Western-Blotting实验报告(优选.)
实验报告三--免疫印迹
实验三：免疫印迹1 原理免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。
不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。
该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。
目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。
免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。
蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。
本试验采用湿法转移。
免疫印迹用膜通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜两种。
大多数应用前者。
本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。
转移结束后，蛋白质的检测可分成三个步骤进行：首先，将膜同特异性抗体孵育数小时或过夜，然后将膜同可特异性识别上述抗体（一抗）的第二抗体（二抗）孵育，通常二抗连接有如辣根过氧化物酶等标记物。
目的蛋白可由该酶催化的显色反应在膜上形成有色产物加以检测。
本实验用的是酶标抗IgG，故不加一抗。
2 试剂与仪器2.1 试剂（所有试剂均供两组用）2.1.1 转移缓冲液Tris 3.025g甘氨酸14.413g甲醇20mL加蒸馏水约800mL，调pH至8.3，定容1000mL2.1.2 Tris缓冲盐溶液(TBS)Tris 2.42gNaCl 27.750g加蒸馏水约800mL，调pH至7.5，定容1000mL2.1.3 TTBSTBS 800mLTween-20 400μl2.1.4 封闭液及抗体稀释液脱脂奶粉0.3gTBS 100mL2.1.5 底物溶液二氨基联苯胺（DAB） 5.0mgTBS 18mLH2O220μl 临用前配2.1.6 丽春红总蛋白质染色液丽春红1g4%乙酸100mL2.1.7 5%小牛血清生理盐水小牛血清7.5mL0.85%生理盐水定容至150mL2.1.8 酶标抗IgG（1：1500）酶标抗IgG 0.1mL5%小牛血清生理盐水定容至150mL2.2 仪器夹心式电泳槽，电泳仪，硝酸纤维素膜，直径9cm培养皿，剪刀，镊子，刀片，微量移液枪，普通滤纸3 试验步骤3.1 SDS-PAGE电泳分离所需试剂、仪器以及分离步骤完全与实验六相同，故此处从略。
Western Blotting实验
WB实验蛋白质提取：1、取适量新鲜大鼠肌肉组织100mg，加1ml预冷的RIPA裂解液（中），在冰上于玻璃研磨器中充分研磨，放置5min，4℃、12000r离心15min，取上清即为蛋白提取液。
蛋白定量后4份的蛋白提取液与1份的5X蛋白上样缓冲液混合。
-80℃冰箱保存。
2、蛋白上样前沸水煮5min， 5ul、10 ul、15 ul交替上样。
制备SDS-PAGE胶:10%分离胶溶液12ml（两块胶）1 双蒸水 4.86ml2 1.5MTris-HCl缓冲液，pH8.8，0.4%SDS 3ml3 30%丙烯酰胺溶液4ml4 10%AP 100ul5 TEMED 8ul灌胶至制胶架绿色小门上1mm处，然后轻柔地加入双蒸水，隔绝空气，室温静置30分钟待凝5%浓缩胶5ml（两块胶）1 双蒸水 2.87ml2 0.5MTris-HCl缓冲液，pH6.8，0.4%SDS 1.25ml3 30%丙烯酰胺溶液0.83ml4 10%AP 50ul5 TEMED 5ul待分离胶完全凝聚后（能看出折线），倒掉双蒸水，用滤纸吸干。
灌满浓缩胶，轻柔的从一侧开始放入梳子，30分钟待凝。
注意！！！烧杯中剩余的未凝的配胶溶液不要随意丢弃，要装在回收胶的50ml离心管里，待完全凝集没有毒性后丢弃。
电泳：将凝好的胶板装入电泳仪（短板向内，玻璃板下面的气泡要排出），内外槽均加入电泳缓冲液，内槽要加满。
左边第一孔加Marker：10μl /孔，其它孔上样品，每孔加5-15μl。
电压80V，待跑出浓缩胶、进入分离胶后，调电压至120V或100V--至目标条带到达中间位置，如果电泳太慢，体系有问题！5×电泳缓冲液配方：槽内的电泳液可以回收，但是外槽的不要回收1 Tris碱15.1g2 甘氨酸94g3 SDS/10%SD5g/50mlS4 HCl 调pH8.35 双蒸水1000ml补充至考马斯亮蓝染色：染色时间：1小时脱色时间：脱色30分钟后换脱色液，（染色液和脱色液回收）脱色至结果满意为止，然后换成清水。
免疫印迹实验报告
免疫印迹实验报告一、实验目的免疫印迹（Western blotting）是一种广泛应用于分子生物学、生物化学和免疫学等领域的技术，用于检测和定量特定蛋白质在样品中的表达水平。
本次实验的目的是通过免疫印迹技术检测目标蛋白在不同样品中的表达情况，以验证实验假设并为进一步的研究提供数据支持。
二、实验原理免疫印迹实验基于抗原抗体特异性结合的原理。
首先，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）将蛋白质样品按照分子量大小分离。
然后，将分离后的蛋白质从凝胶转移到固相支持物（如硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜）上。
接着，膜与特异性抗体进行孵育，使抗体与目标蛋白结合。
最后，通过检测抗体的存在来确定目标蛋白的表达水平。
检测抗体的方法通常包括使用酶标记的二抗结合底物产生显色或发光信号，或者使用荧光标记的二抗通过荧光检测系统进行检测。
三、实验材料和设备1、材料细胞裂解液蛋白酶抑制剂蛋白标准品一抗（特异性针对目标蛋白）二抗（酶标记或荧光标记）化学发光底物（或荧光检测试剂）预染蛋白分子量标准硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜电泳缓冲液转膜缓冲液封闭液（如脱脂奶粉或牛血清白蛋白溶液）洗涤液（含吐温 20 的磷酸盐缓冲液）2、设备电泳仪和电泳槽转膜装置摇床冰箱酶标仪（或荧光检测仪器）四、实验步骤1、蛋白样品制备收集细胞或组织样本，加入适量的细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，在冰上裂解一定时间。
离心收集上清液，即为蛋白样品。
2、 SDSPAGE 电泳制备 SDSPAGE 凝胶，根据目标蛋白的分子量选择合适的分离胶浓度。
将蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸变性。
上样，进行电泳，直至溴酚蓝指示剂到达凝胶底部。
3、转膜电泳结束后，将凝胶浸泡在转膜缓冲液中平衡。
按照“三明治”结构组装转膜装置，依次为阴极、滤纸、凝胶、膜、滤纸、阳极。
在冰浴或冷室中进行转膜，根据蛋白分子量和转膜条件确定转膜时间。
4、封闭转膜结束后，将膜放入封闭液中，在摇床上孵育一定时间，以封闭非特异性结合位点。
实验七蛋白质免疫印迹实验WesternBlotting
一 实验原理
电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物 上是通过电转移仪器完成的。它是将固 体支持物面对阳极、凝胶面对阴极，二 者结合在一起，然后将外面二侧用 Whatman 3MM滤纸结合，形成“三明治” 结构，放入电转移仪器上，加入电泳缓 冲液，通上电源后，蛋白质即可从凝胶 上转移到固体支持物上。
一 实验原理
二试剂和 NaCl 8g,KCl 0.2g,Na2HPO4 1.44g,KH2PO4 0.24g 加双蒸水800ml,用HCl调pH到pH7.4,再加水到1000ml, 分装后，15磅20分钟灭菌。 4-氯萘酚显色液：用30mg 4-氯萘酚（简称4-CN）溶 于1ml无水乙醇中制成母液。将50μ14-CN对母液和 5μ130%的H2O2加入到5ml 0.05M/L Tris-Cl(pH7.6)中。 氨基黑染色液：0.1%氨基黑10-B、45%甲醇、10%冰 乙酸 氨基黑脱色液：90%甲醇、2%冰乙酸、8%水
二试剂和器材
2．器材 电转移仪器 恒温摇床 硝酸纤维素薄膜 Whatman 3MM滤纸 电泳仪 裁纸刀 φ25cm培养皿
玻璃棒
三 操作步骤
1蛋白质电转移 戴上手套，取下SDS-PAGE凝胶，小心剥离凝胶。裁剪与凝胶同样大的 硝酸纤维素薄膜和六层Whatman 3MM滤纸，在硝酸纤维素薄膜左下角 剪去一角作为标记。将硝酸纤维素薄膜漂浮于去离子水的表面，使水从 膜的下部浸透以去除其间气泡，将Whatman 3MM滤纸在电转移缓冲液 中浸湿，用蒸馏水淋洗石墨电极，先将三层浸湿的滤纸放在阳极上，在 滤纸表面滚动玻璃棒以除去其间的气泡，再将浸湿的硝酸纤维素薄膜小 心平铺在滤纸上，用玻璃棒小心去除气泡。随后将12%SDS-PAGE凝胶 舒展平铺在硝酸纤维素薄膜上，用玻璃棒小心去除气泡，再将三层浸湿 的滤纸平铺在凝胶上，沁心去除气泡，最后加上石墨电极板，接通电源 进行电转移，电流的大小由凝胶的大小决定，为0.65mA/平方厘米。电 转移2小时后，停止通电，卸掉电转移装置，取下凝胶进行考马斯亮兰 染色，以检测电转移是否完全。小心取下硝酸纤维素薄膜，放在一张干 滤纸上，吸干30-60分钟后，开始进显色反应。
蛋白印迹实验报告
蛋白印迹实验报告篇一：实验十二Western印迹鉴定目标蛋白实验十二Western印迹鉴定目标蛋白实验目的1.了解Western blot的原理及其意义，掌握Western blot的操作方法；2.应用Western blot 技术分析鉴定经SDS-PAGE分离后转移到尼龙膜上的重组蛋白。
实验原理Western印迹法简称蛋白质印迹法。
蛋白质样品经SDS-PAGE电泳后，凝胶所含的样品蛋白质区带通过电泳方法转移、固定到载体（如尼龙膜、硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价键的形式与蛋白质结合，从而固定住蛋白质；以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第一抗体起免疫反应，再和酶标记或同位素标记的第二抗体反应，用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置含底物的溶液中温育，或通过放射自显影显出谱带，即可检测出样品中的特异蛋白组分。
试剂与器材试剂1.转移缓冲液：甘氨酸（39 mmol/L），Tris 碱（48mmol/L），SDS （%），200ml 甲醇（20%），定容至1,000mL；2.封闭液：5% 脱脂奶粉，% 叠氮钠，溶于PBST溶液中；3.丽春红S（Ponceaus）染液：丽春红S溶于1mL 冰乙酸中，加水至100mL；洗膜液：PBS 缓冲液含% Tween 20；5．DAB浓缩显色液（50X）：DAB （二氨基联苯胺）是根过氧化物酶的底物之一，临用前稀释。
6．5 x PBS：在1600mL蒸馏水中溶解Na 2HPO4 , Na H2PO4, 40g Na Cl,用/L NaOH调pH至，加水定容至2升。
高压灭菌20 分钟，室温保存。
用前稀释至1x 。
7．SDS-PAGE电泳用溶液和试剂。
器材电泳装置一套;2.电转移膜装置3.抗体-酶反应摇床操作方法〈一〉电转移1．将蛋白质样品进行SDS-PAGE，待溴酚蓝跑出胶后停止电泳（1）。
2．载手套切6-8张定性滤纸和一张尼龙膜，它们的大小应与凝胶的大小相同。
在尼龙膜的一（左）角作一记号（或剪角），与滤纸和海棉（纤维）垫浸泡于转移缓冲液中。
免疫印迹技术实验报告
免疫印迹技术实验报告一、引言免疫印迹技术（Western Blotting）是一种用于检测特定蛋白质的定性和定量分析方法。
它基于免疫学原理，通过将待测蛋白质进行电泳分离，并利用抗体与目标蛋白质特异性结合的原理，最终实现对目标蛋白质的检测和定量分析。
本实验旨在通过免疫印迹技术检测目标蛋白质在不同样本中的表达水平，并观察其变化情况，以深入了解该蛋白质的功能和作用机制。
二、实验步骤1. 样本制备首先，我们需要准备样本。
样本可以是细胞或组织。
在实验中，我们选择了A 细胞和B细胞作为样本，分别进行后续实验。
2. 蛋白质提取将A细胞和B细胞分别加入适量的细胞裂解缓冲液，通过离心等操作将细胞裂解并获取蛋白质提取物。
3. SDS-PAGE电泳分离将蛋白质提取物加入SDS-PAGE凝胶中，进行电泳分离。
电泳时间和电压根据实验需要来确定。
4. 转膜将电泳分离后的蛋白质从凝胶中转移到聚丙烯酰胺膜上。
转膜可以通过湿法或半湿法等方法实现。
5. 阻断将转膜后的聚丙烯酰胺膜放入阻断液中，在室温下进行阻断。
阻断的目的是防止非特异性结合。
6. 一抗处理将目标蛋白质的一抗加入到含有阻断液的培养皿中，将转膜的聚丙烯酰胺膜放置在一抗液中，进行一抗处理。
一抗的选择根据目标蛋白质的特异性来确定。
7. 洗涤将转膜的聚丙烯酰胺膜从一抗液中取出，进行洗涤。
洗涤的目的是去除非特异性结合的抗体。
8. 二抗处理将与目标蛋白质一抗结合的二抗加入到含有阻断液的培养皿中，将转膜的聚丙烯酰胺膜放置在二抗液中，进行二抗处理。
9. 洗涤将转膜的聚丙烯酰胺膜从二抗液中取出，再次进行洗涤，确保清洗干净。
10. 显色将合适的显色剂加入到含有阻断液的培养皿中，将转膜的聚丙烯酰胺膜放置在显色剂中，进行显色反应。
显色剂的选择根据实验需要和目标蛋白质的特性来确定。
11. 照相观察显色结果，并使用相机拍摄转膜的聚丙烯酰胺膜，记录实验结果。
三、结果与讨论根据实验步骤，我们成功地使用免疫印迹技术检测了A细胞和B细胞中目标蛋白质的表达情况。
Western blotting实验报告
Western BlottingLin Chengyu Bio 04 2010030007 Cooperator: Liu Yidi1Introduction1.1Background informationWestern blotting is the procedure that proteins separated by PAGE may be transferredfrom the gel to a thin support matrix, usually a nitrocellulose membrane, which stronglybinds and immobilizes proteins. The protein blots on the membrane surface are thenutilized for further analysis, often coupled with immunological detection techniques.This experiment takes human and horse IgG as the antigen. After treated by SDS-PAGE,transfer the proteins to the nitrocellulose membrane and take rabbit-anti-horse IgG as theprimary antibody, and enzyme-linked goat-anti-rabbit IgG as the secondary antibody.1.2Major principlesWestern blotting consists of two major steps, immobilization and immunoblotting.Immobilization mainly uses electric field force or gravity, as shown in Figure 1.Figure 1 ImmobilizationThe proteins, carrying negative charges, move against the electric field to the anode, thatis, from the gel to the nitrocellulose membrane.Immunoblotting uses immunological techniques, as shown in Figure 2.Figure 2 Immunoblotting1Blocking step is necessary which will block all the remaining hydrophobic binding siteson the nitrocellulose membrane. The primary antibody recognizes the specific proteinand is recognized by the enzyme-linked secondary antibody, so both of them bind totheir target. The enzyme linked to the secondary antibody catalysis the specific reactionwhich leads to light or color, which can be recognized as a band on the nitrocellulosemembrane.2Experiment operation2.1SDS-PAGE(1)Prepare an 8% SDS-PAGE gel;(2)Load the samples in the gel following Table 1;Table 1 The loading plan of SDS-PAGE(3)Galvanize the gel box to separate proteins;(4)Take the gel from gel box, then cut it into 2 separate gels between Lane 6 and 7;(5)Stain one gel with (Lane 1-6) with Comassiee Brilliant Blue overnight. Distain itlater to make the original copy to compare with the other gel which is for transfer.2.2Immobilization(1)Prepare 8 pieces of filter paper and one nitrocellulose membrane in the same size asthe gel and soak them in transfer buffer for 15 min;(2)Soak the SDS-PAGE gel in the transfer buffer;(3)Place the gel, filter papers, and nitrocellulose membrane following the order shownin Figure 1;(4)Transfer in constant-current electrophoresis (I = A / cm2 * 0.8 mA) for 1.5 h;(5)Soak the membrane in BSA solution for blocking non-specific protein-binding, 4 ºCovernight.2.3Immunoblotting(1)Wash the membrane with fresh PBST and keep in this environment;(2)Cover the membrane with primary antibody solution in a plastic bag and seal it;(3)Incubate for 2 h at R.T.;(4)Wash the membrane with fresh PBST, 5 min for each time, and repeat twice;(5)Cover the membrane with secondary antibody solution in a plastic bag and seal it;(6)Incubate for 1.5 h at R.T.;(7)Wash the membrane with fresh PBST, 5 min for each time, and repeat twice;(8)Develop the membrane in substrate solution;(9)Stop the developing step in ddH2O and dry the membrane in filter paper directly. 3Raw data and its processing3.1SDS-PAGEThe gel image is shown in Figure 3.Figure 3 SDS-PAGELane I: 10 μL human IgGLane II: 10 μL horse IgGLane III: 5 μL human IgGHuman IgG band is at approx. 100 kDa, while horse IgG smaller, at approx. 95 kDa.3.2ImmunoblottingThe membrane image is shown in Figure 4.Figure 4 ImmunoblottingLane I: 10 μL human IgGLane II: 10 μL horse IgGLane III: 5 μL human IgGAs can see in Figure 4, using rabbit-anti-horse IgG anti-serum as the primary antibody,Lane II, which contains 10 μL horse IgG, shows a clear and dark band. And there iscross binding between rabbit-anti-horse IgG anti-serum and human IgG, which isindicated by two bands shown in Lane I and Lane III. What’s more, the higher theconcentration (10 μL vs. 5 μL), the more cross binding are shown in the membrane.4Result and discussion4.1Result4.1.1The human IgG is about 100 kDa, and horse IgG 95 kDa.4.1.2The specific binding between horse IgG and rabbit-anti-horse IgG anti-serum isgood, while there is cross binding between human IgG and rabbit-anti-horseIgG anti-serum.4.2Discussion4.2.1Lane I in SDS-PAGEThe band in Lane I which corresponds with 10 μL human IgG is not parallel tothe slots. The most probable reasons are:(1)While loading, the samples stays too long time in the slot;(2)The surface of the concentrated gel is not flat in Lane I;(3)The surface of the separating gel is not flat due to unsuitable removal of thecomb.4.2.2Horse IgG band in immunoblottingThe band is not sharp enough, because there are lots of subtypes of horse IgG,causing a bad separate effect.4.2.3Lane II in immunoblottingAs can see in Figure 4, Lane II contains lots of regions that is also colored(background), it is mainly because during the washing step, especially washingthe primary antibody, we add too much PBST in the petri dish, causing littlewashing force, and lots of primary antibody remaining on the membranenon-specific binding to the proteins.5Reference【1】/biotech/exp/protein/westernblot/2009/e89175533.html。
蛋白质印迹法实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质印迹法的基本原理和操作步骤。
2. 学习如何利用蛋白质印迹法检测目标蛋白的表达水平。
3. 掌握蛋白质印迹法的实验操作技巧，为后续相关实验奠定基础。
二、实验原理蛋白质印迹法（Western Blot）是一种常用的蛋白质检测技术，通过特异性抗体与待测蛋白结合，实现对目标蛋白的高灵敏度和高特异性检测。
实验原理如下：1. 蛋白质提取：从组织、细胞或体液中提取总蛋白质，避免蛋白质的降解和失活。
2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：将提取的蛋白质进行SDS-PAGE，根据蛋白质分子量大小进行分离。
3. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶转移到固相载体（如硝酸纤维素膜或PVDF膜）上。
4. 免疫反应：用特异性抗体与转移至固相载体上的目标蛋白结合，然后与酶或同位素标记的第二抗体发生反应。
5. 显色或放射自显影：通过底物显色或放射自显影等手段，实现对目标蛋白的检测和定量。
三、实验材料1. 细胞株：大鼠原代脊髓星形胶质细胞2. 主要试剂：DMEM/F12培养基、胎牛血清、裂解液、PBS、NaCl、SDS、聚丙烯酰胺凝胶、硝酸纤维素膜、PVDF膜、特异性抗体、酶联第二抗体、底物、显影液等。
3. 仪器：玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、-20低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床等。
四、实验步骤1. 细胞培养：将大鼠原代脊髓星形胶质细胞在DMEM/F12培养基和胎牛血清的条件下培养，直至达到实验所需状态。
2. 蛋白质提取：用裂解液提取细胞总蛋白质，并进行蛋白质浓度测定。
3. SDS-PAGE：将提取的蛋白质进行SDS-PAGE，根据蛋白质分子量大小进行分离。
4. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜或PVDF膜上。
5. 免疫反应：将转膜后的膜与特异性抗体进行孵育，然后用酶联第二抗体进行孵育。
6. 显色：加入底物，观察目标蛋白条带的出现，并通过扫描成像系统进行定量分析。
免疫印迹实验报告
免疫印迹实验报告免疫印迹实验报告免疫印迹（Western blot）是一种常用的生物学实验技术，用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的表达水平，以及研究其功能和相互作用。
本实验旨在通过免疫印迹技术，探究细胞中特定蛋白质的表达情况，为进一步的研究提供基础数据。
实验材料与方法：材料：1. 细胞或组织样本2. 细胞裂解液3. 蛋白质电泳样品缓冲液4. 聚丙烯酰胺凝胶5. 转印膜6. 蛋白质标记物7. 抗体8. 酶联免疫检测试剂盒方法：1. 提取细胞或组织中的蛋白质，制备细胞裂解液。
2. 将蛋白质样品与电泳样品缓冲液混合，进行电泳分离。
3. 将分离后的蛋白质转移到转印膜上。
4. 在转印膜上进行阻断，以防止非特异性结合。
5. 添加特异性抗体，与目标蛋白质结合。
6. 使用酶联免疫检测试剂盒，检测抗体与蛋白质结合的信号。
7. 分析实验结果，得出结论。
实验结果与讨论：通过免疫印迹实验，我们成功检测到目标蛋白质在细胞或组织中的表达情况。
实验结果显示，在细胞裂解液中，目标蛋白质呈现出明显的条带，证明其在细胞中存在且可被提取。
进一步分析实验结果，我们可以得出以下结论：1. 目标蛋白质在不同组织中的表达水平存在差异。
通过比较不同组织样本中目标蛋白质的表达情况，我们发现其表达水平在不同组织中存在差异。
这可能与细胞功能的差异以及组织特异性基因的调控有关。
2. 目标蛋白质在细胞发育过程中的变化。
通过对细胞或组织样本在不同发育阶段进行免疫印迹实验，我们可以观察到目标蛋白质在细胞发育过程中的表达变化。
这些变化可能与细胞分化、增殖以及功能转变等过程密切相关。
3. 目标蛋白质与其他蛋白质的相互作用。
通过免疫印迹实验，我们可以进一步研究目标蛋白质与其他蛋白质的相互作用。
通过添加不同抗体，我们可以检测到目标蛋白质与其他蛋白质的结合情况，揭示其在细胞信号传导和调控网络中的功能。
总结：免疫印迹实验是一种非常有用的生物学实验技术，可以用于检测特定蛋白质的表达水平以及研究其功能和相互作用。
Western blotting检测(完美版)
3.6.2 Western blotting检测3.6.2.1 试剂配置及保存如下：1）制胶用（1）10％SDSSDS 10.0 g加蒸馏水至100 ml如溶解困难，可在50 °C水浴下溶解，室温保存。
（2）10％过硫酸胺（AP）过硫酸胺1 .0g蒸馏水10 ml配好后分装，-20 °C避光保存。
（3）0.5MTrisHcl（pH6.8），1.5MTrisHcl（pH8.8），30%丙稀酰胺及TEMED皆4 °C保存。
2）电泳与转膜缓冲液（1）5×电泳液缓冲液Tris（MW121.14）30.0 g甘氨酸（MW75.07）144.0 gSDS 10.0 g加蒸馏水至2000 ml , 溶解后室温保存,用时稀释5倍，通常取200 ml配制成1000ml即可。
（2）10×转膜缓冲液甘氨酸（MW75.07）144.0 gTris（MW121.14）30.3 gSDS 1.5g加蒸馏水至1000 ml , 溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至20%。
通常取200 ml母液，加1400 ml蒸馏水，最后加400ml甲醇，配制成2000 ml即可，注意先加甲醇易产生沉淀。
3）洗膜液（1）5×TBS缓冲液Tris（MW121.14）22.4 gNaCl 292.0 g加蒸馏水至2000 ml , 浓盐酸调pH至7.6，溶解后室温保存。
（2）1×TBST缓冲液5×TBS缓冲液200 ml蒸馏水800 mlTween-20 0.75 ml混匀后室温保存。
因Tween-20比较粘稠，应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块，即可防止产生气泡。
4）封闭液（1）封闭液（5%脱脂牛奶)：1×TBST缓冲液50 ml脱脂奶粉2.5 g溶解后4 °C保存，可于一周内使用。
3.6.2.2 SDS-PAGE蛋白电泳、转膜、免疫反应和化学发光法检测1）灌制蛋白质聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）：配制4%浓缩胶，根据蛋白大小配制7.5%，10%分离胶以及8%与16%的双层分离胶。
western-blot实验报告
一、实验目的1.掌握Western-blot实验原理及方法应用2.巩固SDS-PAGE电泳相关操作3.学习PVDF转膜以及ECL显影技术二、实验原理Western-blot，中文为蛋白免疫印迹，其原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
三、实验材料试剂：纯水、琼脂糖、TEMED、30%丙烯酰胺、pH8.8 Tris-HCl、pH6.8Tris-HCl、10%SDS、10%APS、转膜缓冲液、10×TBS、10×蛋白电泳缓冲液、TBST、脱色液、显色试剂A、B，显影液、定影液器材：台式离心机、玻璃板、微波炉、滤纸、PVDF膜、手套、转膜槽、海绵垫、玻璃棒、保鲜膜、胶片、摇床等。
四、实验步骤1、样品制备取相应组织，加入135 μl 无SDS的匀浆缓冲液，于冰浴中，匀浆器15 秒一次，匀两次，再加入15 μl 10%的SDS。
95°C水浴5分钟。
10000 g离心30分钟，取上清。
每管20 μl 分装。
组织与匀浆液的比例= 1:5-1:102、清洗玻璃板3、灌胶与上样(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶(操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶)。
(2)配12%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到离玻璃板3cm即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
(灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型)。
(3)当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。
再等20 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
(4)按前面方法配5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
免疫印迹 实验报告
免疫印迹实验报告免疫印迹实验报告免疫印迹（Western blot）是一种常用的蛋白质检测技术，广泛应用于生物医学研究领域。
本实验旨在通过免疫印迹技术检测目标蛋白的表达情况，并探究其在细胞信号转导中的作用。
实验材料和方法：材料：1. 细胞培养基和培养器具2. 细胞裂解液3. 蛋白质电泳胶和电泳仪4. 蛋白转印膜和转印仪5. 抗体：一抗和二抗6. ECL检测试剂盒方法：1. 培养细胞并进行处理，如添加特定药物或刺激剂。
2. 收集细胞并用细胞裂解液裂解蛋白。
3. 通过SDS-PAGE电泳将蛋白质分离。
4. 将分离的蛋白转移到蛋白转印膜上。
5. 进行膜上抗原的非特异性结合位点的阻断。
6. 使用一抗与目标蛋白特异性结合。
7. 清洗膜，并使用二抗与一抗结合。
8. 再次清洗膜，并使用ECL检测试剂盒进行显色。
9. 使用图像分析软件分析结果。
结果与讨论：通过免疫印迹实验，我们成功检测到目标蛋白的表达情况。
在实验中，我们选择了细胞中一个重要的信号转导蛋白作为目标蛋白，以探究其在细胞内的作用和调控机制。
首先，我们培养了细胞并进行了不同处理。
通过细胞裂解液裂解蛋白，我们成功地提取了目标蛋白。
接下来，我们使用SDS-PAGE电泳将蛋白质分离，并将其转移到蛋白转印膜上。
通过这一步骤，我们可以将蛋白在膜上固定，并便于后续的抗体结合。
在进行免疫印迹之前，我们需要对膜进行阻断，以防止非特异性结合。
通过使用牛血清白蛋白或非脂性奶粉等物质，我们可以有效地阻断膜上的非特异性结合位点。
在阻断后，我们使用一抗与目标蛋白特异性结合。
一抗的选择对于实验结果的准确性至关重要，因此我们在实验前进行了充分的文献调研和试验优化。
在与一抗结合后，我们进行了膜的清洗，以去除未结合的抗体。
接下来，我们使用二抗与一抗结合，并再次清洗膜。
二抗通常被标记有荧光素或酶，以便于后续的信号检测。
最后，我们使用ECL检测试剂盒进行显色。
ECL技术利用酶的催化作用产生荧光或发光信号，从而检测目标蛋白的表达情况。
完整word版,Western-Blotting实验报告
Western Blotting本次试验的目的是使同学们掌握Western Blotting法鉴定目标蛋白的原理和熟悉Western Blotting的方法，并了解抗原抗体结合反应的影响因素。
Western Blotting的blotting译为印迹法，是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。
而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。
Western既可以定性，又可以半定量，是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。
它通常分为两种方法：Western Blotting 方法一: 直接法方法二: 间接法优点： 1.快速（一种抗体）2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带1. 免特异性不受标记影响2. 信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点）3. 多种标记的二抗可供选择4. 可选择不同的Marker缺点： 1.免疫反应性降低2.无信号二级放大3.抗体标记费时昂贵,使用不方便1. 交叉反应引起的非特异性条带2. 额外的二抗孵育以及条件优化同时Western又具有多种识别蛋白质的显色方法，主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。
一、实验原理Western Blotting（蛋白质免疫印迹法）是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳奋力的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
蛋白印实验报告
最美的感动——母爱
导读:本文是关于话题作文最美的感动——母爱,感谢您的阅读.
世界上最美丽的感动是什么？有人说是亲情，有人说是友谊，有人说是爱情，他们说的都对，而我觉得最美丽的感动是那无私的母爱。
一丝银发让我感动
有一次感冒了，发着高烧。
妈妈见我病的严重，很着急，背起我就往医院跑，到了医院，妈妈把我抱到床上，安慰了我几句，也不休息一下就马上跑到医生那里，问我病的怎么样，要开最好的药。
来来回回，出出进进，一会儿给我端水送药，一会儿给我盖被子，擦擦汗，一刻也不停歇……第二天，我睁开眼睛，看见妈妈正趴在我身上小睡。
朦胧中我看见妈妈乌黑的秀发中，有了一丝银发，顿时，心中像打翻了五味瓶，不知是什么滋味，泪水如泉水般涌了出来。
一把倾斜的雨伞让我感动
有一次在秋季的某一天下了大雨，妈妈打了伞来学校接我，我渐渐地发现妈妈身上怎么这么湿啊？而我身上却干干的。
我悄悄地观察，原来是妈妈慢慢地把雨伞向我这边移，尽量不让我淋着，而自己却被雨浇着。
一阵哭声让我感动
“你不认真！让你不好好学习！”妈妈气得脸通红。
妈妈训完我之后，让我在自己的卧室里好好学习，自己去了她的卧室。
过了一会儿，我听到卧室内传来了哭声。
我躲在门后偷听，只听妈妈哭道：小梅啊，妈妈也心疼你啊，妈妈也不想这样骂你啊，妈妈也是恨铁不成钢啊……“听了妈妈的哭声，我的眼泪涌了出来。
妈妈，你的慈爱、关怀、严爱太伟大了，另我太感动了，那是最美丽的母爱。
我将永远记住这伟大的母爱。
来源与互联网，仅供个人阅读参考。
westernblot实验报告
westernblot实验报告西方印迹（Western Blot）是一种常用的蛋白质分析技术，广泛应用于生物医学研究领域。
本文将介绍Western Blot实验的原理、步骤以及其在科研中的应用。
一、实验原理Western Blot是一种通过将蛋白质分离、转移、固定和检测的技术。
首先，将待检测的蛋白质样品经过电泳分离，然后将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
接下来，将膜固定并与特定抗体反应，以检测目标蛋白质的存在和表达水平。
二、实验步骤1. 样品制备：将待检测的蛋白质样品加入蛋白负荷缓冲液，经过煮沸和离心处理，使样品变性并去除杂质。
2. 凝胶电泳：将样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，通电使蛋白质在凝胶中按照大小被分离。
3. 转印：将凝胶中的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上，通过电流使蛋白质迁移。
4. 固定膜：用甲醛等化学物质固定膜上的蛋白质，以保持其位置和结构。
5. 抗体反应：将特异性抗体加入到膜上，与目标蛋白质结合形成特异性免疫复合物。
6. 信号检测：通过添加酶标记的二抗或荧光标记的二抗，使免疫复合物发出可检测的信号。
7. 结果分析：使用成像设备或荧光显微镜观察和记录蛋白质的表达水平。
三、应用领域Western Blot技术在生物医学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，帮助科研人员了解蛋白质的功能和调控机制。
其次，Western Blot还可以用于检测特定蛋白质的修饰状态，如磷酸化、甲基化等，以研究这些修饰对蛋白质功能的影响。
此外，Western Blot还可以用于检测蛋白质的亚细胞定位，研究蛋白质在细胞中的分布情况。
Western Blot技术的优点在于其高灵敏度和特异性。
通过选择合适的抗体，可以实现对特定蛋白质的检测和定量。
此外，Western Blot还可以同时检测多个蛋白质，从而提高实验效率。
然而，Western Blot也存在一些局限性。
首先，由于其操作步骤较多，需要较长的实验时间。
免疫印迹实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除免疫印迹实验报告篇一：免疫印迹实验报告——westerblotwesternblot实验报告摘要：目的：学习并掌握westernblot分离蛋白及观察方法方法：westernblot结果：见后文结论：westernblot能很好地分离蛋白关键词：westernblot、分离、小鼠组织、蛋白westernblottestreportAbstract:objective:Learnandmasterthewesternblotprot einisolatedandobservationmethodmethods:westernblot ：,sds-pageandelectrictransferResults:seebelowKeywords:westernblot、separate、mousetissues、protein前言:免疫印迹又称western印迹(westernblotting)，与DnA的southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为nc膜)，然后用探针检测特异性组分。
不同的是，westernblotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。
该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。
目前，westernblotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。
免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。
蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。
wb实验_精品文档
wb实验WB实验导言：WB实验（Western Blotting）是一种广泛应用于生物医学研究中的实验技术，它通过将蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，再将被分离的蛋白质转移到聚乙烯膜或硝酸纤维素膜上，最后使用特定抗体对目标蛋白质进行检测。
本文将详细介绍WB实验的基本原理、步骤和应用。
一、基本原理1.1 蛋白质电泳分离在WB实验中，首先将待测蛋白质与断裂蛋白质加入SDS-PAGE （聚丙烯酰胺凝胶电泳）胶液中，然后通过电泳，根据蛋白质的分子量以及电荷特性，将蛋白质从胶液中分离出来。
当电流作用于聚丙烯酰胺凝胶时，蛋白质会根据其电荷和分子量的不同，在电场中迁移。
1.2 蛋白质转移接下来，将蛋白质从SDS-PAGE胶液中转移到固定在聚乙烯膜或硝酸纤维素膜上。
这一步骤通常使用电泳转移装置，通过电流将蛋白质从凝胶中转移到膜上。
此过程可以进一步将蛋白质进行定量或定性分析。
1.3 特定抗体检测转移完成后，利用特定抗体对目标蛋白质进行检测。
特异性抗体与目标蛋白质结合后，通过化学或光学方法可可视化目标蛋白质。
常见的可视化方法包括荧光染色、酶联免疫吸附试验（ELISA）和放射性探针等。
二、实验步骤2.1 样品制备样品的制备是WB实验的关键步骤之一。
需要将待测蛋白质从细胞或组织中提取出来，并进行蛋白质浓度的测定。
可以使用细胞裂解液来破坏细胞膜，释放蛋白质。
同时，可以使用加热和还原剂来使蛋白质在电泳过程中分离。
2.2 SDS-PAGE电泳分离将样品和标准蛋白质分别加载到预制的凝胶槽中。
开启电源，设定适当的电流和运行时间，进行电泳分离。
分离完成后，将凝胶放入转移装置中。
2.3 蛋白质转移将凝胶转移到聚乙烯膜或硝酸纤维素膜上。
同时提供足够的电流，并根据蛋白质大小和热力学性质设置适当的时间，以确保蛋白质可以完全转移到膜上。
2.4 特定抗体检测将蛋白质膜进行一定的前处理步骤，如预浸泡、阻断和洗涤。
然后，加入特定的一抗，与目标蛋白质结合。
western boltting乳蛋白表达变化检测实验报告
实验报告Western Blotting依然是目前分离和检测蛋白最常用到的一种技术方法，但是要将这种技术变成你的有利手段，并不容易。
因此优化实验操作手册至关重要，但是，正如Bio-Rad成像系统市场经理Ryan Short所说的，“大多数研究人员并不是Western blot技术专家——他们要解答的是更大的问题”，Ryan继续说道，“问题是大多数人都不知道何处需要优化。
坦率地说，Western blot检测过程耗时太长。
如果每个印迹实验都有花费你两天时间，那么还有多少时间确实能用于优化Western blot呢？”当然，类似抗体质量，封闭液和转印效率等因素也扮演了关键角色，让我们来仔细看看，现今还有哪些优化的技巧和工具。
加入合适数量的蛋白虽然步骤优化至关重要，但是传统的Western Blot整个过程本身过长确实也带来了困难。
Short相信一个成功的Western Blot实验操作指导中，最重要的因素之一就是确定每份凝胶中加入的蛋白量。
“这是非常重要的，因为大多数进行WB实验的研究人员都有一个兴趣蛋白，需要与内参（看家蛋白）比对”，Short说，“如果您的兴趣蛋白是一个低表达的蛋白，而你的内参蛋白是一种高表达的蛋白，那么在检测的动态范围内就必须有两种蛋白，以确保结果的可靠性。
因此可能需要加大低表达蛋白的数量，大概有50-60ug蛋白，但在这个量上内参蛋白信号可能会远远超出了线性检测范围了。
了解这些动力学对于Western blot获得好结果十分重要。
”有效的封闭：脱脂牛奶以外使用正确的封闭液将获得完全不同的一个结果。
虽然牛奶是经常被使用到的封闭液，但现如今这种封闭液也许不如高质量商业化的封闭液。
“封闭液应该结合到膜上不与相应抗体结合的区域”，Thermo Scientific公司Priya Rangaraj表示，“如果做不到这一点，你会看到斑点和增加的背景”。
目前Western市面上一些封闭液包括Thermo Scientific的StartingBlock Blocking Buffer，LI-COR Bioscience公司的Odyssey Blocking Buffer，以及来自Bio-Rad的PBS（含有1%酪蛋白封闭液）。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
最新文件---------------- 仅供参考--------------------已改成-----------word文本 --------------------- 方便更改赠人玫瑰，手留余香。
Western Blotting本次试验的目的是使同学们掌握Western Blotting法鉴定目标蛋白的原理和熟悉Western Blotting的方法，并了解抗原抗体结合反应的影响因素。
Western Blotting的blotting译为印迹法，是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。
而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。
Western既可以定性，又可以半定量，是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。
它通常分为两种方法：同时Western又具有多种识别蛋白质的显色方法，主要有以下几种：i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。
一、实验原理Western Blotting（蛋白质免疫印迹法）是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳奋力的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质为抗原，与之对应的第一抗体发生免疫结合反应，一抗再与酶或同位素标记的第二抗体发生免疫结合反应，经过底物显色活放射自显影以检查电泳分离的提议目的蛋白成分。
蛋白质印迹技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异性高、敏感等诸多优点，能从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测。
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)、N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)和催化剂(AP)、加速剂(TEMED聚合成的三维网孔结构(凝胶）。
据有无浓缩效应可将电泳分为两类：i.连续系统：缓冲液pH值、凝胶浓度相同，带电粒子靠电荷及分子筛效应区分。
ii.不连续系统：缓冲离子成分、pH值、凝胶浓度不同，带电粒子在电场中由电效应、分子筛效应、浓缩效应区分。
SDS-PAGE的原理是：依靠SDS带有大量负电荷来掩盖蛋白质表面的净电荷：同时由于在电泳溶液中加入了SDS和巯基乙醇，因此它还可以改变蛋白质构象：在实验中要注意：印迹法需要较好的蛋白质凝胶电泳技术，是蛋白质样品达到良好的分离效果，而且要注意胶的质量，是蛋白质容易转移带固相支持物上，另外蛋白质在电泳过程中分离得到的条带被保留在膜上，在随后的宝物阶段不丢失和扩散。
免疫印迹分析之需要很小体积的时间，较短的时间过长，操作容易，适用于理论和应用上的研究。
本实验采用人血清为材料，人类Ig根据其重链稳定区的分子结构和抗原特异性的不同，分为五类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。
其中IgG占血清免疫球蛋白总量的75%～80%。
人的IgG由两条重链和两条轻链组成，它们之间以二硫键相连。
在加SDS的电泳条件下，分子中的二硫键被还原成游离的巯基，四条链分开，重链迁移速度较慢，轻链迁移速度较快，可跑出两条带。
对此样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后，用电转移法将蛋白质转印到硝酸纤维素薄膜上，用兔抗人IgG为第一抗体，用辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG为第二抗体，在过氧化物酶第五存在的情况下，检测人的IgG。
二、试剂，器材和实验材料【试剂】1.30％丙烯酰胺贮备液：29.2g 丙烯酰胺，0.8g 甲叉双丙烯酰胺，加重蒸水至100ml。
2.浓缩胶缓冲液：0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8。
3.分离胶缓冲液：3mol/L Tris-HCl，pH8.9。
4.10％过硫酸铵(w/v)：临用前用蒸馏水配制。
5.10％SDS(w/v)。
6.10％TEMED。
7.电极缓冲液：甘氨酸11.28g, SDS 0.4g, Tris 2.4g, 加水至800ml，pH8.3。
8.样品缓冲液：0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，pH6.8，20％甘油，4％SDS，10％巯基乙醇，0.005％溴酚兰。
9.考马斯亮蓝R250染色液：考马斯亮蓝R250 0.25g，30%乙醇，10%冰乙酸。
10.脱色液：乙醇6ml，冰乙酸2ml，加水至20ml。
11.TBS（Tris-HCl,NaCl）缓冲液：20mmol/L Tris-HCl,12.500mmol/L NaCl，pH7.5，每组配150ml。
13.TTBS：取100mlTBS，加250μl 20％Tween-20。
14.封闭液及抗体稀释液：3％脱脂奶粉-TBS，每组配10ml。
15.底物溶液：2.5mg二氨基联苯胺（DAB）+ 10mlTBS +10μl H2O2，临用前配制。
16.考马斯亮蓝R250染色液：考马斯亮蓝R250 0.25g，30%乙醇，10%冰乙酸，总体积500ml。
17.脱色液：乙醇6ml，冰乙酸2ml，加水至20ml。
【器材】1.夹心式电泳槽2.转移电泳槽3.电泳仪【实验材料】1.人血清2.硝酸纤维素膜三、实验步骤ⅠSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳1.灌胶前的准备：将两块玻璃板洗净晾干或用吹风机吹干，嵌入本体的凹槽中，长玻板朝外，短玻板朝内，两块玻璃板之间就形成了凝胶室。
合上滑块，拧螺栓锁紧凝胶室，检查凝胶室底部是否与本体底端重合。
然后将以上组合放入制胶架，插入并旋转凸轮，即可灌胶。
2.配制胶液3.灌胶：将配制好的分离胶液倒入两块玻璃板之间的凝胶室中，待胶液加至距短玻璃板顶端约1.5cm处时停止灌胶，然后在胶液表面上小心加入厚约0.5cm的水层，以保持分离胶面平整，同时隔绝空气，空气中的氧对凝胶的聚合有阻碍作用。
待凝胶和水之间出现清晰界面时，说明分离胶已聚合，大约30min完成聚合。
倾去分离胶上层的水，将配制好的浓缩胶液加到分离胶上，至接近短玻璃板的顶端，插上样品梳，放置待其聚合。
4.配制电极缓冲液：甘氨酸14.1g，SDS 0.5g，Tris 3g，加水至1000ml，pH8.3。
每组配1000ml。
5.制样：5μl人血清，加45μl水，再加50μl加样缓冲液。
沸水浴加热8分钟，10000rpm离心2分钟,取上清液作为样品。
另按说明书制备好蛋白质分子量标准样品。
6.加样：1、加入电极缓冲液；a) 拔出样品梳；b）选3个样品槽，用微量进样器加样，中间槽加入5μl分子量标准蛋白样品，两旁槽各加入10μl人血清样品。
稳压120V电泳，当溴酚蓝前沿到达距底部0.5cm左右时，停止电泳。
7.切胶：根据切割线，先竖切后横切，宽胶条为两泳道，含人血清样和分子量标准蛋白样，考马斯亮蓝R-250全蛋白染色。
窄胶条为一泳道，为人血清样，转印后对目标蛋白免疫染色。
8.胶条保存：将两个胶条用保鲜袋包好，贴上标有自己名字的标签-20℃冻存。
Ⅱ转印蛋白质到硝酸纤维素膜上1.将带有人血清和标准蛋白的宽胶带用考马斯亮蓝R250染色、脱色：将宽胶条放到培养皿中，用蒸馏水清洗后，加入约10ml考马斯亮蓝R-250染色液染色1小时左右，然后换成脱色液脱色，不时摇动。
更换几次脱色液，至背景无色透明，条带清晰为止。
2.放置NC膜和胶条：a)⑴.切割与胶尺寸相符的硝酸纤维素膜，用转移缓冲液或水浸泡5min使之湿润。
b)⑵.准备2张滤纸和海绵一起浸泡在转移缓冲液中。
c)⑶打开转移转移槽的胶板，依次放入：a.一张浸湿的海绵b. 一张浸湿的滤纸c. 用转移缓冲液冲洗过的胶，并小心地赶走滤纸和胶之间的气泡d. 硝酸纤维素膜，在膜的右下角剪一小角，以标明电泳方向e. 一张浸湿的滤纸f. 一张浸湿的海绵。
3.转移：小心地合上胶板，按胶侧为负极，膜侧为正极的方向放入转移电泳槽中，加转移缓冲液至满。
插好转移电泳装置的电极，打开电泳仪开关调至稳压60V，电泳1h，转移结束后打开胶板取出硝酸纤维素薄膜。
Ⅲ膜的酶联免疫染色1.封闭：用TBS缓冲液洗膜1min后，将膜封入塑料薄膜袋内，留一开口。
加封闭液1ml后封闭开口，37℃摇床上摇动30min。
2.加封闭液及抗体a)与第一抗体结合(1)弃封闭液，加入适当稀释的1ml第一抗体溶液(兔抗人IgG)，封口后37℃摇床上轻轻摇动50min。
(2)取出膜，用TTBS洗膜3次，每次1min。
再封入一新的塑料薄膜袋内。
b)与酶标第二抗体结合(3)加入适当稀释的1ml辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，37℃摇床上轻轻摇动50min。
(4)取出膜，用TTBS洗3次，每次1min，最后用TBS溶液洗1次，以去除Tween-20。
加底物溶液显色将膜浸入10ml底物溶液中，至显色清楚后，用水清洗，以除去多余的底物。
转入水中保存。
3.结果分析：在凝胶成像分析系统上照相，并分析结果。
测量分子量标准蛋白的迁移距离，作出标准曲线，再测出硝酸纤维素膜上的人IgG带的迁移距离，在标准曲线上查出人IgG重链的分子量。
实验结果：做标准蛋白曲线的的凝胶的总长为7.53cm带有人血清IgG的硝酸纤维素膜的总长为7.24cm由公式y = -1.1451x + 2.0366知：当x（重链相对迁移率）=0.33时，y=1.6587 得IgG重链相当分子量为：45.57KDa当x（轻链相对迁移率）=0.56时，y=1.3953 得IgG轻链相当分子量为：24.85KDa讨论：一、实验注意事项：四、.丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺有神经毒性，注意不要沾在皮肤上，如有沾染可用水洗净。
聚合成聚丙烯酰胺后毒性即消失。
五、电泳槽只能用水冲洗，不能用刷子刷，以免刷断铂电极丝；注意保护玻璃板。
六、一抗的选择是影响免疫印迹成败的主要因素。
多克隆抗体结合抗原能力较强、灵敏度高，但易产生非特异性的背景；单克隆抗体识别抗原特异性较好，但可能不识别在样品制备时因变性而失去了空间构型的抗原表位，且易发生交叉反应。
因此，兼有多克隆抗体和单克隆抗体优点的混合单克隆抗体近年特别被推荐，它是由一组能与抗原分子中的不同且不易变性的抗原表位结合并不易出现交叉反应的单克隆抗体混合构成。
七、.如果反应灵敏度不高，可增加凝胶的厚度到1.5mm（厚度超过2.0mm 时，凝胶转移效率受限）；也可在电泳条带不发生变形的前提下，尽量提高蛋白样品的上样量。
八、滤纸/凝胶/转印膜/滤纸夹层组合中不能存在气泡，可用玻璃棒在夹层组合上滚动将气泡赶出，以提高转膜效率；上下两层滤纸不能过大，避免导致直接接触而引起短路。