实训六 细菌的分离、移植及培养

实训六细菌的分离、移植及培养性状的观察

目的要求能利用不同的被检材料进行细菌的分离培养，观察细菌的培养特性，并会进一步移植培养。

仪器及材料温箱、病料、实验用菌种、营养琼脂培养基、肉渣汤(疱肉)培养基、接种环、酒精灯、烙刀、镊子、剪子等。

方法与步骤

(一)细菌的分离培养

1．平板划线分离法（视频四）平板划线是通过将被检材料连续划线而获得单个菌落，因而划线愈长，获得单个菌落的机会也愈多。具体操作步骤如下：

(1)右手持接种环于酒精灯上烧灼灭菌，待冷。

(2)无菌操作取病料若为液体病料，可直接用灭菌的接种环取病料一环；若为固体病料，首先将烙刀在酒精灯上灭菌，并立即用其将病料表面烧烙灭菌，然后用灭菌接种环从烧烙部位插入组织中缓缓转动接种环，取少量组织或液体。

(3)左手持平皿，用拇指、食指及中指将皿盖打开一侧(角度大小以能顺利划线为宜，但以角度小为佳，以免空气中细菌污染培养基)。

(4)将已取被检材料的接种环伸入平皿，并涂于培养基一侧，然后自涂抹处成30～40°角，以腕力在平板表面轻轻地分区划线。

在细菌病诊断或药敏试验时，为了提高效率，常可将皿盖放于酒精灯附近，左手持培养基，使划线的平面与右侧台面的角度小于90°且在酒精灯附近，右手持接种环取病料连续划线。

(5)划线完毕，烧灼接种环，将培养皿盖好，用记号笔在培养皿底部注明被检材料及日期，倒置37℃温箱中，培养18～24h观察结果(实图6-1)。凡是分离菌应在划线上生长，否则为污染菌。

2．倾注分离法取3支融化后冷至50℃左右的琼脂管，用灭菌的接种环取一环培养物(或被检材料)移至第一管中，随即用掌心搓转均匀，再由第一管取一环至第二管，搓转均匀后，再由第二管取一环至第三管经同样处理后，分别倒入三个灭菌培养皿中，待凝固后，倒置于37℃温箱中培养24h观察结果。(实图6-2)

(二)厌氧菌的分离培养厌氧菌的分离培养常用肉渣汤(疱肉培养基)培养法。先将试管倾斜，使培养基表面露出一点，然后接种被检材料或菌种，接种后将试管直立，即封闭液面。最后置37℃温箱中培养24～48h。

(三)细菌移植

1．斜面移植(实图6-3)

(1)左手持菌种管及琼脂斜面管，一般菌种管放在外侧，斜面管放在内侧，两管口并齐，管身略倾斜，斜面向上，管口靠近火焰。

(2)右手拇指、食指及中指持接种环在酒精灯上烧灼灭菌。

(3)将斜面管的棉塞夹在右手掌心与小指之间，菌种管棉塞夹在小指与无名指之间，将二棉塞一起拔出。

(4)把灭菌接种环伸入菌种管内，挑取少量菌苔将其立即伸入斜面培养基底部，由下而上在斜面上弯曲划线，然后管口和棉塞通过火焰后塞好，接种环烧灼灭菌。

(5)在斜面管口，写明菌种名，日期，置37℃温箱内，培养18～24h，观察生长情况。

2．肉汤移植方法同上，取少许菌落，迅速伸入肉汤管内，在接近液面的管壁轻轻研磨，并蘸取少许肉汤调和，使菌混和于肉汤中。

3．从平板移植到斜面无菌操作打开平皿盖，挑取少许菌落移于斜面管，方法同上。

4．半固体培养基穿刺接种法方法基本同斜面移植，但用接种针挑取菌落，由培养基表面中心垂直刺入管底，然后由原线退出接种针。

(四)细菌在培养基中生长特性的观察（实图6-4、6-5、6-6、6-7、6-8、6-9、6-10） 1．琼脂平板培养基主要观察细菌在培养基上形成的菌落的特征。

(1)大小以直径(mm)表示，小菌落如针尖大，大菌落为5～6mm，甚至更大。

(2)形状有圆形、不规则形、针尖状、露滴状、同心圆形、根足形等。

(3)边缘有整齐、波浪状、锯齿状、卷发状等。

(4)表面形状光滑、粗糙、同心圆状、放射状、皱状、颗粒状等。

(5)湿润度湿润、干燥。

(6)隆起度表面隆起、轻度隆起、中央隆起、脐状、扣状、扁平状。

(7)色泽和透明度色泽有无色、白、黄、橙、红等；透明度有透明、半透明、不透明等。

(8)质地分坚硬、柔软或黏稠等。

(9)溶血性菌落周围有无溶血环。有透明的溶血环称β型溶血；呈很小的半透明绿色的溶血环称α型溶血；不溶血的为γ型溶血。

2．肉汤培养基：

(1)浑浊度有高度浑浊、轻微浑浊或仍保持透明者。

(2)沉淀管底有无沉淀，沉淀物是颗粒状或棉絮状等。

(3)表面液面有无菌膜，管壁有无菌环。

(4)色泽液体是否变色，如绿色、红色等。

3．半固体培养基具有鞭毛的细菌，沿穿刺线向周围扩散生长，无鞭毛的细菌沿穿刺线呈线状生长。