10.00ml。每一瓶加适当体积的水。所有的溶液剂和生物量被假定比重为 1.000g/ml。因此，如果0.200g的生物质被添加到小瓶中，假定占据0.200mL然后 9.733ml的液体被加入。
木质纤维素生物质的酶法糖化
木质纤维素生物质的酶法糖化
一、简介：
This procedure describes the enzymatic saccharification of cellulose from native or pretreated lignocellulosic biomass to glucose in order to determine the maximum extent of digestibility possible. A saturating level of a commercially available or in-house produced cellulase preparation and hydrolysis times up to one week are used.
七、步骤:
1 对所有含有纤维素的被消化的样品执行LAP “生物物质中的总固体的测 定”。注：所有已发生了一些水预处理木质纤维原料绝不能在风干之前进行酶消 化，因为微观生物量结构可能会发生不可逆转的孔隙崩溃的导致从纤维素中释放 的血糖酶降低。
2 称取样品，其数量相当于0.1克纤维素或0.15克总在105oC干重生物量主要 成分（样品的纤维素含量初步认定为经由LAP-002测定的葡萄糖量，减去目前任 何淀粉贡献，LAP-016），并添加到20毫升的玻璃小闪烁瓶。
所有分析的进行要按照一个适当的、具体的实验室质量保证计划（二次分 配）。
二、术语：
生物质的预处理：生物质被化学或热量改变结构组成； 纤维素酶：一种酶的制备显示有三个纤维素阶段：远藤- 1 ,4 -β -的D -葡聚糖酶，外切- 1 ,4 -β -葡萄糖苷酶和β -的D -葡萄糖苷酶，它们在不 同纤维素制备中出现活动程度不同。
2 放线菌酮（10mg/ml蒸馏水）。 3 替代抗生素 - 叠氮化钠（20mg/ml蒸馏水） 4 柠檬酸钠缓冲液（0.1M，pH值4.80）。 5 纤维素酶的已知活性，FPU /ml。 6 β-葡萄糖苷酶的已知活性，pNPGU/ml. 7（如需要）木聚糖酶的已知蛋白浓度，毫克/毫升
2 This procedure can also be used to measure the efficacy of a given pretreatment based on a maximum enzyme loading
1 最大程度的消化率是用于与其他实验结合，以确定 生物质糖化适当的酶量；
三、意义和使用：
1 The maximum extent of digestibility is used in conjunction with other assays to determine the appropriate enzyme loading for the saccharification of biomass
2 此过程也可以用来衡量一个最大的酶量为基础的特 定预处理效果。；
四、干扰：
1 Test specimens not suitable for analysis by this procedure include acid- and alkaline-pretreated biomass samples that have not been washed. Unwashed pretreated biomass samples containing free acid or alkali may change solution pH to values outside the range of enzymatic activity; and the unwashed glucose in the biomass may influence the final result.
3 为每小瓶中，添加5.0毫升0.1M，pH值4.8的柠檬酸钠缓冲液。对每一个小 瓶，加入40微升（400微克）四环素和30微升（300微克）酮，以防止微生物在消 化过程中的生长。由于四环素和酮都造成生殖危害，可添加100ul 2％叠氮钠溶 液作为对四环素/酮组合交替（注：不使用叠氮化钠四环素/酮组合结合）。