水通道蛋白综述与展望

水通道蛋白水通道-从原子结构到临床医学生物膜的透水性在生理学上是一个长期存在的问题，但负责此类蛋白质的蛋白质仍然未知，直到发现水通道蛋白1（AQP1）水通道蛋白。

AQP1由渗透梯度驱动的水选择性渗透。

人类AQP1的原子结构最近被定义。

四聚体的每个亚基含有允许水分子单文件通过但中断氢键通过质子所需的单独水孔。

已经鉴定了至少10种哺乳动物水通道蛋白，并且它们被水（水通道蛋白）或水加甘油（水甘油聚糖）选择性渗透。

表达位点与临床表型密切相关，从先天性白内障到肾源性尿崩症。

在植物，微生物，无脊椎动物和脊椎动物中发现超过200个水通道蛋白家族成员，并且它们对这些生物体的生理学的重要性正在被揭开。

在20世纪20年代发现脂质双层提供了当沐浴在较低或较高pH或含有毒性浓度的Ca2 +或其他溶质的细胞外液中时细胞如何维持其最佳细胞内环境的解释。

从1950年代开始发现离子通道，交换剂和共转运体为溶质的跨膜运动提供了分子解释。

然而，长期以来，假定水的输送是由于通过脂质双层的简单扩散。

来自具有高膜渗透性的多个实验系统的观察，例如两栖膀胱和哺乳动物红细胞，表明通过脂质双层的扩散不是水跨越膜的唯一途径。

虽然提出了各种解释，但直到10年前发现AQP1才能知道分子水 - 特异性转运蛋白（Preston 等，1999）。

现在人们普遍同意扩散和通道介导的水分运动都存在。

通过所有生物膜以相对较低的速度发生扩散。

水通道蛋白水通道发现于上皮细胞的一部分10至100倍的水渗透能力。

值得注意的是，水通道蛋白水通道的选择性非常高，甚至质子（H3O +）被排斥。

在大多数组织中，扩散是双向的，因为水进入细胞并从细胞释放，而水通道蛋白介导的体内水流则由渗透或液压梯度引导。

扩散的化学抑制剂是未知的，扩散发生在高Ea（Arrhenius活化能）。

相比之下，大多数哺乳动物水通道蛋白受汞的抑制，Ea等同于大量溶液中水的扩散（〜5 kcal mol_1）。

水通道蛋白的发现说明了偶发性在生物学研究中的重要性，并且引起了上游流体运输过程中水如何穿过生物膜的范式的完全转变。

这个话题对正常生理学以及影响人类的多种临床疾病的病理生理学非常重要。

水通道蛋白在几乎每一种生物体中被鉴定出来，包括高等哺乳动物，其他脊椎动物，无脊椎动物，植物，真细菌，原细菌和其他微生物，表明这种新认可的蛋白质家族参与了整个自然界的不同生物过程。

一、发现AQP1红细胞Rh血型抗原不知道参与水运（Heitman＆Agre，2000），但是Rh的研究导致了水通道蛋白的偶然发现。

用于纯化Rh多肽的生物化学技术产生污染的28kDa多肽（Agre等，1987）。

基于洗涤剂中的28kDa蛋白质的相对不溶性，N-月桂酰肌氨酸，开发了产生大量蛋白质的简单纯化系统。

红细胞和肾近端小管 - 具有最高已知水渗透性的组织中，28kDa蛋白质显示出非常丰富（Denker等，1988）。

此外，28kDa蛋白质表现为四聚体整合膜蛋白 - 通常是膜通道蛋白的特征（Smith＆Agre，1991）。

使用28kDa多肽的N-末端序列克隆编码来自红细菌文库的269个氨基酸多肽的cDNA（Preston＆Agre，1991）。

遗传数据库的分析显示了多种物种的同源物，包括微生物和植物，但其分子功能是未知的。

“CHIP28”暂时用于描述这种蛋白质为“28kDa的通道样整合蛋白”。

二、AQP1的结构AQP1的结构非常有力，因为它具有独特的渗透特性。

推导的序列揭示了以前未描述的拓扑，两个串联重复每个由具有两个高度保守的环（B和E）的跨膜结构域形成，包含签名基序，天冬酰胺 - 脯氨酸 - 丙氨酸（NPA）。

奇怪的是，重复序列被预测为相对于彼此以180度取向（图2，顶部）。

通过在非洲爪蟾卵母细胞中表达AQP1的位点定向插入突变体来证实这种独特的对称性（Preston等人，19994a）。

在环路E中，在接近NPA基序的Cys-189处证明了汞抑制的位点。

用较大分子量的残基替换NPA侧翼残基的突变体没有表现出水渗透性，表明环E形成水孔的一部分（Preston等，1993）。

当环B（Ala-73）中的NPA基序之前的相应位置被半胱氨酸取代时，水分渗透性也受到汞的抑制。

当NPA基序侧翼的残基被更大的残基取代时，观察到该环B也表现为似乎形成水孔的一部分。

这些研究一起导致了AQP1亚基各自含有部分由“沙漏”形成的内部水孔（图2，底部）的建议，其由从相反的双层折叠成双层的环B和E产生的结构膜的两侧在双层传单之间的中间接触（Jung et al。

，1994b）。

1992年，瑞士巴塞尔大学Biozentrum的Andreas Engel和同事们开始了长期合作，随后与日本京都大学的Yoshinori Fujiyoshi及其同事一起解决了AQP1蛋白的结构。

使用通过用N-月桂酰肌氨酸预萃取膜囊泡的纯化方法，可以将高达5mg的AQP1纯化成来自一品脱人血液的同质性（Smith＆Agre，1991）。

当通过透析将高浓度的蛋白质小心地重构成脂质双层体时，形成均匀的晶格（“膜晶体”），其中蛋白质保留其100％的水输送活性（Walz等人1994b）。

蛋白质的四聚体组织在低分辨率下明确确定，并且其通过3D电子显微镜测定其在膜中的组织（Walz等人，1994a）。

用高达60度的倾斜研磨的精细膜晶体，由我们在京都的同事开发的技术先进的电子显微镜，以3.8Å分辨率产生电子密度图。

使用由重组体研究建立的约束，使用AQP1的主序列进行建模产生了AQP1结构的第一个原子模型（Murata 等人，2000）。

另外一种基于电子显微镜的模型以不同的主链方向以相同的螺旋排列出版（Ren et al.2001）。

与其中四个亚基围绕中心孔的离子通道不同，AQP1作为每个亚单位的四聚体存在含有自己的孔。

在双层传单之间的中间孔的孔径变窄至约3埃。

在这一点上，由跨膜结构域TM1,2,4和5形成的壁是疏水的，而NPA图案中的两个高度保守的Asn-76和Asn-192被并置，如在沙漏模型中预测的那样，提供极性用于氢键的残基（图3）。

此外，成孔环B和E的末端部分均含有短的α-螺旋，其在膜的中心产生部分正电荷。

这种结构刚好在由残基Phe-56，His-180，Cys-189（汞抑制位点）和Arg-195所包围的2.8A的缩合物之下，Arg-195在精制的AQP1结构中是公认的（de Groot等人2001）。

Arg-195在大水通道蛋白基因家族的所有成员中几乎完全保守，并且在通道的最窄部分提供功能上重要的正电荷。

His-180在中性pH下不带电，但在较低的pH下变质子化，提供第二个正电荷。

Arg-195，His-180和来自孔螺旋的正偶极子在水渗透期间提供抵抗质子（水合氢离子）通过的强排斥电荷。

AQP1的这些结构特征很好地解释了排除较大或带电溶质的最小抗渗透能力。

特别地，阻断质子传递的能力澄清了肾脏如何每天从肾小球滤液中重吸收数百升的水，同时排泄酸。

重要的是，分辨率为2.2的大肠杆菌同源物GlpF的三维晶体的X射线衍射分析（Fu等人2000）允许对AQP1结构进行改进（de Groot等人，2001），其实质上与模型由2.2 A分辨率的牛AQP1的三维晶体确定（Sui et al。

2001）。

实时分子动力学模拟表明，在通过NPA图案的并置Asn-76和Asn-192（de Groot＆Grubmuller，2001）期间，水的旋转发生。

分子动力学研究也由其他研究者进行（Kong＆Ma，2001; Tajkhorshid et al.2002）。

结构研究和分子动力学模拟对膜水输送过程带来了非常高的原子认知水平。

生物医学研究领域的调查人员现在认识到，水通道蛋白提供了水通过生物膜快速和选择性运动的机制。

三、AQP1的分布1991年11月，丹麦奥胡斯大学的Soren Nielsen及其团队长期合作。

我们的目标是使用光学显微镜和免疫电子显微镜在细胞和亚细胞水平的肾脏和其他组织中定位AQP1（和随后的其他水通道蛋白）。

这些研究为AQP1的生理和病理作用提供了明确的证据，并且在其他部位牢固地预测了同源蛋白的存在。

自20世纪30年代荷马史密斯早期的职业生涯以来，肾脏比其他器官吸引了运输生理学家的兴趣。

使用对AQP1蛋白的C末端特异性的亲和纯化抗体和N末端的第二抗体，将AQP1的位置精确地定位在近端小管的顶端刷边界和基底外侧膜（图4）和下降薄来自大鼠肾脏的Henle四肢（Nielsen等，1993c）和人（Maunsbach等，1997）。

此外，蛋白质在下垂血管直肠中被鉴定（Pallone等人，1997），其定义了将大量水从管腔转移到间质，然后进入血管空间的途径。

AQP1蛋白质清楚显示仅存在于这些部位的质膜中，而不存在于细胞内部位。

因此，建立了这样的范例，即通过AQP1在顶端和基底外侧血浆膜中将水输送穿过近端小管上皮和下肢细胞，其驱动力由通过特异性转运蛋白的溶质的矢量运动产生的小立场渗透梯度提供在这些膜（Nielsen＆Agre，1995）..在其他组织中也证实了AQP1蛋白，其中包括脉络丛（脑脊髓液），前房室内的非色素上皮（房水），胆管细胞（胆汁）和毛细血管内皮等重要分泌作用，包括肺支气管循环（Nielsen等，1993b）。

重要的是发现肾脏收集管道完全缺乏AQP1，可以很好的预测多种水通道蛋白质的需要。

同样，唾液腺上皮缺乏AQP1蛋白，预测其他同源物的存在。

四、AQP1空人鉴定完全缺乏AQP1蛋白质的人们证明了这种蛋白质对人体生理学的重要性。

通过荧光原位杂交将AQP1基因座定位于人染色体7p14（Moon等，1993）。

Colton（Co）血型抗原以前已经连接到人类7号染色体的短臂（Zelinski等，1990）。

来自具有确定的Co血型的个体的DNA的抗Co免疫沉淀研究和测序表明，Co抗原是连接第一和第二双层跨越结构域的环A的胞外位点的AQP1的多态性的结果 - Coa具有Ala -45，而较不常见的科巴Val-45（史密斯等人，1999）。

据了解，缺乏Coa和Cob的人非常罕见，因为英国布里斯托尔的国际血型登记处只列出了6名亲属。

Co阴性的先证者是在怀孕期间变得敏感的妇女，导致它们具有循环的抗Co抗体。

这些抗体使得这些患者不可能接受异源输血，因此每个Co无效个体都有在本地血库冷藏保存的血液单位。

我们从三个不同亲属的Co无效个体获得血液，尿液和DNA，发现红细胞和尿沉渣中缺乏AQP1蛋白。

发现每个亲属中的先证者对于AQP1基因（因此“AQP1 null”）的不同破坏 - 外显子1的缺失，外显子1中的位移或第一跨膜结构域末端的不稳定突变都是纯合的Preston等人1994b）。