重组子的筛选与鉴定
14 第十四讲(2) 重组子的筛选和鉴定
2 营养缺陷型检测法
如果目的基因产物能降解某些药物使菌 株呈现抗性标记，或者基因产物与某些药物 作用是显颜色反应，则可根据抗性或颜色直 接筛选含目的基因的克隆子。
亮氨酸(leu)为leu菌所必须 。 在不含leu的基本培养基中，只有重组子 表达的leu才能被leu缺陷菌所利用而能生 长，形成菌落。 因此，能生长的菌落是阳性的重组子克 隆，没有重组子的leu缺陷菌在不含leu的 培养基中不能生长，不能形成菌落。
催化4-甲基伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酸， 产生萦光物质4-甲基伞形花酮，以此筛选 含gus基因的转化子。 尤其是gus基因的3’端与其他结构基因连接 产生的嵌合基因仍能正常表达，产生的融 合蛋白中仍有GUS活性，可用于外源基因在 转化生物体中的定位分析。
Hale Waihona Puke 萤火虫萦光素酶基因（luc）
luc表达产物萤火虫萦光素酶（LUC）在 Mg2+的作用下，可以与萦光素和ATP底物发 生反应，形成与酶结合的腺苷酸萦光素酰 化复合物，经过氧化脱羧作用后，该复合 物转变成为处于激活状态的氧化萦光素， 可以用萦光测定仪快速灵敏地检测出产生 的萦光，是目前研究动植物转基因很好用 的一种报告基因。
3 依赖于重组子结构特征分析的筛选法
⑴ 快速裂解菌落鉴定分子大小 主要是根据有外源DNA片段插入载体后的 重组DNA与载体DNA之间的大小差异来鉴 定重组子。 分别提取不同转化子的DNA，经琼脂糖凝 胶电泳，在琼脂糖凝胶板上出现的DNA带 中，落后的带是重组DNA的带。 此方法只用于重组子的初步鉴定。
7 插入失活法
基本原理： 是将特定的DNA随机插入到重组DNA分子 中，获得一系列插入重组子，根据其突变 的类型鉴定失活的基因，进一步利用此插 入DNA作为标记物，对失活基因进行定位。
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定
第二次分子生物学实验报告DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
2、学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。
3、掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法；学习和掌握热击法转化E. coli 的原理与方法。
4、学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。
5、学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法；6、复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；7、通过对重组子进行重组质粒DNA 的抽提与酶切鉴定，进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段，并验证重组子是期望的重组子。
二、实验原理1、限制性内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。
在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。
目前已经鉴定出3 种不同类型的限制性核酸内切酶，即Ⅰ型酶、II 型酶和III 型酶。
Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp。
Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24—26bp。
Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。
Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA 分子双链的特异性识别序列部位切割DNA 分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。
限制性核酸内切酶对DNA 底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。
重组体分子的选择与鉴定方法及鉴定
电泳后的图谱
挑三个菌落 鉴定，图显 示的是三个 菌落中的质 粒双酶切的 结果
依赖于重组子结构特征分析的筛选方法三 PCR方法筛选鉴定重组子
• 基本原理： • 在载体DNA分子中，外源DNA插入位点两侧的序列多为 已知，通过与插入位点两侧已知序列互补的引物，从单 克隆中提取少量质粒DNA作为模板进行PCR扩增，琼脂 糖凝胶电泳分析确定是否为重组子。
抗药性标记法示意图
b类插入失活筛选
• 从原理上讲，当外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内 的位点后, 使这个基因丧失了原有的功能叫插入失活 (insertional inactivation) 。插入失活法是从不同的重组 DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子 （筛选）的主要方法。
常用的抗药性选择标记
抗药性 氨苄青霉素 （Amp） 溶解剂 虑过 除菌 是 贮存温度 贮存浓度 终浓度
水
-20℃
50mg/ml
50~100µ g/ml
氯霉素（Cm） 卡那霉素 （Ka或Kan）
四环素（Tet 或Tc） 链霉素（Sm 或Str）
乙醇
否
-20℃
34mg/ml
20~17交液中，在60℃下放置6h；把同 位素标记的DNA探针于100℃变性后加入杂交溶液中，然 后放入滤膜，60℃杂交16－24h。探针的用量一般为105 －106cpm/ml。用2×SSC洗脱3次，每次30min。 • 7 放射自显影：将洗好的滤膜用吸水纸吸干，夹于两层保 鲜膜中，在暗室内放进暗盒，放好X线片，并于X线片上 作好标记，置于－70℃冰箱暴光48－72h。 • 8 洗片：在暗室内取出X线片，进行显影和定影，分析杂 交结果。
RNA水平
蛋白质水平
免疫化学检测法（放射性抗体检测法、 免疫沉淀检测法） Westhern印迹杂交法
重组dna克隆子的筛选及鉴定注意事项
重组dna克隆子的筛选及鉴定注意事项嘿，宝子们！今天咱们来唠唠这个《重组DNA克隆子的筛选及鉴定注意事项》呀。
首先呢，咱得知道啥是重组DNA克隆子哇。
这可是生物技术里超重要的东西呢！在筛选的时候呀，有好多要注意的点呢。
一、筛选方面的注意事项1. 选择合适的筛选标记呀！哎呀呀，这可太关键了呢。
比如说抗生素抗性标记，常见的像氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性等等。
你得确保这个标记是准确有效的哇，不然怎么能筛选出咱们想要的克隆子呢？要是标记弄错了，那可就像大海捞针一样乱套了呀！在选择的时候，一定要根据你的载体和宿主细胞的特性来确定呢，可不能瞎选哦！2. 筛选条件要精确呢。
比如说使用抗生素筛选的时候，抗生素的浓度一定要控制好哇！浓度低了呢，那些没有成功重组的细胞可能也会生长，这就达不到筛选的目的啦；浓度高了呢，可能会把一些好不容易重组成功的细胞也给抑制住了呀，这多可惜呢！所以呀，要通过预实验来确定最佳的抗生素浓度呢，这个步骤可不能偷懒哦！3. 筛选的时间也很重要呢！哇，你可别以为把细胞放在筛选培养基里就不管了。
时间太短，可能那些非重组子还没有完全被抑制住；时间太长呢，可能会导致重组子因为营养缺乏或者其他原因生长受到影响呢。
所以要时刻关注细胞的生长状态，确定合适的筛选时间呀。
二、鉴定方面的注意事项1. 酶切鉴定要小心哦。
在进行酶切鉴定的时候呢，首先要选择合适的限制性内切酶呀。
这就像开锁要用对钥匙一样呢。
要是酶选错了，可能就切不出你想要的条带啦，那怎么能鉴定出正确的克隆子呢？而且呀，酶切反应的体系一定要准确无误呢。
各种成分的量，像酶的量、缓冲液的浓度、DNA的量等等，都要严格按照说明书来操作呢，不然很容易出现酶切不完全或者酶切失败的情况呢！2. PCR鉴定也有不少讲究呢。
引物的设计那可是重中之重呀！哇，引物要是设计得不好，可能就扩增不出咱们想要的片段呢。
要确保引物的特异性，不能跟其他非目标序列结合呢。
还有呀，PCR反应的条件也要不断优化呢。
重组子筛选与鉴定
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
Luc基因在植物细胞内正常表达，可用于监测各种启动子 活性，测定与Luc基因嵌合的目的基因的表达情况，也用 于调控序列和基因的组织特异性表达。
③ 荧光素酶（LUC）基因
特点：迅速，灵敏，成本低，不存在放射性同位 素对人体健康和环境生态危害，也无内源荧光产 生的背景干扰，故Luc是一种理想的报告基因。
① β-葡萄糖酸苷酶（Gus）基因
Gus基因最早是从E.coli 12中克隆出来的，能编码稳定的 Gus产物。与抗生素抗性基因不同的是Gus基因并非正选 择标记。
作为报告基因的重要依据：作为一种水解酶，转化植物细 胞所产生的β-葡萄糖酸苷酶，能够催化某些特殊反应的进 行，通过荧光、分光光度和组织化学的方法对这些特殊反 应产物的检测，即可确定gus报告基因的表达情况，从而 区分是否是转化子。
②二氢叶酸还原酶(DHFR)基因
DHFR催化二氢叶酸还原成四氢叶酸，dhfr突变 体细胞不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代 谢途径，故不能在常规培养基上生长。
转化子的筛选和重组子的鉴定
转化子的筛选和重组子的鉴定在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA 分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞。
再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所致。
因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中筛选出来。
一、基本定义：1、转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。
2、重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。
3、阳性克隆子（期望重组子）：含有外源目的基因的重组子称为阳性克隆子或期望重组子。
4、筛选（选择）：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。
二、将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1．获得目的基因和质粒载体；2．形成重组质粒；3．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5三、转化子的筛选1、根据载体标记基因筛选转化子。
（1）方法：将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。
（2）举例：抗药性标记插入失活选择法、根据载体除草剂抗性基因、β-半乳糖苷酶显色反应选择法、根据生长调节剂非依赖型筛选转化子、根据核苷酸合成代谢相关酶基因的缺失互补筛选。
2、根据报告基因筛选转化子。
（1）报告基因的定义：一个编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即表达产物易被鉴定的基因。
由于受体细胞内报告基因的表达，出现新的遗传性状，以此来识别被转化的细胞或未被转化的细胞。
（2）成为报告基因的条件：报告基因的表达产物应是便于检测、定量和灵敏毒高的基因。
如：gus葡醛糖酸酶基因、Lus荧光虫荧光素酶基因、Gfp绿色荧光蛋白基因。
3、根据形成噬菌斑筛选转化子。
重组子的筛选与鉴定
1.2 -半乳糖苷酶显色反应选择法
1.2.1. 原理：载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的 片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体 菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺失）。 可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互补 形成完整有功能的-半乳糖苷酶。-半乳糖苷酶能把无 色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴 -4-氯靛蓝。
2.1 Southern blotting
Southern印迹杂交是由E Southern于1975年首先 建立并使用的，故名之。它是根据毛细管作用的 原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结 合在适当的滤膜上，然后通过与已标记的单链 DNA或RNA探针的杂交作用以检测这些被转移的 DNA片段。
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛A 选A过程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
3、PCR扩增检测法
3.1 原理 PCR能在模（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。 （5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
④漂洗去除游离的没有杂交上的探针分子，经放 射自显影后，便可鉴定出与探针的核昔酸序列同 源的待测DNA片段。据此可以将含有外源DNA片段 的重组子筛选出来。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
Southern blot 筛选 结果
2.2菌落印迹原位杂交
是直接把菌落或噬菌斑印迹转移到硝酸纤维素滤膜上， 不必进行核酸分离纯化、内切酶酶解及电泳分离等操作， 而是经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位 结合，再与特异性DNA或RNA探针杂交，筛选出含有插入 序列的菌落或噬菌斑。由于生长在培养基平极上的菌落 或噬菌斑，是按照其原来的位置不变地转移到滤膜上， 然后在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用，所以菌落 杂交或噬菌斑杂交隶属原位杂交范畴。以菌落原位杂交 为例，操作步骤如下:
基因工程第七章 重组子的筛选和鉴定
菌落PCR出现假阴性 避免将琼脂培养基挑到PCR管中及其他原因:
酶失活；引物质量不好（设计、合成、保存）；物 理原因（变性、退火的温度、时间）。
一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽, 形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带，多数 不太亮,条带细而且不规则，有时拖尾。
4、Broome-Gilbert双位点检测法 可用于检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。 质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
125I标记的 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
② 转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
2、Western blotting
（1）Western（转膜） 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转 到膜上（硝酸纤维素膜、中性尼龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场 的作用下横向转移到正
94℃ 10min
94℃ 5min
94℃ 40s 62℃ 30s 72℃ 90s 25～30 cycle
94℃ 40s 58℃ 30s 72℃ 90s 35～40 cycle
72℃ 7min 4℃ for ever
72℃ 7min 4℃ for ever
预变性时间延长为10 min, 使得细菌能够充分 破裂，DNA 大量释放并充分变性。
菌落），用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至 PCR管中（牙签在无菌水中洗一下），然后将牙 签点在LB（+Amp）平板，记录号码。 在PCR管中加其他成分（最后加酶） 设定PCR程序，开始PCR。 电泳检测。 LB平板过夜培养，选取正确的菌落。
重组子的筛选的原理
重组子的筛选的原理
重组子的筛选是指通过某种方法，从混合的DNA或RNA片段中分离出特定长度的重组子（或称为合成子、片段），以进一步进行研究或应用。
其原理主要基于两个关键步骤：构建DNA文库和筛选。
构建DNA文库：首先，通过随机切割或酶切等方法将目标DNA或RNA分子切碎成片段，然后将这些片段与载体DNA或RNA连接，创建所谓的“文库”。
这样一来，文库中就包含了大量不同长度的DNA或RNA重组子。
筛选：筛选是指从文库中筛选出特定长度（或特定的序列）的重组子。
这通常通过以下几个步骤完成：
1. 选择适当的筛选方法：根据实验目的，选择适当的筛选方法。
常见的筛选方法包括杂交筛选、PCR筛选、蛋白质互作筛选等等。
2. 筛选条件设定：根据筛选方法的要求，设置适当的筛选条件，如适当的温度、条件和试剂浓度等，以实现特定重组子的富集。
3. 筛选步骤：根据筛选方法，进行适当的筛选步骤，如杂交、PCR扩增、亲和性层析等操作。
通过这些步骤，特定长度或序列的重组子会得到放大或富集，从而分离出来。
4. 验证与鉴定：对筛选出的重组子进行验证和鉴定，例如使用测序技术验证其序列是否与预期一致，或进行功能分析等。
总的来说，重组子的筛选原理是通过构建DNA文库，并在条件和方法设定下，利用适当的筛选方法和步骤，从文库中选择和富集特定长度或特定序列的重组子。
重组子的筛选方法
重组子的筛选方法一、引言重组子筛选是基因工程中的一项关键技术，用于识别和分离含有目的基因的克隆。
随着生物技术的不断发展，重组子筛选方法也日益多样化，为研究者提供了更多选择。
本文将对几种常见的重组子筛选方法进行详细介绍，并比较其优缺点。
二、常见重组子筛选方法1. 蓝白筛选法：蓝白筛选法是一种基于λ噬菌体载体和lacZ基因的筛选方法。
其基本原理是利用lacZ基因编码的β-半乳糖苷酶可以将无色底物X-gal转化为蓝色产物。
当载体上含有目的基因时，lacZ基因被破坏，无法产生β-半乳糖苷酶，菌落呈白色。
这种方法操作简便，适用于大量筛选。
2. 抗性筛选法：抗性筛选法是利用标记基因赋予宿主菌抗药性或营养缺陷型特性，从而筛选重组子的方法。
例如，利用卡那霉素抗性基因（neo）对细菌进行筛选。
当载体上含有目的基因时，neo基因被破坏，重组子对卡那霉素产生抗性。
这种方法成本低廉，适用于实验室条件。
3. 荧光标记筛选法：荧光标记筛选法是利用荧光标记探针与目的基因杂交，通过荧光显微镜观察荧光信号来筛选重组子的方法。
该方法灵敏度高，可实现自动化操作。
然而，荧光标记探针制备成本较高，且对实验操作要求较高。
4. 测序法：测序法是通过对目的基因进行测序，比对已知序列来确定重组子的方法。
该方法准确度高，适用于所有基因型重组子的筛选。
然而，测序法成本较高，操作复杂，不适合大量筛选。
三、比较与讨论蓝白筛选法、抗性筛选法和荧光标记筛选法各有优缺点。
蓝白筛选法操作简便、成本低廉，适用于大量筛选；但灵敏度较低，可能会漏掉一些弱阳性克隆。
抗性筛选法成本低、适用范围广；但标记基因可能会影响目的基因的表达，导致结果不准确。
荧光标记筛选法灵敏度高、可自动化操作；但成本较高，对实验操作要求严格。
测序法则准确度高，可适用于所有基因型重组子的筛选；但成本较高、操作复杂，不适合大量筛选。
因此，在选择重组子筛选方法时，应根据具体实验需求和条件进行综合考虑。
重组克隆的筛选与鉴定
4、 选择得过程
(1)四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA,导致四环素 抗性基因失活,可用四环素﹢环丝氨酸 得平板,选择重组克隆。
Tetr插入失活得细菌,其生长可被四环素 抑制,不被环丝氨酸杀死,保留下来;
Tetr不失活得细菌,能抗四环素,正常生长, 但可被环丝氨酸杀死。
图 四环素抗性插入失活
二、利用抗生素抗性基因:pBR322
以pBR322为例,说明利用抗生素抗性基因得插 入失活得原理。
1、 原理
在pBR322上有多个单一得限制酶位点,如 BamH I位点,恰好在一个四环素抗性基因内。 如果有外源DNA插入BamH I位点,那么涉及 四环素抗性得基因就损坏,因此,带有重组 pBR322质粒得细胞,仍对氨苄青霉素有抗性, 但对四环素得抗性消失(敏感)。
pUC18/19得结构图
氨苄青霉素抗性基因 Lac Z基因:编码-半乳糖苷酶得部分肽
段。 Lac Z上有插入外源DNA得MCS位点。
4、 筛选得方法:蓝白斑法
利用蓝白斑法筛选pUC8/9重组子,就是 一种直接检测-半乳糖苷酶活性得方法。
①先将转化子涂于含有氨苄青霉素得培 养基,能合成-半乳糖苷酶。
该技术已广泛应用于基因得表达、基因 定位、克隆基因得筛选、酶切图谱得制
作、基因组中特定基因序列检测、遗传 病疾病得诊断及生物分类等方面。
一、核酸分子杂交得基础
1、 变性与退火 DNA以双链形式存在,在进行分子杂交
时,先将双链DNA分子解聚为单链,这一 过程称为变性。
两条单链通过碱基互补,聚合成稳定得 双链区得过程称为退火或复性。
图 表型筛选加酶切筛选
０
A
A
T T
TA AT
重组子的筛选方法
重组子的筛选方法
重组子的筛选方法包括以下几种：
1. PCR筛选法：利用PCR扩增方法，在重组子序列两端设计引物，扩增出目标重组子序列。
该方法可快速、简便地筛选出重组子，但存在引物设计不当、PCR 扩增条件不适等问题。
2. Southern blotting法：利用重组子DNA序列特异性探针进行筛选，这种方法需要对目标重组子进行限制性酶切，分离重组子DNA片段，然后进行Southern blotting，根据特异的探针与重组子DNA序列的杂交情况，确定有无目标重组子，这种方法相对复杂，但有高准确性。
3. 包装体筛选法：将目标重组子所在的DNA片段插入载体中，建立重组子文库。
然后采用包装体技术将文库中的重组子片段插入病毒包装体中，再通过病毒感染将重组子片段转染到宿主细胞，筛选出含有目标重组子的克隆。
4. 负筛选法：利用重组子DNA序列中含有的特异性标记，通过筛选方法去除不含该标记的过渡物，从而筛选出含有目标重组子的样品。
以上是常见的几种重组子筛选方法，不同方法适用于不同的实验需求和实验条件。
基因工程-第8章-重组子的筛选与鉴定
2、根据插入序列的表型特征选择重
组体分子的直接选择法
转化进来的外源DNA编码的基因，能够 对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变体发 生体内抑制或互补效应，从而使被转化 的寄主细胞表现出外源基因编码的表型 特征。
Example:
λ gt.λ B噬菌体（由于C片断的缺失而造成重 组缺陷的λ red－噬菌体），在大肠杆菌lig ts菌株上生长不能形成噬菌斑，在有连接酶功 能的大肠杆菌lig＋菌株上形成噬菌斑。 将具有连接酶基因的重组体噬菌体λ gt. λ B，涂布在大肠杆菌lig ts菌株上时，通过 寄主细胞的互补作用，能够形成噬菌斑。根据 形成噬菌斑这种表型特征，直接选择具野生功 能的重组体噬菌体。
缺点： 不单要求克隆的DNA片断必须大到足 以包含一个完整的基因，而且还要求所 编码的基因能够在大肠杆菌中实现功能 表达。 （对于真核基因很难达到要求）
二、物理检测法
1、凝胶电泳检测法 从宿主细胞中提取重组子分子，利用凝胶 电泳的方法，鉴定外源片断是否插入及其 长度。 优点：简便、快速。 缺点：只能提供克隆片段大小的信息。
抗药性标记插入失活
Amp r
1)限制酶切 2)DNA重组 无DNA插入
Tc
有DNA插入
Amp r
Tcr
转化
Amp r Tc s
外源DNA
Amp r பைடு நூலகம்cr
无菌落 筛选重组子 阳性菌落
Amp r Tc s
提取DNA 电泳
筛 选 重 组 子 的 示 意 图
Amp r Tc s
重组DNA
（2）β-半乳糖苷酶显色反应选择法
外源DNA 有DNA插入
Apr
转化
Ap r
Ap r
筛选重组子 白色菌落
重组子的筛选与鉴定
一、遗传学检测法
无环丝氨酸培养基
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322 选择过程 （2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基
因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法 （2） 选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有终止密码子；
（不破坏 肽）。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。
（只在特定条件下）。 1.原理 （1）弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型
缺陷。
受体菌： his
-
外源基因： his
+
阳性克隆才能在不 含组氨酸的培养基 中生长
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 1.原理
（2）增加新性状 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例：小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二
优点：简便、快速，结果较可靠。
缺点：基因必须表达并具有合适的受体细胞。 （一） 根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法
1. 抗药性标记插入失活选择法 2. β-半乳糖苷酶显色反应选择法 （二）根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法 转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所 具有的突变体发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表 现出外源基因编码的表型特征。
鉴定重组子的方法
鉴定重组子的方法
鉴定重组子的方法一般可分为以下几种：
1. PCR扩增法：通过聚合酶链式反应（PCR）在靶DNA序列的两端引入特定的引物，再通过PCR扩增得到重组子的DNA序列。
2. 限制性内切酶消化法：将待重组的DNA片段和载体DNA进行双酶切，然后通过连接酶将两者连接起来，最后通过转化到宿主细胞内进行复制和表达。
3. 嵌合PCR法：利用两对引物分别扩增待重组的DNA片段和载体DNA片段，两者的两端引物设计成互补序列，通过PCR扩增后，两个片段可通过重叠互补序列自行连接。
4. 策略引导融合法：通过引物设计，使待重组的DNA片段和载体DNA具有互补的序列，然后通过热变性和退火的方式使两者相互结合。
5. 基因组DNA文库筛选法：通过构建基因组DNA文库，然后通过探针的杂交和筛选，得到具有重组子的克隆。
以上是常见的鉴定重组子的方法，具体的选择可以根据实验需要和条件进行决定。
重组体的筛选和鉴定
1975年，英国Southern创建
针对DNA的杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探 针进行检测的方法。
原理：将重组菌的基因组或质粒DNA提取出来，经合适的限制
性内切酶酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分离，把定位在凝胶 中的DNA碱变性处理，使其双链DNA分开，再将凝胶中变性的 DNA转移到硝酸纤维素膜上，用制备的标记探针与其充分混合， 进行同源性DNA杂交。
为Tcr表型．而质粒为Tcs表型。
转化菌涂在Tc平板上，只有含有外源DNA插入片段
的阳性重组子的转化菌能生长成菌落。
16
（3）显色反应筛选：蓝白斑筛选
乳糖 -半乳糖苷酶 X-gal 半乳糖 + 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝 α-互补 深蓝色 （酶活）
半乳糖
β—半乳 糖苷酶
α链（lacZα） ：四聚体装配
A
T T
表型筛选加酶切筛选
T A A T
38
二、目的克隆的鉴定
（一）核酸分子杂交(nucleic acid hybridization) 原理
具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下(适宜的温 度和离子强度)可按碱基互补的原则退火形成双链.
杂交分子可在DNA和DNA、DNA和RNA、RNA和RNA以及人工合
18
19
20
pUC18/19
5’
lacZ’
EcoRI SacI
EcoRI SacI
KpnI SmalI BamHI XbaI SalI
pUC18
PstI
SphI Hind III
ATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTG
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第三节、转化/重组酵母菌的筛选
营养缺陷互补基因 显性标记基因
一、利用营养缺陷互补基因的筛选方法
原理：受体细胞为某种营养缺陷型突变株，即 不能合成某种营养成分，在缺乏该营养成分的 培养基上不能生长；
携带相应营养成分合成基因的载体转化受体菌 后，使细胞在选择培养基（不含某种相应营养 物质的培养基）中能够生长，而未被转化的细 胞不能生长。
red+gam+噬菌体可在P2噬菌体溶源菌中呈溶原生长， 被定为SPi+ （ sensitive to P2 inhibition，对P2介入敏感） red-gam-噬菌体在P2溶源菌中则呈溶菌生长，定为Spi-。
填充片段内含有red及gam基因的载体如EMBL3和EMBL4
三、杂交筛选
菌落或噬菌斑杂交筛选
二、 重组噬菌体DNA转入大肠杆菌后 重组子的筛选
（一）取代型载体：根据λ基因组的大小筛 选，直接挑取噬菌斑即重组子
机理： 空载体太小而不被包装，不进入细胞； 重组λ-DNA可包装成噬菌体颗粒并感染大 肠杆菌产生噬菌斑； 未感染菌生长成菌落。
（二）插入型载体
空载体及重组载体都可包装，需要插入 失活载体上的标记基因筛选。
1、氨基糖苷类药物磷酸转移酶基因：Neo （neomycin）。
2、博来霉素抗性基因：Zeo（Zeocin）。如 pFLD1载体、
（一）Neo选择系统
Neo基因编码氨基糖苷磷酸转移酶，可 以灭活氨基糖甙类抗生素，是新霉素 （neomycin）、新霉素衍生物G418、 卡那霉素等抗生素的抗药基因。
第一步：正选择。在不进行插入失活抗性基因的相应 抗生素平板上转化子可以生长，非转化子不能生长， 可将转化子直接从平板上挑出来；
第二步：负选择。在插入失活抗性基因的相应抗生素 平板上转化子中的非重组子（未插入外源基因）可以 生长，重组子（插入外源基因）不能生长，应与第一 种抗生素板进行对照并在其上挑出含重组子的菌落。
hfL：high frequence lysogenization
3、spi-筛选
用目的基因取代λ噬菌体取代型载体上含有redgam（整合 基因）的填充片段后，使噬菌体由red+gam+转变为redgam-，感染P2噬菌体溶源菌后使细菌由溶原生长转换为溶 菌生长。 利用这种特性进行的筛选称为spi-筛选。
胞内表达的载体主要有：pHIL-D2， pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10， pGAPZ， pGAPZa等
组氨醇脱氢酶基因（histidinol
dehydrogenase gene，his4）缺失的毕赤
酵母
主要有三类：GS115 、 SMDI168 、KM71 均不能合成组氨酸
指编码的产物能够使转化或转染的细胞在有选 择剂或营养缺乏的情况下很好生长或表现出其 他可视特征的基因。
构建载体时，目的基因与选择标记基因在载体 上的空间关系有两种：
1、独立存在。用于区分转化细胞与未转化细胞 2、目的基因插入选择标记基因编码区或其基因
调控部分。用于区分空载体转化细胞与重组载 体转化细胞
1、用转化反应液涂布含氨苄的LB平板，长 出转化子—Ampr ；
2、用无菌牙签将Ampr的转化子逐一挑在 Tc平板上（或用无菌丝绒布、无菌滤纸 影印），比较两块板上的菌落生长情况， 从Amp板上挑选出Tc板上不长的菌落即 为重组子。
注意：氨苄平板菌落密度不宜过大
影印平板培养法
利用lacZ′基因的插入失活筛选重组子
2、λ噬菌体的cI基因的插入失活筛选
——cI筛选法
原理：cI基因编码的阻遏蛋白可使感染 了λ噬菌体的大肠杆菌进入溶原化状态； cI基因的插入失活使感染了λ噬菌体的大 肠杆菌由溶原状态进入溶菌状态。 重组噬菌斑：无色透明 非重组噬菌斑：浑浊 未转化菌：正常菌落
Polylinker插入不影响lacZ′基因表达
单酶切时有这种情况
噬菌斑
2、 cI基因插入失活筛选
例：λgt10 － BNNl02（C600hflA ）系统 C600hflA是一种hflA突变菌；cI基因正常表达
的噬菌体在其中溶原生长，不形成噬菌斑； 但cI基因插入失活的重组噬菌体却能形成噬菌
斑（Young and Davis 1983a）。
载体需携带his4，转染后的阳性重组子可以
用不含组氨酸的平板进行筛选
含URA3的载体及其相应的受体细胞
载体： 酵母菌的Yep系列载体：含Amp、Tc和 URA3（尿嘧啶）标记基因
受体细胞：EGY48菌株
Amp、Tc抗性基因用于在大肠杆菌中筛选重组子 URA3标记基因用于酵母转化细胞的筛选
二、酵母常用显性标记基因
（二）插入表达筛选
载体的选择标记基因前连接一段负调控序列， 插入失活负调控序列后，其下游的筛选标记基 因才能表达。
如pTR262质粒，在Tc（Tet）基因前有来自噬菌体的cI 基因，可编码cI阻遏蛋白，抑制Tet表达。
cI基因（ HindⅢ或BglⅠ位点）插入失活，Tc基因表达， 受体细胞在Tc板上生长；未转化细胞及及空载体转化细 胞Tc表达被抑制，在Tc平板上不生长。
lacZ ′基因插入失活筛选：蓝白筛选 cI基因插入失活筛选：cI筛选 利用Spi（sensitive to P2 inhibition）表型选择： Spi筛选
选择标记基因
1、利用lacZ′基因的插入失活筛选重组噬菌斑
如含有lacZ′基因的M13噬菌体及多种λ噬 菌体载体（ λ gt11）
重组噬菌斑无色透明，非重组噬菌斑呈 蓝色，未转化细胞长出菌落
-半乳糖苷酶显色剂：生色底物
IPTG及其作用
IPTG：即Isopropyl- -D-thioagalactoside，异丙 基- -D-硫代半乳糖苷
作用：乳糖操纵子诱导物，和载体上携带的大
肠杆菌乳糖操纵子的调节基因（Lac I ）编码
产物—阻遏蛋白结合，阻止其与操纵基因结合， 使操纵子控制的基因（lacZ等）得以表达。
反应体系细胞的组成：
1、不含外源DNA的受体细 胞
2、含空载体的细胞（酶切 未切开或重新环化的载 体转化的细胞）
3、重组子：
（1）含目的重组DNA的细 胞
（2）含非目的重组DNA的 细胞
鉴定
对筛选出的重组子DNA进行进一步酶切、 测序等，鉴定是否为目的重组子及重组 子DNA序列的正确性等。
选择标记基因（selectable marker gene）
培养基上形成正常的白色菌落；
sup4被外源基因插入失活后重组子呈红色。
YAC 载体带有trp 1、 leu 2和 his 3、 ura3 以及 sup4
密码子改变成UAA的无义突变又叫赭石突变
第四节、转染的哺乳动物细胞筛选
一、哺乳动物细胞常用的选择标记基因
1、新霉素抗性基因： neo（neomycin）
非重组子：仅含有空载体分 子的转化子。
期望重组子与非期望重组子
期望重组子：含有外源目的基因的 重组子。
非期望重组子：携带非目的基因的 重组子。
转化子、重组子、期望重组子关系
转化子 重组子 期望重组子
筛选（screening）
一般指从反应体 系细胞群中辨别 挑选出转化子或 重组子的过程。
lacZ基因编码β-半乳糖苷酶； lacZ′基因编码β-半乳糖苷酶的N端 序列α片段 ，互补菌染色体上携带的缺陷基因编码C端片断，两者 互补（α-互补）形omo-4-Chloro -3-Indoly- -DGalactoside)，5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半 乳糖苷
酵母常用营养标记基因
第一类：氨基酸合成基因：
组氨酸合成酶基因HIS4 色氨酸合成酶基因TRP1 亮氨酸合成酶基因LEU2 精氨酸合成酶基因 ARG4
第二类：核苷酸合成基因：
尿嘧啶合成酶基因（URA3）
例：含HIS的载体
分泌型表达载体主要有：pPIc9，pPIc9k， pHIL-S1，pPIcza，pYAM75P6；
替代途径
黄嘌呤
XMP XGPRT （＋）
GMP
HGPRT基因选择系统组成
1、受体细胞：普通哺乳动物细胞
2、载体：含有 gpt基因的载体，如 pAG4622（人-鼠嵌合轻链 表达载体） ，pSV2gpt （人-鼠嵌合重链表达载体）
3、培养基：筛选XPGRT 活性缺陷细胞的HAT选择培养基组 成如下：
霉酚酸 黄嘌呤（合成鸟苷酸GMP ） 腺嘌呤 胸苷（合成胸腺嘧啶） 透析除去鸟嘌呤的血清
霉酚酸能抑制次黄嘌呤核苷酸脱氢酶的作用而阻断嘌 呤核苷酸的经典合成途径。
携带gpt的载体转化受体细胞后，使受体细胞在含霉酚
酸的HAT培养基中启动核苷酸合成替代途径，利用培 养基中补加的黄嘌呤合成GMP，得以存活。
合成GMP 的不同途径
正常途径（经典途径）
IMP
XMP
GMP
（次黄苷酸）霉酚酸（×） （黄苷酸） （鸟苷酸）
报告基因（reporter gene）
指载体上携带的、表达产物容易被检测且能够 指示外源基因导入受体细胞与否及表达水平的 基因。
构建载体时，一般将报告基因与目的基因融合， 并将报告基因置于目的基因启动子控制之下， 报告基因与目的基因同步转化与表达。
第二节、大肠杆菌重组体的筛选
一、质粒载体转化大肠杆菌细胞的筛选
例
如pBR322质粒含有TC r、Amp r两个抗药性基因，外源 基因插入失活TC r后，会有三种不同表现的细胞:
未转化的受体细胞— TC sAmp s 含载体的转化菌落－ Ampr Tcr 含重组体的阳性菌落—Ampr Tcs
空载体转化菌落
空载体转化菌落及 重组载体转化菌落
筛选具体做法
含Lac I 的载体：如pUC8，需要诱导物 不含Lac I 的载体：如pUC18/19，不需诱导物