离子交换层析
离子交换层析的原理
离子交换层析的原理
离子交换层析是一种分离和富集离子的技术，基于离子的交换作用在固体和液相之间。
其原理主要基于离子的电荷和大小的差异，通过固体材料与溶液中的离子之间的相互作用，实现离子的分离和分析。
在离子交换层析过程中，采用具有离子交换基团的固体材料作为吸附剂。
这些固体材料通常是树脂或凝胶，具有高度交联的结构，能够提供大量的交换位点。
这些交换基团可以选择性地吸附相应离子，并释放其他离子。
离子交换层析的过程可以分为两个步骤：吸附和洗脱。
在吸附步骤中，固体材料中的交换基团与溶液中的目标离子发生相互作用，使目标离子被固定在固体表面上。
这种相互作用可以是电静力吸引力、静电作用力或配位作用等。
在洗脱步骤中，采用适当的洗脱剂，通过改变溶液条件，如pH值、离子浓度等，来解离吸附在固体表面上的离子，并将其溶解出来。
这样就实现了对离子的分离和富集。
离子交换层析的选择性主要取决于固体材料表面上的交换基团和目标离子之间的相互作用力。
不同的交换基团对离子的选择性也不同，可以选择适合分离目标离子的交换基团。
除了选择性外，离子交换层析的分离效果还与溶液条件、交换剂用量、洗脱剂的选择等因素有关。
因此，在进行离子交换层析实验时，需要根据具体情况进行优化条件，以达到较好的分
离效果。
总的来说，离子交换层析是一种常用的离子分离和富集技术，通过固体材料与溶液中离子之间的交换作用，实现离子的分离和富集。
其原理基于离子之间的相互作用力以及交换基团的选择性，通过调控条件和洗脱剂，达到对离子的有效分离。
离子交换层析
样品进柱
离子交换层析的基本操作
为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20% 为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高
交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数
样品洗脱
恒定洗脱
离子交换层析的基本操作
分子浓度 离子强度
pH值
阶段洗脱
梯度洗脱
弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子 交换能力逐渐减弱
弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子 交换能力逐渐减弱
离子交换介质的基本性质
常用的离子交换剂
离子交换树脂：
最常见的离子交换树脂是含有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯 乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物
离子交换树脂的优点是：流速快，对小分子物质的交换容量大， 因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化
离子交换层析
离子交换层析的基本原理 离子交换介质的基本性质 离子交换介质的选择原则 离子交换层析的基本操作
离子交换层析的基本原理
离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为 流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混 合物中不同离子进行分离的层析技术。
离子交换介质的基本性质
离子交换介质的基本性质
常用的离子交换剂
离子交换葡聚糖：
离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三 维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物（Sephadex G） Sephadex的优点如下：
亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核 酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小
10 20 30 40 50 60 70 80 90
生化技术第六章 离子交换层析
3.不同离子型交换剂的选择 原则：选择结合力较小的反离子，有利于提高交 换容量。 强阳性——选H型；强阴性——选OH型； 弱酸性——选Na型；弱碱性——选Cl型。 4.不同基质离子交换剂的选择 疏水性的树脂交联度大，空隙小，大分子很难进 入，且骨架的疏水性不利于蛋白质的稳定。分离 大分子物质时一般用亲水性的基质。
疏水性离子交换剂
疏水性离子交换剂中的基质是人工合成的、与水结合
力较小的树脂。常用的树脂是由苯乙烯和二乙烯苯合成的
聚合物，其中二乙烯苯是交联剂，能把聚乙烯苯直链化合
物连接成类似海绵状的结构，在此结构中以共价键引入不
同的电荷基团。离子交换树脂以电荷基团的性质分则有：
阳离子交换树脂、阴离子交换树脂(分别包括强、中、弱
三、分离原理 离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主
要以离子交换方式进行。
假设以R-A+代表阳离子交换剂，其中A+为反离子，A+
能够与溶液中的阳离子B+发生可逆的交换反应，反应式
为：R-A++B+
R-B++A+
离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力， 这种结合力的大小是由离子交换剂的选择性决定的。
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生物分离工程-离子交换层析(色谱)-精选文档
羟基磷灰石层析
羟基磷灰石（hydroxyapatite, HAP): 是一种磷酸钙晶体，基本分子结构为
Ca ( PO ) ( OH ) 10 4 6 2
一般认为，HAP的吸附主要基于钙高子和磷酸根离子 的静电引力，即在HAP晶体表面存在两种不同的吸附晶面， 各存在吸附点c点和P点，前者起阴离于交换作用，后者 起阳离于交换作用．因此，在中性pH环境下酸性蛋白质 (pI<7)主要吸附于c点，碱性蛋白质(PI>7)主要吸附于P 点．利用磷酸盐缓冲液(K2HP04+KH2PO4）为流动相洗脱展 开时，磷酸根离子在c点竞争性吸附，交换出酸性蛋白质 ，而K+在P点竞争性吸附，交换出碱性蛋白质。所以HAP层 析通常以磷酸盐缓冲液为流动相，采用提高盐浓度的线 性梯度洗脱法。
多缓冲离子交换剂:
可利用普通的凝胶过滤介质偶联特殊的离子交换基制 备．如Pharmacia公司生产的PBEll8和94即为以Sepharose 6B 为载体的阴离子交换剂，前者与Pharmalyte 匹配使用，后 者与Polybuffer96和Polybuffer 74匹配使用。
Pharmacia生产的另一种多缓冲离子交换剂为Mono P，其离于交换基为具有不同pKa值的弱碱性胺基．Mono P可与上述三种多缓冲剂匹配使用，粒径仅10m，用作 高效层析聚焦柱的固定相。
poros层析介质包括离子交换疏水作用亲和吸附和反相介质等其中前三种介质的孔表面覆面有葡聚糖等亲水性多糖保证介质表面的亲水性和键合相应的配灌注层析的最大特点是分离速度快一般可在数分钟内完成而利用hplc则需数十分钟到一小时
离子交换层析（色谱）
一、原理
离子交换层析(Ion exchange chromatography, IEC)是 利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂 之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的层析法。 荷电溶质在离子交换剂上的分配系数可用下式表示：
离子交换层析讲解
三、离子交换剂的种类和性质 1.离子交换剂的基质
• 其中：聚苯乙烯离子交换剂（又称为聚苯乙烯树脂）是以
苯乙烯和二乙烯苯合成的具大、流速快。但它与 水的亲和力较小，具有较强的疏水性，容易引起蛋白的变 性。故一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、 核苷酸等。 以纤维素（Cellulose）、球状纤维素（Sephacel）、葡聚 糖（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）为基质的离子交 换剂都与水有较强的亲和力，适合于分离蛋白质等大分子 物质，葡聚糖离子交换剂一般以Sephadex G－25和G－50 为基质，琼脂糖离子交换剂一般以Sepharose CL－6B为基 质。关于这些离子交换剂的性质可以参阅相应的产品介绍。
离子交换层析
原理及应用
一、简介
• 1、定义：
离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换 剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交 换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力 大小的差别而进行分离的一种层析方法
2、发展历程
• 1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交
二、基本原理 阴离子交换
• 通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子
强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加， 洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上 的各种负电基团进行交换，而将各种负电基团置 换出来，随洗脱液流出。 与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来， 而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度 才能被置换出来，这样各种负电基团就会按其与 离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下 来，从而达到分离目的。
X+ Y-↔ A-
二、基本原理
• 从上面的反应式中可以看出，如果A离子与离子交 •
离子交换层析的原理和应用
离子交换层析的原理和应用1. 原理概述离子交换层析是一种常用的分离和纯化技术，基于离子交换剂与目标物质之间的相互作用。
其原理是利用交换剂固定在固定相上的活性基团与待分离物质之间的化学吸附和解析度差异来实现目标物质的纯化和富集。
2. 交换剂的选择在离子交换层析中，选择合适的交换剂对分离效果至关重要。
- 强酸型离子交换剂：适用于分离酸性物质。
- 强碱型离子交换剂：适用于分离碱性物质。
- 强酸型离子交换剂与强碱型离子交换剂的混合：适用于分离中性物质。
3. 实验步骤离子交换层析的实验步骤如下： 1. 样品预处理：将待分离物质从样品中提取出来并纯化。
2. 选择合适的离子交换剂：根据目标物质的特性选择合适的离子交换剂。
3. 准备固定相：将离子交换剂固定在合适的固定相上。
4. 填充层析柱：将固定相装填到层析柱中。
5. 样品加载：将样品溶液加载到层析柱上，目标物质与离子交换剂发生相互作用。
6. 洗脱：通过改变溶液条件，如浓度、pH值等，使目标物质与离子交换剂解离，从而洗脱出来。
4. 应用领域离子交换层析广泛应用于以下领域： - 生物制药：用于分离和纯化蛋白质、抗体、核酸等生物大分子。
- 环境监测：用于分离和富集水样中的有机和无机污染物。
- 食品工业：用于食品添加剂、色素、香料等的分离和纯化。
- 化学分析：用于分析样品中的离子和有机物质。
- 生命科学研究：用于研究生物大分子的性质和相互作用。
5. 优点和局限性离子交换层析具有以下优点： - 分离效果好：可以实现高纯度的目标物质。
-操作简单：实验步骤相对简单，易于操作。
- 高选择性：可以通过调整离子交换剂和溶液条件来实现目标物质的选择性分离。
然而，离子交换层析也存在一些局限性： - 样品负荷量有限：由于固定相的固定容量限制，样品负荷量较小。
- 洗脱效果难以调控：洗脱条件的调控比较复杂，对操作者要求较高。
- 耗时较长：由于样品加载和洗脱等步骤的需要，离子交换层析需要较长的时间。
离子交换层析
Ixv_2 JB 980910
16
Troubleshooting
Ixv_2 JB 980910
17
Screening for the optimal ion exchanger
Sample:
Columns:
Start buffer: Elution buffer: Flow rate: Running parameters:
5
Lane 1: Lane 2: LMW markers Lane 3: Starting material Lane 4: Flow through Lane 5: 1st peak
(containing α-amylase) Lane 6: 2nd peak Lane 7: LMW markers
20
Monodisperse media
MiniBeads™ 3 µm micro-purification MonoBeads™ 10 µm polishing SOURCE™ 15 15 µm polishing SOURCE™ 30 30 µm intermediate steps
Ixv_2 JB 980910
EDTA absorbs at 254 nm
RNA/DNA
%B
100
RNA
DNA
50
0
0
2
4
6
8
Time (min)
Ixv_2 JB 980910
27
Elution schemes
• Isocratic • Step gradient • Linear gradient • Adapted
– Not usual（浓缩） – Excellent for capture steps – Standard method – Saves time and improves results
离子交换层析法
五、缓冲液的选择
缓冲液酸碱度的选择，决定于被分离物质的等电点、稳定 性、溶解度和交换剂离子的pK值。使用阴离子交换纤维时要选 用低于pK值的缓冲液，若欲分离的物质属于酸性，则缓冲液的 pH值要高于该物的等电点；用阳离子交换纤维时要选用高于 pK值的缓冲液，目的物属于碱性物质的话，缓冲液要低于该物 等电点的pH值。 缓冲液离子以不干扰分离物活性测定、不影响待测物溶解 度、不发生沉淀为原则，如使用UV吸收法测样品，那么 pyridine或barbital这类会吸收UV的物质就不适用。
三、树脂的选择
最常见的离子交换树脂材质是聚苯乙烯苯二乙烯（polystyrenedivinylbenzene）， 它是由苯乙烯（styrene）和苯二乙烯 （divinylbenzene）聚合产生的三维网状结 构，举例来说，Dow化学公司所生产的树脂 Dowex 50×8，表示含8%苯二乙烯。 具体的，根据交换树脂的性能，树脂可分 为阳离子与阴离子交换树脂：
1. 阳离子交换树脂 分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类，强酸型树脂含有－R－ SO3H，中强酸型树脂含有－PO3H2、－PO2H2或－O－PO2H2， 弱酸型树脂含有－COOH或－OH。 阳离子交换树脂进行的反应 如下：
2. 阴离子交换树脂 分为强碱型、中强碱型和弱碱型三类，含有铵盐，四级铵盐 [ － N+(CH3)3] 为强碱型树脂，三级以下铵盐 [－N(CH3)2]、[ － NHCH3]、[ －NH2] 都属弱碱型树脂；同时具有强碱和弱碱型基 团的，为中强碱型的树脂。阴离子交换树脂进行的反应如下：
洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可 逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适 宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目 的物的位置，并回收目的物。
离子交换层析法
离
子
+ OH-
交 换 R-N+（CH3）2 OH- + H2O == R-N+（CH3）2
剂
H·OH-
2．亲水性离子交换剂
磷酸纤维素 CM-纤维素 DEAE-纤维素 CM-交联葡聚糖 DEAE-交联葡聚糖 CM-Sepharose CL-6B
二、离子交换剂性质
颜色与形状 交联度 吸水量或膨胀度 交换容量 稳定性 比重
CA 、CB ＝梯度混合器A瓶、 B瓶的浓度； A1 、B1 ＝A瓶、B瓶的横切面积； V2＝流经层析柱的体积，V1＝梯度洗脱液的总体积。
线性和阶梯式梯度溶液分离牛血清 白蛋白的图谱
第五节 离子交换拄层析应用
一、去离子水的制备 二、制备、纯化生命物质 二、测定蛋白质的等电点
一价离子：Li+＜Na+＜K+＜Rb+＜Cs+ 二价离子：Mg2+＜Ca2+＜Sr2+＜Ba2+ 一价阴离子：F-＜Cl-＜Br-＜I不同价阳离子：Na+＜Ca2+＜Al3+＜Ti4+
磺酸基树脂和季胺基树脂 对各种离子的相对选择系数
阳离子树脂
反离子 相对选择系数
H+
1.0
Na+
1.5
NH4+
1.95
2、缓冲液离子组成的选择
①缓冲液离子的pK值要接近所用的pH， ②采用阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液，
如：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐 ③采用阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液，
如：Tris ④缓冲液离子不影响被分离物的活性、测定、
溶解度。
3、缓冲液离子强度的选择
①起始缓冲液能使样品中有效成分与离子交换 剂结合，一般小于0.1mol/L。
离子交换层析
液。平衡缓冲液的离子强度和pH的选择首先要保证各个待分 离物质如蛋白质的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子 交换剂有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交 换剂的结合有较大的差别。
一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合。尽量使
杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定。在一些情况下可以 使杂质与离子交换剂牢固地结合，而样品与离子交换剂结合 不稳定，也可以达到分离的目的。
离子交换层析的基本操作
（1） 层析柱
离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱，
离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长。直径和 柱长比一般为1:10到1:50之间，层析柱安装要垂直。装 柱时要均匀平整，不能有气泡。
装柱用于平衡离子交换柱的缓冲
■ 胶体的组成与外型：
Pharmacia (1991) Ion Exchange Chromatography – Principles and Methods p.24
Cellulose Sephcel Monobead
Pharmacia (1980) Separation News: 5
离子交换剂的选择、处理和保存
Buffer: 0.01 M Tris-HCl, pH 8.0
mg / mL gel
Adapted from Pharmacia (1991) Ion Exchange Chromatography – Principles and Methods p.64
影响交换容量的因素很多，主要可分为两个方面。
换剂上的样品组份洗脱下来。
柱效
通过柱子分离得到窄而对称的洗脱峰的能力（分辨率）
装柱的质量
树脂颗粒的大小
正确的洗脱条件
离子交换层析法的原理
离子交换层析法的原理
离子交换层析法是一种根据物质带电性质差异，从而实现分离纯化的层析技术。
该方法的原理是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子的溶液为流动相，利用离子交换剂对需要分离的各种蛋白质结合力的差异，而将混合物中不同蛋白质进行分离。
离子交换的本质是目标物和介质功能配基之间的静电相互作用，蛋白质的带电性是由蛋白质多肽中带电氨基酸决定的，而蛋白质中氨基酸的电性又取决于介质中的pH，所以蛋白质的带电性也就依赖于介质的pH。
层析时，离子交换树脂的分子中有活性基并带有阴、阳电荷，在水溶液中可与其它阴、阳离子起交换作用，这种交换作用是可逆的，遵循化学平衡原理。
通过连续添加洗脱液，溶液平衡向右进行，可以把原有离子交换树脂上的活性离子洗脱下来，而带有相同电荷的离子被交换吸附在树脂上，然后被吸附的物质又可用另一种洗脱液洗下来，从而达到分离提取的目的。
离子交换层析
离子交换层析离子交换层析，是一种常用的分离纯化技术，通过固定相上的离子交换剂与溶液中的离子发生置换反应，实现对目标离子的选择性分离。
它广泛应用于水处理、制药、生物技术、食品工业等领域，发挥着重要的作用。
在离子交换层析中，离子交换剂是关键的分离介质。
一般来说，离子交换剂是具有离子可交换功能的均质材料。
根据介质的性质，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂，用于分离以阳离子或阴离子形式存在的目标物质。
离子交换剂的选择应考虑到分离的目标离子的性质和阳离子或阴离子交换剂的特性。
离子交换层析的工作原理是离子在固定相和液相之间的交换作用。
通过溶液中的离子与固定相上的离子交换剂发生反应，固定相上的离子交换剂也可释放出根离子或酸离子以与液相中的离子发生反应。
在离子交换的过程中，目标离子与固定相上的离子交换剂发生选择性的吸附与解吸，实现了目标离子的分离纯化。
离子交换层析的工艺流程通常包括前处理、进料、洗脱和再生等步骤。
前处理是为了使进料溶液与离子交换剂更好地接触，可以采用调整pH值、滤除杂质等方法。
进料环节是将目标离子溶液与离子交换剂接触，使离子发生交换反应。
洗脱是将目标离子被吸附在固定相上的离子交换剂从固定相上解吸出来，采用调整pH值、改变浓度等方法。
再生是将已经吸附的离子交换剂通过一定的操作条件重新得到可再使用的形式。
离子交换层析具有许多优点。
首先，层析介质的选择性强，可以实现高效的纯化分离。
其次，离子交换层析可以在常温下进行，避免了高温条件下目标物质的失活。
再次，操作简单，易于控制，适合大规模工业生产。
此外，离子交换层析还可以实现连续操作，提高生产效率。
总结起来，离子交换层析是一种重要的分离纯化技术，广泛应用于水处理、制药、生物技术、食品工业等领域。
通过选择合适的离子交换剂和优化工艺条件，可以实现对目标离子的高效分离纯化，为各个领域的生产提供了有力的支持。
离子交换层析ionexchangechromatography
强碱 含季胺基团 [-N+(CH3)3] 弱碱 含叔胺、伯胺基团[-N(CH3)2 阴离子互换树脂对化学试剂及热都不如阳离 子互换树脂稳定。
2.离子互换纤维素
▪ 阴离子互换纤维素 —如:DEAE-纤维素 pH8.6下列分离中性或酸性物质,具二乙 胺乙基
▪ 阳离子互换纤维素—如:CM-纤维素 一 般pH>4条件下使用,具有羧甲基
2、检测：从第2管起每搜集管中加入2ml茚三 酮显色液，充分混合，沸水浴15分钟，自 来水冷却，观察氨基酸与茚三酮旳显色反 应，若生成紫色化合物，则阐明搜集到氨 基酸。
Separation of amino acids on a cation exchange column
Different types of ion exchange resins (a) Cation exchanger (b) Anion exchanger.
O OH
O
－CO2
R CH COOH +
NH2
O R
N CH2
－2H2O
O R
N CHCOOH
O O
H
R H2O
N CH
RCHO +
O O
H NH2
O OO
H N
O
O
OH OH
O
O O
H N
O O
O
O
紫色物质，用于α－氨基酸旳比色测定和纸层析显色
▪
Asp
His
▪ pH4.2
▪ pH >10
[器材]
原则：不能发生化学反应，所带电荷应与样 品一致。防止使样品变性
(三)洗脱剂 原则：所用洗脱液比吸着物质具有更活 泼旳离子或基团
离子交换层析
离子交换层析在各方面的应用离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。
在生物化学及临床生化检验中主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子。
【2】2009年方希修，王冬梅等人应用平板式膜超滤技术与DEAE高子交换层析法对卵黄免疫球蛋白(IgY)进行分高纯化，经DEAE离子交换层析得到高纯度的IgY。
【4】2010年马江涛、陈昕等人使用Bio—Rad的DiaSTAT糖化血红蛋白检测系统(LPLC)和Biosystem.S.A的微柱离子交换层析法分别测定糖化血红蛋白，并进行精密度、网收率、干扰闪素及相关性的比较分析,证明了离子交换层析法测定糖化血红蛋白的方法适合临床常规应用。
【5】2010年蒋超，张或等人用超滤、阳离子交换层析方法从热钙法处理过的干酪乳清中分离纯化乳铁蛋白，其纯度达93.6%。
近年来，随着合成技术的发展和生产的需要，人工合成的刚性材料被陆续开发出来，这也是未来离子交换介质发展的一个趋势。
1.层析分离纯化家兔血清PONl条件的优化代恒、赵敏等人报道，Paraoxonase(PONl)是--个钙离子依赖的酯酶，它可以水解包括有机磷类，芳香酯类在内的多种化合物。
作为一种生物酶，PONl 可以在普通的生物环境下将有机磷类毒剂迅速水解，使之分解为无毒或低毒的化合物。
存在于血清中的PONl，可达到在有机磷毒物到达它的生物受体之前将其清除的目的。
在本研究中，使用Cibacron Blue F3GA琼脂糖的假亲和层析得到初步分离富含PONl的Cibacron流分，选定DEAE Sepharose Fast Flow为离子交换层析介质，通过AKTA purifier全自动层析仪，在PH值分别为7．0，7．5，8．0，8．5，9．0，9．5条件下对Cibacron流分进行离子交换层析。
离子交换层析原理
简介离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。
本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。
50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。
目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。
基本原理离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。
离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。
离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。
电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。
平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。
平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。
其中R代表离子交换剂的高分子聚合物基质，X- 和X+ 分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基团，Y+ 和Y- 分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子，A+ 和A- 分别代表溶液中的离子基团。
从上面的反应式中可以看出，如果A离子与离子交换剂的结合力强于Y离子，或者提高A离子的浓度，或者通过改变其它一些条件，可以使A离子将Y离子从离子交换剂上置换出来。
也就是说，在一定条件下，溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来，并通过电荷基团结合到固定相上，而平衡离子则进入流动相，这就是离子交换层析的基本置换反应。
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实验二离子交换层析纯化兔血清IgG
【原理】
DEAE-Sephadex A-50 （二乙氨基- 乙基- 葡萄糖凝胶A-50 ）为弱碱性阴离子交换剂。
用NaOH 将Cl - 型转变为OH - 型后，可吸附酸性蛋白。
血清中的γ 球蛋白属于中性蛋白（等电点为pH6.85 ～7.5 ），其余均属酸性蛋白。
pH7.2 ～7.4 的环境中。
酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50 吸附，只有γ 球蛋白便可在洗脱液中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG 。
【试剂与器材】
1. DEAE-Sephadex A-50
2.0.5mol/L HCl 和NaOH
3.0.1mol/L pH7.4 PBS
4.0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4)
5.0.02 ％NaN 3
6.PEG
7. 无水乙醇
8. 紫外分光光度计
9.1cm×20cm 玻璃层析柱
10. 自动部分收集器
【操作步骤】
1 ．DEAE-Sephadex A-50 预处理称DEAE-Sephadex A-50 （下称A-50 ）5g ，悬于500ml 蒸馏水内，1h 后倾去上层细粒。
按每克A-50 加0.5mol/L NaOH 15ml 的比例，将浸泡于0.5mol/L NaOH 液中，搅匀，静置30min ，装入布氏漏斗（垫有
2 层滤纸）中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至pH 呈中性；再以0.5mol/L HCl 同上操作过程处理，最后以0.5mol/L NaOH 再处理一次，处理完后，将A-50 浸泡于0.1mol/L pH7.4 PBS 中过夜。
2 ．装柱
（ 1 ）将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。
（2 ）将0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4) 沿玻璃棒倒入柱中至1/4 高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50 。
待A-50 凝胶沉降2 ～3cm 高时，开启出水口螺旋夹，控制流速1ml/min ，同时连续倒入糊状A-50 凝胶至所需高度。
（ 3 ）关闭出水口，待A-50 凝胶完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口，通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。
3 ．平衡启开出水口螺旋夹，控制流速
4 滴/min ，使约2 倍床体积的洗脱液流出。
并以pH 计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之PH 值与离子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止平衡。
4 ．加样及洗脱启开上口橡皮塞及下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品（0.5ml 血清，体积应小于床体积的2% ，蛋白浓度以＜100mg 为宜）。
松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内，至与柱面
相切时，立即关闭下口，以少量洗脱液洗柱壁2 ～3 次；再放开出水口，使洗液进入床柱，随后立即于柱面上加入数毫升洗脱液，紧塞柱上口，使整个洗脱过程成一密闭系统。
并控制流速， 4 滴/min.
5 ．收集开始洗脱的同时就以试管进行收集；每管收集4ml. 共收集10 ～15 管。
6 ．测蛋白以751 型紫外分光光度计分别测定每管A 260 ，按公式计算各管蛋白含量。
并以A 280 为纵坐标，绘制洗脱曲线。
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7 ．合并、浓缩将洗脱峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并，以PEG （Mw6000 ）浓缩至所需体积，加入0.02 ％NaN 3 防腐，于4℃保存备用。
长期保存时应贮于-40℃冰箱。
8 ．A-50 凝胶的再生在柱上先以2mol/L NaCl 洗脱杂蛋白至流出液的 A 280 <0.02 ，再以蒸馏水洗去柱中盐。
然后按预处理过程将A-50 再处理一遍即达再生。
近期用时泡于洗脱缓冲液中4℃保存；近期不用时，以无水酒精洗 2 次，再置50℃温箱烘干，装瓶内保存。
离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子
进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。
本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。
50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。
目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。
常用的离子交换剂有：离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换树脂。
离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。
带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。
离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。
由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。
阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将
吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。
结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。
反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。
⒈离子交换剂预处理和装柱对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。
溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。
阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处
理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。
洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。
已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。
为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。
柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。
⒉加样与洗脱加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。
样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。
为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。
柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1％-5％。
洗脱：已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。
为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。
由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。
最好的洗脱方法是连续梯度洗脱，洗脱装置见图16-6.两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当
溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。
第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计算：C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1
式中A1、A2分别代表两容器的截面积：C1、C2分别表示容器中溶液的浓度；V为流出体积对总体积之比。
当A1＝A2时为线性梯度，当A1＞A2时为凹形梯度，A1＞A2时为凸形梯度。
洗脱时应满足以下要求：①洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不致于太拥挤。
②梯度的上限要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。
③梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。
目的物的过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。
⒊洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可逐管进行测定，得到层析图谱。
依实验目的的不同，可采用适宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。
⒋离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生。
如离子交换纤维素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有强吸附物则可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。
保存离子交换剂时要加防腐剂。
对阴离子交换剂宜用0.002％氯已定（洗必泰），阳离子交换剂可用乙基硫柳汞（0.005％）。
有些产品建立用0.02％叠氮钠。
⒌离子交换层析的应用离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。
在生物化学及临床生化检验中主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子。