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核酸的分离纯化技术
核酸的分离纯化技术从细胞中提取核酸后，仍混杂着蛋白质、多糖和各种大小分子核酸同类物。
除去这些“杂质”的过程，也就是核酸提纯过程。
在核酸的分离纯化时，为防止核酸大分子的变性降解，必须在0～4℃的低温条件下操作。
核酸酶的水解作用，是过去制备具有活性核酸大分子的严重障碍，现普遍采用加入去污剂或加入EDTA、8-羟基喹啉、柠檬酸钠以除去核酸酶的激活剂Mg2+，就可以抑制核酸酶的活性，保证在提纯过程中核酸大分子的完整。
关于核酸分离纯化阶段中除去多糖、蛋白质及不同类型核酸之间分离的一些方法，分别介绍如下：（1）肝糖元、淀粉及粘多糖，由于其物理化学性质与核酸有许多相似之处，常在提取液中残存下来。
除去的方法常有：①取材前尽量减少组织中多糖的含量，如先使动物饥饿数天然后杀死，可使细胞内肝糖元大大减少。
②加入淀粉酶，将大分子多糖分解为小分子，在以后纯化步骤中逐渐被除去。
③在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下层水相，核酸在上面有机层中。
④以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之与多糖分离。
（2）蛋白质的除去：由于核酸在细胞内以核蛋白体形式存在，不论采用哪种方法提取核酸，蛋白质都不同程度地存在于体系中。
因此，除去蛋白质是核酸分离纯化不可避免的步骤。
常用方法有下列几种：①加入去污剂如硫酸十二脂钠，从提取到分离纯化各阶段均可反复使用此法。
去污剂与氯仿法或苯酚法结合使用，效果更加理想。
②氯仿-戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提，蛋白质在氯仿-水界面形成凝胶，离心后除去，核酸留在水溶液中。
此法在分离纯化中也常反复使用。
③苯酚水溶液抽提，在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，DNA或RNA都可以进入水相，蛋白质则沉淀于酚层，然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA 或DNA，残余的酚可用葡聚糖凝胶G-10或G-25除去。
（3）不同类型核酸的分离：两种类型核酸的制备过程中，DNA制品中混杂着少量RNA或RNA制品中混杂着少量DNA是经常发生的。
核酸的分离纯化(1)
Kanamycin resistance gene
Stanley Cohen & Annie Chan
Plasmi d
pSC10 1
Tetracycline resistance gene
E. coli transformed with recombinant plasmid
Transformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracycline
（五）核酸的保存
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21
前言
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
无论是进行核酸结构还是功能研究，首先 需要对核酸进行分离和纯化。
核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
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22
一、核酸分离、纯化原整版课件ppt
10
一把特殊的剪刀 —限制性内切酶的发现
阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)， 获1978年诺贝尔生理学和医学奖
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11
Herbert Boyer, Stanley Cohen 1972年获得第一 个重组DNA分子 (实现不同来源 DNA的重组)
1 意义
遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸 的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其 他生物大分子结合的方式。
2 分离核酸原则：
1）温度不要过高；
2）控制一定的pH值范围(pH值5-9);
3）保持一定的离子强度;
4）减少物理因素对核酸降解的机械剪切力.
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23
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（二）防止核酸的生物降解
核酸的分离纯化优秀课件
前言
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
无论是进行核酸结构还是功能研究，首先 需要对核酸进行分离和纯化。
核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
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核酸的分离纯化优秀课件
一、核酸分离、纯化原则
（一）保持核酸分子一级结构的完整性
1 意义
遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸 的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其 他生物大分子结合的方式。
核酸的分离纯化优秀课件
General process of gene engineering
1. 从生物有机体基因组中， 分离出带有目的基因的DNA片 段。
2. 将带有目的基因的外源DNA片段连 接到能够自我复制的并具有选择记号 的载体分子上，形成重组DNA分子。
3. 将重组DNA分子转移到适当的受体 细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增 殖。 4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出 获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛 核酸的分离纯选化出优秀已课件经得到扩增的目的基因。
1952年Hershey和Chase证实噬菌体DNA 侵染细菌实验
核酸的分离纯化优秀课件
2. 50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交 替问题；
Rosalind Franklin拍出 了第一张 能反映DNA美丽双螺旋结构的X
射线照片
X-ray source
（3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-
Ribonucleoside Complex, VRC)
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核酸的分离纯化优秀课件
核酸分离纯化
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2.4.2 溴乙锭荧光法测定核酸的含量
原理：DNA.RNA在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，DNA.RNA样品在紫外光激发 下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度DNA 溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液浓度。
注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。
一般强调, 核酸沉淀在低温长时间下进行。 低温长时间沉淀, 易导致盐与DNA共沉淀, 影响以后的实验。一般使用0℃冰水, 1015min, DNA样品足可达到实验要求。
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2.4 核酸的浓度测定
2.4.1 紫外分光光度法测DNA和RNA的含量 前提: 核酸样品要较纯，无显著蛋白质、 酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应 大于0.25 μg/ml 。 结论: 在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸 光度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链 DNA为37 μg/ml；RNA为40 ug/ml。
PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10 mmol/L 的MgCl2。
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（4）精胺
精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀 DNA。 原理是:
精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝 缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质 杂质与DNA分开，达到纯化DNA的目的。
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2.3.3 核酸沉淀的温度和时间
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2.3 核酸的沉淀
• 重新调整核酸的浓度, 起到浓缩核酸的作用； • 去除溶液中某些盐离子与杂质； • 改变核酸的溶解缓冲液。
DNA纯化柱
核酸提取（离心柱型） 利用硅胶膜特异吸附核酸
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2.3.1 核酸沉淀的盐类及浓度
当核酸溶液的pH值大于4时, 核酸分子呈多聚阴离子 状态, 它与1价或2价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中 不溶解, 也不会被有机溶剂变性。
2.4.2 溴乙锭荧光法测定核酸的含量
原理：DNA.RNA在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，DNA.RNA样品在紫外光激发 下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度DNA 溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液浓度。
注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。
一般强调, 核酸沉淀在低温长时间下进行。 低温长时间沉淀, 易导致盐与DNA共沉淀, 影响以后的实验。一般使用0℃冰水, 1015min, DNA样品足可达到实验要求。
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2.4 核酸的浓度测定
2.4.1 紫外分光光度法测DNA和RNA的含量 前提: 核酸样品要较纯，无显著蛋白质、 酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应 大于0.25 μg/ml 。 结论: 在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸 光度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链 DNA为37 μg/ml；RNA为40 ug/ml。
PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10 mmol/L 的MgCl2。
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（4）精胺
精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀 DNA。 原理是:
精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝 缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质 杂质与DNA分开，达到纯化DNA的目的。
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2.3.3 核酸沉淀的温度和时间
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2.3 核酸的沉淀
• 重新调整核酸的浓度, 起到浓缩核酸的作用； • 去除溶液中某些盐离子与杂质； • 改变核酸的溶解缓冲液。
DNA纯化柱
核酸提取（离心柱型） 利用硅胶膜特异吸附核酸
返回
2.3.1 核酸沉淀的盐类及浓度
当核酸溶液的pH值大于4时, 核酸分子呈多聚阴离子 状态, 它与1价或2价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中 不溶解, 也不会被有机溶剂变性。
核酸的分离纯化
（2）异丙醇 ）
优点： 优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的 DNA样品沉淀 一般不需低温长时间放置。 样品沉淀。 DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点： 缺点： 易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀． DNA共沉淀 易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥 发除去。所以，最后用70 乙醇漂洗数次。 70％ 发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
(2) DEPC(二乙基焦碳酸盐 (C2H5OCOOCOOC2H5) 二乙基焦碳酸盐) 二乙基焦碳酸盐
粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。 粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。
作用机制：与蛋白质中 结合使蛋白变性 结合使蛋白变性。 作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。 使用注意： 使用注意： 1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。 ） 也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。 但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。 ～ 2）容易降解，保存在4 ℃或液氮中； ）容易降解，保存在 或液氮中； 3）提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿 ℃ 2 h。 ） 浸泡器皿37℃ 时 浸泡器皿 。 4）剧毒。 ）
1.1.2 分离核酸原则： 分离核酸原则：
1）温度不要过高； 温度不要过高； 不要过高 控制pH 范围(pH pH值 (pH值 2）控制pH值范围(pH值5-9); 保持一定离子强度 离子强度; 3）保持一定离子强度; 减少物理因素对核酸的机械剪切力 机械剪切力. 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
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2.2
核蛋白的解聚、 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除
核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电 吸力(核酸与碱性蛋白的结合) 吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非 极性的范德华力。 极性的范德华力。 分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合 分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合 最困难 的蛋白质分开，同时避免核酸降解。 的蛋白质分开，同时避免核酸降解。
核酸分离纯化版
性； ❖ 根据电泳条带的数目、位置和形状判定,RNA分子可以
通过荧光强度强弱来判定有无降解 ❖ 基因组DNA如果发生降解,电泳图呈拖尾状
5 核酸的鉴定与保存
DNA的降解
5 核酸的鉴定与保存
③ 完整性鉴定
完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中,原核生 物5S、16S、23S3条带；真核生物：5S和5.8S、18S、 28S3条带；而且3条带荧光强度应呈特定的比值 ❖ 沉降系数大,电泳迁移率低,荧光强度高 ❖ 沉降系数小,电泳迁移率高,荧光强度低
核酸的分离纯化技术
概述
✓ 核酸 nucleic acid 是遗传信息的携带者,是基因表达 的物质基础
✓ 无论是进行核酸结构还是功能研究,首先需要对核 酸进行分离和纯化
✓ 核酸样品质量将直接关系到实验的成败
1、核酸分离、纯化原则
1 保持核酸分子1级结构的完整性 1.意义：遗传信息全部储存在1级结构之中,核酸的—
➢TE的pH为8.0时,DNA的脱氨反应减少,pH低7.0时DNA 易变性
➢长期保存样品中可加入1滴氯仿
5 核酸的鉴定与保存
2. 核酸的保存——RNA的保存
➢RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc pH5.2 或双蒸灭菌 水中,-70℃保存 ➢长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; ➢在RNA溶液中,加1滴0.2 mol/L VRC 氧钒核糖核苷 复合物 冻贮于-70℃,可保存数年
➢ 注意：此法的比较主要基于目测,是估计水平
EB与DNA的结合
5 核酸的鉴定与保存
②纯度鉴定
紫外分光光度法： 主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的
污染 比值升高或降低均提示制备的核酸纯度不佳
5 核酸的鉴定与保存
通过荧光强度强弱来判定有无降解 ❖ 基因组DNA如果发生降解,电泳图呈拖尾状
5 核酸的鉴定与保存
DNA的降解
5 核酸的鉴定与保存
③ 完整性鉴定
完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中,原核生 物5S、16S、23S3条带；真核生物：5S和5.8S、18S、 28S3条带；而且3条带荧光强度应呈特定的比值 ❖ 沉降系数大,电泳迁移率低,荧光强度高 ❖ 沉降系数小,电泳迁移率高,荧光强度低
核酸的分离纯化技术
概述
✓ 核酸 nucleic acid 是遗传信息的携带者,是基因表达 的物质基础
✓ 无论是进行核酸结构还是功能研究,首先需要对核 酸进行分离和纯化
✓ 核酸样品质量将直接关系到实验的成败
1、核酸分离、纯化原则
1 保持核酸分子1级结构的完整性 1.意义：遗传信息全部储存在1级结构之中,核酸的—
➢TE的pH为8.0时,DNA的脱氨反应减少,pH低7.0时DNA 易变性
➢长期保存样品中可加入1滴氯仿
5 核酸的鉴定与保存
2. 核酸的保存——RNA的保存
➢RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc pH5.2 或双蒸灭菌 水中,-70℃保存 ➢长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; ➢在RNA溶液中,加1滴0.2 mol/L VRC 氧钒核糖核苷 复合物 冻贮于-70℃,可保存数年
➢ 注意：此法的比较主要基于目测,是估计水平
EB与DNA的结合
5 核酸的鉴定与保存
②纯度鉴定
紫外分光光度法： 主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的
污染 比值升高或降低均提示制备的核酸纯度不佳
5 核酸的鉴定与保存
核酸的分离与纯化ppt课件
核酸提取方法——分离与纯化
——盐析法
产量较低，但方法简单，比较酚氯仿方法无化学危害；
同样不适合大规模自动化提取。
提取好的DNA用蛋白酶处理纯度会提高。
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
核酸提取方法——分离与纯化
每一步骤又可由多种不同的方法单独或 联合实现。
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
核酸提取方法——细胞裂解
细胞裂解可通过以下几种方法实现：
物理作用 化学作用 酶作用 （生物作用）
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
碱性pH环境：强碱(NaOH) 或碱性缓冲液 ( TE、
STE 等)
在一定的p H 环境下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋 白质和多糖沉淀,核酸释放到水相；某些缓冲液中的一些金属离 子螯合剂( EDTA 等) 可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子 Mg2+ 、Ca2+ ,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。
核酸提取方法——分离与纯化
——硅胶吸附法
产量较低，纯度很好； 也能造成大片段核酸的损伤； 对极小片段核酸提取不够好； 简单方便，可进行自动化处理。
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
核酸提取方法——分离与纯化
——硅胶吸附法
1、细胞裂解和酶处理同前述；
——盐析法
产量较低，但方法简单，比较酚氯仿方法无化学危害；
同样不适合大规模自动化提取。
提取好的DNA用蛋白酶处理纯度会提高。
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核酸提取方法——分离与纯化
每一步骤又可由多种不同的方法单独或 联合实现。
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核酸提取方法——细胞裂解
细胞裂解可通过以下几种方法实现：
物理作用 化学作用 酶作用 （生物作用）
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碱性pH环境：强碱(NaOH) 或碱性缓冲液 ( TE、
STE 等)
在一定的p H 环境下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋 白质和多糖沉淀,核酸释放到水相；某些缓冲液中的一些金属离 子螯合剂( EDTA 等) 可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子 Mg2+ 、Ca2+ ,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。
核酸提取方法——分离与纯化
——硅胶吸附法
产量较低，纯度很好； 也能造成大片段核酸的损伤； 对极小片段核酸提取不够好； 简单方便，可进行自动化处理。
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核酸提取方法——分离与纯化
——硅胶吸附法
1、细胞裂解和酶处理同前述；
最新核酸分离纯化
核酸分离纯化
主要内容
前言 1 核酸分离、纯化原则
1.1 保持核酸分子一级结构的完整性 1.2. 防止核酸的生物降解
2 分离提取核酸的主要步骤
2.1 细胞的破碎 2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 2.3 核酸的沉淀 2.4 核酸的浓度测定 2.5 核酸的保存
（3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-
DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点：
易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥 发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
（3）聚乙二醇（PEG）
优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量
的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行 DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意：
一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。 低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀， 影响以后的实验。一般使用0℃冰水，1015min， DNA样品足可达到实验要求。
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2.4 核酸的浓度测定
2.4.1 紫外分光光度法测DNA和RNA的含量
前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、 琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 μg/ml 。 结论：在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度 相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37 μg/ml；RNA为40 ug/ml。
2.4.2 溴乙锭荧光法测定核酸的含 量
原理：DNA、RNA在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基 平面之间后，DNA、RNA样品在紫外光激发下，可 发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使 用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照， 可比较出被测DNA溶液浓度。 注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。
主要内容
前言 1 核酸分离、纯化原则
1.1 保持核酸分子一级结构的完整性 1.2. 防止核酸的生物降解
2 分离提取核酸的主要步骤
2.1 细胞的破碎 2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 2.3 核酸的沉淀 2.4 核酸的浓度测定 2.5 核酸的保存
（3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-
DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点：
易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥 发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
（3）聚乙二醇（PEG）
优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量
的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行 DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意：
一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。 低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀， 影响以后的实验。一般使用0℃冰水，1015min， DNA样品足可达到实验要求。
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2.4 核酸的浓度测定
2.4.1 紫外分光光度法测DNA和RNA的含量
前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、 琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 μg/ml 。 结论：在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度 相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37 μg/ml；RNA为40 ug/ml。
2.4.2 溴乙锭荧光法测定核酸的含 量
原理：DNA、RNA在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基 平面之间后，DNA、RNA样品在紫外光激发下，可 发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使 用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照， 可比较出被测DNA溶液浓度。 注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。
核酸的分离纯化PPT课件
三、核酸的鉴定与保存
2、纯度鉴定 ⑴ 紫 外 分 光 光 度 法 ： 该 法 主 要 通 过 A260 与 A280
的比值来判定有无蛋白质的污染，比值升 高与
降低均提示不纯。 在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280
纯RN第A25的页/共A12562页0/A280比值为
三、核酸的鉴定与保存
1. DNA或RNA的定量 OD260相当于 50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA（或RNA） 20μg/ml寡核苷酸
三、核酸的鉴定与保存
• 完整或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带 荧光强度积分应呈特定的比值，沉降系数大的 核酸区带，电泳迁移低，荧光强度积分高；反 之，分子量小，电泳迁移率高，荧光强度积分 低。
第32页/共152页
三、核酸的鉴定与保存
• 一般而言，28S（23S）RNA的荧光强度约为 18S（16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降 解。若 在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA 的污染。
75%的乙醇洗涤去除
第18页/共152页
三、核酸的鉴定与保存
（一）核酸的鉴定 （二）核酸的保存
第19页/共152页
三、核酸的鉴定与保存
（一）核酸的鉴定 1、浓度鉴定 2、纯度鉴定 3、完整性鉴定
第20页/共152页
三、核酸的鉴定与保存
1、浓度鉴定 ⑴ 紫外分光光度法：该法是基于核酸分子 中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸 收 紫外线，其最大吸收波长为260nm。
第2页/共152页
第五章 核酸的分离纯化
核酸分离纯化的原则 一、 保持核酸一级结构的完整性 二 、尽可能提高核酸制品的纯度
第3页/共152页
提取DNA总的原则
核酸的分离纯化和鉴定
但对5SRNA、tRNA及多糖不产生沉淀。一般不需在低温条件下长时 间放置。其缺点是易使盐类与DNA共沉淀；在DNA沉淀中的异丙醇 难以挥发除去，所以常规需要70%乙醇漂洗DNA沉淀物。 5. 室温下放置16h或65℃放置1h, 可加快基因组DNA沉淀的溶解。
第九页，共18页
核酸的鉴定与分析
紫外分光光度法可用于确定核酸的浓度及纯度。
000rpm×10min。 5. 吸取上层水相350μl置一新Ep管中，加纯异丙醇200μl, 混
匀。 6. 室温放置15min, 离心14 000rpm×12min。
第六页，共18页
STEP 5
Water phase (DNA)
proteins precipitate
chloroform /isoamyl alcohol (lipids)
Water phase(DNA)
第七页，共18页
7. 小心弃去上清，再加37%异丙醇（或70%乙醇）1 ml(勿 摇动)，离心14000rpm×12min.
8. 小心弃异丙醇（或乙醇），于室温敞口放置直至可见的 痕量液体挥发殆尽。
9. 加50μl TE缓冲液溶解DNA, 以琼脂糖凝胶电泳鉴定或20℃保存。
核酸的分离纯化和鉴定
第一页，共18页
核酸包括DNA、RNA，在细胞中都与蛋白质结合 而存在。
分离纯化核酸总的原则 :
1、保证一级结构的完整性，完整的一级结构是研究核酸
结构和功能的基础；
减少化学、物理、生物因素对核酸的降解： 避免过酸、过碱对磷酸二酯键的破坏；
避免机械剪切力以及高温煮沸； 抑制DNase或RNase的活性； 2、排除蛋白质、脂类、糖类等分子的污染。
思考题
1、分离核酸的基本原则包括哪两方面？ 2、试比较用EB进行DNA凝胶电泳前（加在上样
第九页，共18页
核酸的鉴定与分析
紫外分光光度法可用于确定核酸的浓度及纯度。
000rpm×10min。 5. 吸取上层水相350μl置一新Ep管中，加纯异丙醇200μl, 混
匀。 6. 室温放置15min, 离心14 000rpm×12min。
第六页，共18页
STEP 5
Water phase (DNA)
proteins precipitate
chloroform /isoamyl alcohol (lipids)
Water phase(DNA)
第七页，共18页
7. 小心弃去上清，再加37%异丙醇（或70%乙醇）1 ml(勿 摇动)，离心14000rpm×12min.
8. 小心弃异丙醇（或乙醇），于室温敞口放置直至可见的 痕量液体挥发殆尽。
9. 加50μl TE缓冲液溶解DNA, 以琼脂糖凝胶电泳鉴定或20℃保存。
核酸的分离纯化和鉴定
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核酸包括DNA、RNA，在细胞中都与蛋白质结合 而存在。
分离纯化核酸总的原则 :
1、保证一级结构的完整性，完整的一级结构是研究核酸
结构和功能的基础；
减少化学、物理、生物因素对核酸的降解： 避免过酸、过碱对磷酸二酯键的破坏；
避免机械剪切力以及高温煮沸； 抑制DNase或RNase的活性； 2、排除蛋白质、脂类、糖类等分子的污染。
思考题
1、分离核酸的基本原则包括哪两方面？ 2、试比较用EB进行DNA凝胶电泳前（加在上样
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பைடு நூலகம்
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2、要冒一次险!整个生命就是一场冒险。走得最远的人，常是愿意 去做，并愿意去冒险的人。“稳妥”之船，从未能从岸边走远。-戴尔．卡耐基。
梦 境
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