细胞培养标准操作程序(SOP).doc
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养瓶放入CO2培养箱。（ 注意：加入到培养瓶后，培养瓶轻轻平放，用手拿培养瓶侧壁，左右上下轻轻摇
晃几次，使细胞均匀贴壁在培养瓶底。）
6、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。
注意：
（1）入细胞室前观察CO2%压力，左右，减压器表压力不低于！
（2）刚复苏的细胞需要的营养成分更多些，让FBS浓度达到20％。
可再用。
（7）DMSO（二甲基亚砜）在常温下对细胞毒性较大，
而在
4℃时，其毒性大大减弱，故冻存的细胞
复苏后应及时洗涤冷冻保护剂
DMSO（离心后弃去上清），防止
DMSO在常温下对细胞产生较大毒性！
细胞换液
1、倒置显微镜下观察细胞生长状态：
a.移动细胞培养瓶时，观察到呈漂浮状态的细胞为死细胞；
b.生长状态良好的细胞：透明度大、折光性强、轮廓不清；能看清部分细胞细微结构，细胞处于对数生长期时可以见到很多分裂期细胞。
NaCl8g
KCl
＋新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至
1000ml
Na2HPO4*HO
KH2PO4
（1）
无需调
PH值，其成分溶解后
PH为，不需除菌滤膜过滤除菌，放于
4℃保存，用前直接高压灭菌
（高压时，装
PBS的瓶子的瓶盖要插针头
!）
（2）Na2HPO4*H2O则Na2HPO4*12 H2O需
（3）如欲配制500ml，以上成分减半即可
虽然冲洗杂质效果较好，但它有使细胞易脱壁的倾向，故不可经常冲洗细胞。
c．不温的PBS用来做难消化细胞消化前冲洗一遍的准备，使细胞加入胰酶后易消化。
d．消化后暂时不养细胞的培养瓶，可以往其中加入
2～3ml PBS（防止培养瓶干燥），培养瓶
放CO2培养箱里短时间保存。下次用该培养瓶再养同种细胞时，把
PBS吸出弃去，再用培养基冲洗一遍即
d．胰酶和
PBS（平衡盐溶液）可以用一根滴管，不过最好分开
（5）不是所有的细胞复苏后都能活。死亡原因：冻存时间太长（如打太激烈）、细胞传代数太多等。
2年以上），技术不过关（如吹
（6）关于PBS（平衡盐溶液）:
a. PBS溶液配好后要高压灭菌后才能用；PBS高压时其瓶塞一定要插针头。
b. PBS和培养基都可以冲洗培养瓶里细胞中的杂质，但需用温过的PBS冲洗细胞中的杂质。PBS
细胞培养标准操作程序（SOP）
1Fra Baidu bibliotek目的：
为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤，特制订
实验室细胞培养操作流程。
2．适用范围：
适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。
3．操作规程：
培养液、PBS、胰蛋白酶的配制
1000ml
培养液的配制
1、准备用品：培养粉、
1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2～3天内的新鲜三蒸水
5ml加入试管中（一滴约为
50ul）。
3、戴手套，从
-196℃液氮罐中取出冻存管，立即放入
37℃水浴箱中快速解冻，同时不断轻轻摇动冻
存管，保证冻存管内细胞
1min
内融化。以
70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。
（慢冻快融 ）
4、用吸细胞液的滴管从冻存管中完全吸出细胞悬液，加入到已装有培养基的试管中，塞子塞试管，
（4）如欲配制500ml，以上成分减半即可
细胞复苏
1、准备：紫外线照台30min，准备好装有高压灭菌好的吸管、试管的饭盒、废液缸；培养基临用前
放水浴箱里温育20分钟。在操作台上摆放好物品，左边为饭盒、培养液等，中间为酒精灯、试管架等，右
边放滴管架、镊子，右上角放废液缸。
2、灼烧培养瓶口及瓶盖，用滴管取培养基
800rpm离心
2min（用培养基且离心的目的
:去除细胞冷冻保护剂
DMSO，因常温下其对细胞毒性大），弃上
清，试管底部的白色物质为细胞，轻弹混匀。往试管中加培养基、
FBS（胎牛血清）各
80滴和
20滴（使
FBS浓度为20％）。用吸细胞液的滴管轻轻吹打，使细胞混匀，以免在培养瓶里成团，影响细胞生长。
5、将试管中的细胞悬液用吸细胞液的滴管全部吸出，加到培养瓶中，标记日期、细胞名称，再把培
（3）离心时间为1～2min，速度为800转，不要离心太久，避免对细胞伤害较大。
（4）滴管使用注意事项：
a.吸细胞液专用一个滴管，各株细胞的滴管一定要严格分开，不能混用，防止细胞间污染。
b.培养基和FBS（胎牛血清）可以用一个滴管，但分开用更好！
c.FBS（胎牛血清）不能和胰酶用一根滴管,因为血清对胰酶活性有抑制作用。
1000ml需加
NaHCO3粉，
Invitrogen
公司的
DMEM需加
NaHCO3粉等），再充分搅拌。无需加谷氨酰胺，因该培养基里已含有。
4、用
1M（1mol/L）HCl
调PH至左右（细胞适宜在～生长，配制好后
PH值会升高～，故配时调
PH
至左右）。
5、用新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）定容到1000ml。
（1）配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）配制。一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。
（2）准备的100ml×10个玻璃瓶必须事先高压灭菌 ！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。
PBS（平衡盐溶液）的配制
6、配青霉素
80万/瓶
+ 4ml
蒸馏水
溶解
配链霉素100万/瓶+ 4ml蒸馏水溶解
取青霉素和链霉素加入到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml，充分搅拌混匀。
7、在无菌操作台里用的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄
膜封口，盖上橡皮塞，放注意：
-20℃保存备用。
%胰蛋白酶的配制
胰蛋白酶粉
EDTA（乙二胺四乙酸二钠）
NaCl
KCl
`
+新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至
1000ML
NaHCO3
Glucose(
葡萄糖)
酚红
（1）配出来的
PH值为，在
PH值～范围内，故不需调
PH值。
（2）用的除菌滤膜过滤分装，瓶口用薄膜封口，放-20℃保存备用。4℃可连续使用1月左右。
（3）用于分装的玻璃瓶必须事先高压灭菌！而烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。
（或新鲜反渗水）、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶（100ml×10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2～3个过
滤器、注射器。紫外线照台30min。
2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末。
3、充分搅拌，按说明添加成分（如
Invitrogen
公司的
RPMI-1640配制
晃几次，使细胞均匀贴壁在培养瓶底。）
6、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。
注意：
（1）入细胞室前观察CO2%压力，左右，减压器表压力不低于！
（2）刚复苏的细胞需要的营养成分更多些，让FBS浓度达到20％。
可再用。
（7）DMSO（二甲基亚砜）在常温下对细胞毒性较大，
而在
4℃时，其毒性大大减弱，故冻存的细胞
复苏后应及时洗涤冷冻保护剂
DMSO（离心后弃去上清），防止
DMSO在常温下对细胞产生较大毒性！
细胞换液
1、倒置显微镜下观察细胞生长状态：
a.移动细胞培养瓶时，观察到呈漂浮状态的细胞为死细胞；
b.生长状态良好的细胞：透明度大、折光性强、轮廓不清；能看清部分细胞细微结构，细胞处于对数生长期时可以见到很多分裂期细胞。
NaCl8g
KCl
＋新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至
1000ml
Na2HPO4*HO
KH2PO4
（1）
无需调
PH值，其成分溶解后
PH为，不需除菌滤膜过滤除菌，放于
4℃保存，用前直接高压灭菌
（高压时，装
PBS的瓶子的瓶盖要插针头
!）
（2）Na2HPO4*H2O则Na2HPO4*12 H2O需
（3）如欲配制500ml，以上成分减半即可
虽然冲洗杂质效果较好，但它有使细胞易脱壁的倾向，故不可经常冲洗细胞。
c．不温的PBS用来做难消化细胞消化前冲洗一遍的准备，使细胞加入胰酶后易消化。
d．消化后暂时不养细胞的培养瓶，可以往其中加入
2～3ml PBS（防止培养瓶干燥），培养瓶
放CO2培养箱里短时间保存。下次用该培养瓶再养同种细胞时，把
PBS吸出弃去，再用培养基冲洗一遍即
d．胰酶和
PBS（平衡盐溶液）可以用一根滴管，不过最好分开
（5）不是所有的细胞复苏后都能活。死亡原因：冻存时间太长（如打太激烈）、细胞传代数太多等。
2年以上），技术不过关（如吹
（6）关于PBS（平衡盐溶液）:
a. PBS溶液配好后要高压灭菌后才能用；PBS高压时其瓶塞一定要插针头。
b. PBS和培养基都可以冲洗培养瓶里细胞中的杂质，但需用温过的PBS冲洗细胞中的杂质。PBS
细胞培养标准操作程序（SOP）
1Fra Baidu bibliotek目的：
为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤，特制订
实验室细胞培养操作流程。
2．适用范围：
适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。
3．操作规程：
培养液、PBS、胰蛋白酶的配制
1000ml
培养液的配制
1、准备用品：培养粉、
1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2～3天内的新鲜三蒸水
5ml加入试管中（一滴约为
50ul）。
3、戴手套，从
-196℃液氮罐中取出冻存管，立即放入
37℃水浴箱中快速解冻，同时不断轻轻摇动冻
存管，保证冻存管内细胞
1min
内融化。以
70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。
（慢冻快融 ）
4、用吸细胞液的滴管从冻存管中完全吸出细胞悬液，加入到已装有培养基的试管中，塞子塞试管，
（4）如欲配制500ml，以上成分减半即可
细胞复苏
1、准备：紫外线照台30min，准备好装有高压灭菌好的吸管、试管的饭盒、废液缸；培养基临用前
放水浴箱里温育20分钟。在操作台上摆放好物品，左边为饭盒、培养液等，中间为酒精灯、试管架等，右
边放滴管架、镊子，右上角放废液缸。
2、灼烧培养瓶口及瓶盖，用滴管取培养基
800rpm离心
2min（用培养基且离心的目的
:去除细胞冷冻保护剂
DMSO，因常温下其对细胞毒性大），弃上
清，试管底部的白色物质为细胞，轻弹混匀。往试管中加培养基、
FBS（胎牛血清）各
80滴和
20滴（使
FBS浓度为20％）。用吸细胞液的滴管轻轻吹打，使细胞混匀，以免在培养瓶里成团，影响细胞生长。
5、将试管中的细胞悬液用吸细胞液的滴管全部吸出，加到培养瓶中，标记日期、细胞名称，再把培
（3）离心时间为1～2min，速度为800转，不要离心太久，避免对细胞伤害较大。
（4）滴管使用注意事项：
a.吸细胞液专用一个滴管，各株细胞的滴管一定要严格分开，不能混用，防止细胞间污染。
b.培养基和FBS（胎牛血清）可以用一个滴管，但分开用更好！
c.FBS（胎牛血清）不能和胰酶用一根滴管,因为血清对胰酶活性有抑制作用。
1000ml需加
NaHCO3粉，
Invitrogen
公司的
DMEM需加
NaHCO3粉等），再充分搅拌。无需加谷氨酰胺，因该培养基里已含有。
4、用
1M（1mol/L）HCl
调PH至左右（细胞适宜在～生长，配制好后
PH值会升高～，故配时调
PH
至左右）。
5、用新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）定容到1000ml。
（1）配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）配制。一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。
（2）准备的100ml×10个玻璃瓶必须事先高压灭菌 ！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。
PBS（平衡盐溶液）的配制
6、配青霉素
80万/瓶
+ 4ml
蒸馏水
溶解
配链霉素100万/瓶+ 4ml蒸馏水溶解
取青霉素和链霉素加入到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml，充分搅拌混匀。
7、在无菌操作台里用的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄
膜封口，盖上橡皮塞，放注意：
-20℃保存备用。
%胰蛋白酶的配制
胰蛋白酶粉
EDTA（乙二胺四乙酸二钠）
NaCl
KCl
`
+新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至
1000ML
NaHCO3
Glucose(
葡萄糖)
酚红
（1）配出来的
PH值为，在
PH值～范围内，故不需调
PH值。
（2）用的除菌滤膜过滤分装，瓶口用薄膜封口，放-20℃保存备用。4℃可连续使用1月左右。
（3）用于分装的玻璃瓶必须事先高压灭菌！而烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。
（或新鲜反渗水）、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶（100ml×10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2～3个过
滤器、注射器。紫外线照台30min。
2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末。
3、充分搅拌，按说明添加成分（如
Invitrogen
公司的
RPMI-1640配制